專利名稱：棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在棉花中表達(dá)的抗氧化因子蛋白編碼序列及其核酸序列。
背景技術(shù)：
植物在生長過程中受到各種各樣環(huán)境脅迫(如極端溫度、水分脅迫、輻射、臭氧及二氧化硫和病原菌感染等)的影響，體內(nèi)產(chǎn)生了大量的活性氧(Reactive OxygenSpecies)，如超氧離子(O2*-)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)。盡管氧對(duì)植物的生存是必需的，但它同時(shí)也使其面臨氧化逆境(oxidative stress)。活性氧(ROS)使膜流動(dòng)性降低、膜透性增加；抑制酶活性甚至引起蛋白質(zhì)功能的喪失；且ROS對(duì)核酸的攻擊可造成細(xì)胞死亡或異常蛋白如熱激蛋白的形成。植物在進(jìn)化過程中為保護(hù)自身免受ROS的傷害形成了內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)，由非酶抗氧化劑和抗氧化酶類組成，如生物堿、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶等。盡管植物體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)，一些高度氧化的副產(chǎn)物如過氧化氫(H2O2)、氫氧根離子(OH-)和過氧化陰離子(O2-)，容易氧化某些氨基酸殘基，特別是甲硫氨酸(Met)可以被氧化為甲硫氨酸亞砜(Met(O))，而當(dāng)一些蛋白質(zhì)中存在Met(O)則會(huì)導(dǎo)致其生物學(xué)活性的降低或喪失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氧化形成的Met(O)可以被肽-甲硫氨酸亞砜還原酶(peptide methioninesulfoxide reductase，MsrA)催化逆轉(zhuǎn)而使蛋白重新恢復(fù)活性。本發(fā)明中，我們首次從棉花(Gossypium barbadense)中克隆到甲硫氨酸亞砜還原酶(MsrA)的基因。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)雜志《Plant Physiology(植物生理)》在2000，123255-263發(fā)表了文章“Differential regulation of plastidial and cytosolicisoforms of peptide methionine sulfoxide reductase in Arabidopsis(擬南芥甲硫氨酸亞砜還原酶質(zhì)體和胞體的差異調(diào)控)”，該文獻(xiàn)雖然對(duì)甲硫氨酸亞砜還原酶MsrA在茉莉酸、高鹽、溫度和病原菌脅迫處理下的表達(dá)做了充分肯定，但截止目前的報(bào)道顯示該基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的茉莉酸、高鹽、溫度和病原菌脅迫方面的效果沒有明顯提高，此外尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中所提及的在棉花中克隆甲硫氨酸亞砜還原酶的蛋白序列及其核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列，使其在植物細(xì)胞抗氧化上具有明顯的作用，能夠明顯提高植物細(xì)胞對(duì)氧化物的抗性，降低氧化脅迫對(duì)植物的損害。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列雜交。所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的棉花抗氧化類相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、低溫、黃萎病處理下均能發(fā)揮作用，而這些逆境脅迫均可引起植物體內(nèi)ROS的增加。
本發(fā)明的載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“棉花抗氧化蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有棉花蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第19-786位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第19-786位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第19-786位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下(85％以上一致性)與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的棉花相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“棉花抗氧化蛋白或多肽”指具有棉花蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然棉花相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括棉花MsrA蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的棉花多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與棉花相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用棉花多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“棉花保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表279％identity in 788nt overlapQuery511 cgccaggggaatgatgtggggacacagtacagatctgggatttacttttacagcccagag 570||||||||||||||||||||||| ||||||||| || || ||||| |||| |||Sbjct526 cgccaggggaatgatgtggggacgaggtacagatcaggcatatacttctacacagacgag 585Query571 caggagaaggcagcagtggaatccatggaaaaacagcagaaactcctcaacagaaagatt 630|| ||||||| ||| ||| | ||||| ||||||||||| || | ||||||||||||Sbjct586 caagagaagttagctcgtgaagcaatggagaaacagcagaagatcttgaacaggaagatt 645Query631 gttactgaaattctgccggccaggaaattctatagagcagaggaatatcaccagcagtac 690|| ||||| || || || |||| ||||||||| ||||| || | || ||||||||||||Sbjct646 gtgactgagatacttcctgccacgaaattctacagagcggaaaactaccaccagcagtac 705Query691 cttgcaaagggaggtcgttttggttgtaaacaatctgctgagaaaggatgcaatgatcct 750
|| ||||| || ||||| | ||| | ||||||||||||||||| ||||| |||||Sbjct706 ctggcaaaaggtggtcgcatgggtctcagtcaatctgctgagaaaggttgcaacgatcca 765Query751 atccgatgctatggctaa 768||||||||||||||||||Sbjct766 atccgatgctatggctaa 783Query棉花MsrA的核酸序列Sbjct油菜MsrA的核酸序列(Z48619)表2為本發(fā)明的棉花MsrA蛋白與油菜MsrA蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表372％identity in 255aa overlap，83％similarity in 255aa overlapQuery46 VAKPFFSFSQASLTLS--APISLPFPQTRRSISLHTRPMN-ILKSLGFGANNKPTASMDN 216++KP S S+A+L+LS A + PFP+T RSIS++ PMN + LGFG+ +P + +Sbjct16 LSKPLQSLSKAALSLSKRAKPTSPFPKTARSISVYKSPMNNLFTRLGFGSRPQPDPAA-S 74Query217 CAIAQGPEDDVPPPGQQFAQFGAGCFWGVELAFQRVSGITKTEVGYSQGFMHNPSYEDVC 396AIAQGP+DDVP PGQQFAQFGAGCFWG ELA+QRV G+TKTEVGYS GF+ NPSYEDVCSbjct75 AAIAQGPDDDVPSPGQQFAQFGAGCFWGAELAYQRVPGVTKTEVGYSHGFVDNPSYEDVC 134Query397 SGTTNHSEVVRVQYDPNECSYDTLLHVFWARHDPTTLNRQGNDVGTQYRSGIYFYSPEQE 576S TT H+E+VRVQYDP E S+++LL VFW RHDPTTLNRQGNDVGT+YRSGIYFY+ EQESbjct135 SETTGHNEIVRVQYDPKEVSFESLLDVFWKRHDPTTLNRQGNDVGTRYRSGIYFYTDEQE 194Query577 KAAVESMEKQQKLLNRKIVTEILPARKFYRAEEYHQQYLAKGGRFGCKQSAEKGCNDPIR 756K A E+MEKQQK+LNRKIVTEILPA KFYRAE YHQQYLAKGGR G QSAEKGCNDPIRSbjct195 KLAREAMEKQQKILNRKIVTEILPATKFYRAENYHQQYLAKGGRMGLSQSAEKGCNDPIR 254Query757 CYG 765CYGSbjct255 CYG 257Query棉花MsrA的氨基酸序列Sbjct油菜MsrA的氨基酸序列(CAA62760)
表3為本發(fā)明的棉花蛋白與油菜的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明棉花蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然棉花相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的棉花MsrA多肽時(shí)，可以將棉花MsrA編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成棉花MsrA蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析棉花基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析棉花的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明提供的可用作探針的核酸分子，該分子通常具有棉花核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼棉花相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明的檢測樣品中是否存在棉花相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于棉花相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的棉花核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選棉花相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與棉花相關(guān)基因相關(guān)的棉花cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選棉花cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對(duì)棉花相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自棉花的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與棉花相關(guān)相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的棉花相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，利用本發(fā)明的棉花蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與棉花相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明在植物細(xì)胞抗氧化上具有明顯的作用，能夠明顯提高植物細(xì)胞對(duì)氧化物的抗性，降低氧化脅迫對(duì)植物的損害。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)具體數(shù)據(jù)，以具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1棉花MsrA基因的克隆1.組織分離(isolation)將海島棉棉花種子置于37℃發(fā)芽24小時(shí)，然后播種于溫室中，待棉花葉片為2-3片時(shí)，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(CTAB法)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)油菜MsrA基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[MA001(SEQ ID NO.1)+MA002(SEQ ID NO.2)]得到484bp的片段，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(GeneBank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如油菜(Brassica napus)BnMsrA基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)MsrA基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+MA301(5’-CTATCCGATGCTATGGCTAA-3’)]得到MA3’(293bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(GeneBank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如油菜(Brassica napus)BnMsrA基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)與甲硫氨酸亞砜還原酶相關(guān)基因。
(3)5’-RACE第一輪PCR[AAP+MA501(5’-AGGAGTTTCTGCTGTTTTTC-3’)]第二輪PCR[(AUAP+MA502(5’-TTCCACTGCTGCCTTCTCCT-3’))得到MA5’(約605bp)(過程同(1))將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從棉花中新得到的基因確為一個(gè)與油菜MsrA相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的棉花MsrA蛋白的全長編碼序列(SEQID NO.3)。
實(shí)施例2棉花MsrA基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的棉花MsrA全長cDNA的長度為987bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于19-786位核苷酸(612個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出棉花MsrA的氨基酸序列，共255個(gè)氨基酸殘基，分子量為28403.15道爾頓，等電點(diǎn)(pI)為8.42。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將棉花MsrA的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與油菜基因BnMsrA(Z48619)在核苷酸水平上具有79％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與油菜基因BnMsrA(CAA62760)也有72％的相同性(附表3)。由此可見，棉花基因MsrA與油菜基因MsrA無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。油菜基因BnMsrA(CAA62760)已經(jīng)被證明在氧化脅迫條件下明顯增強(qiáng)表達(dá)，并發(fā)揮著重要的作用，可以認(rèn)為棉花基因MsrA在抗氧化方面也具有相似的作用。
實(shí)施例3棉花基因MsrA蛋白或多肽在煙草中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化性鑒定含目的基因(棉花基因MsrA)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)棉花MsrA基因的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將棉花MsrA基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含棉花基因MsrA的轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗氧化性鑒定鑒于編碼MsrA，如油菜的MsrA基因已被證明在抗氧化方面發(fā)揮作用，而棉花基因MsrA轉(zhuǎn)錄水平與油菜的MsrA具有較高的同源性，可進(jìn)一步對(duì)含棉花基因MsrA的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行抗氧化鑒定。用300mM氯化鈉和104-105spores/ml黃萎病菌處理轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株的種子(1小時(shí)、3小時(shí)、7小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))后研究MsrA基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況以及各種處理對(duì)植株的生長情況。Northern blot分析結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植株MsrA轉(zhuǎn)錄水平在鹽和黃萎病菌處理后其表達(dá)量顯著增強(qiáng)，而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株雖表達(dá)量提高，但明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。此外非轉(zhuǎn)基因植株生長緩慢，最后在鹽和黃萎病菌處理下枯萎而死，轉(zhuǎn)基因植物依然能正常生長，只是比未經(jīng)處理的植株生長稍慢。在抗低溫、抗干旱試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株也明顯表現(xiàn)出比對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因植株)生長正常。這證明棉花基因MsrA比油菜基因MsrA具有更有效的和更廣泛的抗逆境的功能，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗氧化的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
實(shí)施例4棉花基因MsrA在棉花中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從棉花葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用BamH、EcoRI和KpnI酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將MsrA基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時(shí))。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)一至五條不同的雜交條帶，說明MsrA基因在棉花中是低拷貝基因。
實(shí)施例5棉花MsrA基因在病原菌和鹽脅迫條件下的不同時(shí)間處理的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將生長了3-4片葉的棉花幼苗經(jīng)100mMNaCl和104-105spores/ml黃萎病菌分別處理1小時(shí)、3小時(shí)、7小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，然后用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時(shí)。
5.膜上雜交信號(hào)的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabellingmodule標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時(shí)。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明隨著病原菌和鹽處理時(shí)間的延長，MsrA的表達(dá)逐步增強(qiáng)，說明MsrA是逆境信號(hào)如病原菌和鹽誘導(dǎo)表達(dá)的，在棉花抗氧化脅迫中扮演重要的角色。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸
(iii).序列描述SEQ ID NO.1CAG GGG AAT GAT GTG GGG AC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2TTA GCC ATA GCA TCG GAT(A/T)G(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度1059bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3
<110>上海交通大學(xué)<120>棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1059<212>DNA<213>棉花(Gossypium barbadense)<220>
<221>CDS<222>(19)..(786)<223>
<400>1tctcaaatac ccttaaaa atg ctt cga agc ctt gcg ctt act act tct tcc51Met Leu Arg Ser Leu Ala Leu Thr Thr Ser Ser1 5 10tct tct tct ctg gtc gct aaa cct ttt ttt tca ttc tcc caa gct tcc99Ser Ser Ser Leu Val Ala Lys Pro Phe Phe Ser Phe Ser Gln Ala Ser15 20 25ctc act ctt tct gct cct atc tct ctc cct ttc cct caa acc aga cga147
Leu Thr Leu Ser Ala Pro Ile Ser Leu Pro Phe Pro Gln Thr Arg Arg30 35 40tcc att tcc ctt cac aca cgc ccc atg aac atc ctc aaa agc ctc ggc 195Ser Ile Ser Leu His Thr Arg Pro Met Asn Ile Leu Lys Ser Leu Gly45 50 55ttt ggg gcc aac aac aag cca acc gct tca atg gat aat tgc gcc atc 243Phe Gly Ala Asn Asn Lys Pro Thr Ala Ser Met Asp Asn Cys Ala Ile60 65 70 75gct cag ggt cct gaa gac gac gtc ccg cct cct ggt caa cag ttt gct 291Ala Gln Gly Pro Glu Asp Asp Val Pro Pro Pro Gly Gln Gln Phe Ala80 85 90cag ttc ggt gcg ggc tgc ttt tgg ggc gtt gaa ctg gct ttc cag aga 339Gln Phe Gly Ala Gly Cys Phe Trp Gly Val Glu Leu Ala Phe Gln Arg95 100 105gtt tcg ggg atc acc aaa act gaa gtt ggg tat tcc caa gga ttc atg 387Val Ser Gly Ile Thr Lys Thr Glu Val Gly Tyr Ser Gln Gly Phe Met110 115 120cat aat ccg agt tat gaa gac gtg tgt tcg ggg act acc aac cac agt 435His Asn Pro Ser Tyr Glu Asp Val Cys Ser Gly Thr Thr Asn His Ser125 130 135gaa gtc gtg agg gtt cag tat gac cct aat gag tgt agc tat gac act 483Glu Val Val Arg Val Gln Tyr Asp Pro Asn Glu Cys Ser Tyr Asp Thr
140 145 150 155ttg ctt cat gtc ttt tgg gct cgc cat gat cct act acc ctc aac cgc 531Leu Leu His Val Phe Trp Ala Arg His Asp Pro Thr Thr Leu Asn Arg160 165 170cag ggg aat gat gtg ggg aca cag tac aga tct ggg att tac ttt tac 579Gln Gly Asn Asp Val Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Gly Ile Tyr Phe Tyr175 180 185agc cca gag cag gag aag gca gca gtg gaa tcc atg gaa aaa cag cag 627Ser Pro Glu Gln Glu Lys Ala Ala Val Glu Ser Met Glu Lys Gln Gln190 195 200aaa ctc ctc aac aga aag att gtt act gaa att ctg ccg gcc agg aaa 675Lys Leu Leu Asn Arg Lys Ile Val Thr Glu Ile Leu Pro Ala Arg Lys205 210 215ttc tat aga gca gag gaa tat cac cag cag tac ctt gca aag gga ggt 723Phe Tyr Arg Ala Glu Glu Tyr His Gln Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Gly220 225 230 235cgt ttt ggt tgt aaa caa tct gct gag aaa gga tgc aat gat cct atc 771Arg Phe Gly Cys Lys Gln Ser Ala Glu Lys Gly Cys Asn Asp Pro Ile240 245 250cga tgc tat ggc taa gttgccactt tttctgtatg cacttctgct tttgtctatg 826Arg Cys Tyr Gly255
gaattttaat gccttgtgtt atctatgtag ttactgaagg tggtggactt gtaattattc886ataattccaa ggcagaccga tatctatgtt ttgtatatct acagtgatag gttaggacat946gatgtttgaa ctttcaaata tggcgatcat gtattaataa agaaatatta catgccttta 1006tgggggagga tgtttccttt cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1059<210>2<211>255<212>PRT<213>棉花(Gossypium barbadense)<400>2Met Leu Arg Ser Leu Ala Leu Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val1 5 10 15Ala Lys Pro Phe Phe Ser Phe Ser Gln Ala Ser Leu Thr Leu Ser Ala20 25 30Pro Ile Ser Leu Pro Phe Pro Gln Thr Arg Arg Ser Ile Ser Leu His35 40 45Thr Arg Pro Met Asn Ile Leu Lys Ser Leu Gly Phe Gly Ala Asn Asn
50 55 60Lys Pro Thr Ala Ser Met Asp Asn Cys Ala Ile Ala Gln Gly Pro Glu65 70 75 80Asp Asp Val Pro Pro Pro Gly Gln Gln Phe Ala Gln Phe Gly Ala Gly85 90 95Cys Phe Trp Gly Val Glu Leu Ala Phe Gln Arg Val Ser Gly Ile Thr100 105 110Lys Thr Glu Val Gly Tyr Ser Gln Gly Phe Met His Asn Pro Ser Tyr115 120 125Glu Asp Val Cys Ser Gly Thr Thr Asn His Ser Glu Val Val Arg Val130 135 140Gln Tyr Asp Pro Asn Glu Cys Ser Tyr Asp Thr Leu Leu His Val Phe145 150 155 160Trp Ala Arg His Asp Pro Thr Thr Leu Asn Arg Gln Gly Asn Asp Val165 170 175
Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Gly Ile Tyr Phe Tyr Ser Pro Glu Gln Glu180 185 190Lys Ala Ala Val Glu Ser Met Glu Lys Gln Gln Lys Leu Leu Asn Arg195 200 205Lys Ile Val Thr Glu Ile Leu Pro Ala Arg Lys Phe Tyr Arg Ala Glu210 215 220Glu Tyr His Gln Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Gly Arg Phe Gly Cys Lys225 230 235 240Gln Ser Ala Glu Lys Gly Cys Asn Asp Pro Ile Arg Cys Tyr Gly245 250 25權(quán)利要求
1.一種棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列雜交，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第19-786位的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列，其特征是，所分離出的棉花抗氧化類相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、低溫、黃萎病處理下均能發(fā)揮作用，而這些逆境脅迫均可引起植物體內(nèi)ROS的增加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列，其特征是，它的載體，包含上述的DNA分子，一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列，其特征是，所述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白編碼序列，涉及生物和基因工程技術(shù)領(lǐng)域。所分離出的DNA分子包括編碼具有棉花甲硫氨酸亞砜還原酶蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19－786位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第19－786位的核苷酸序列雜交，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第19－786位的核苷酸序列。本發(fā)明在植物抗氧化方面具有明顯的作用，具有很大的應(yīng)用價(jià)值，能夠明顯減少農(nóng)作物在干旱、鹽堿、低溫和病菌感染等環(huán)境脅迫條件下生物產(chǎn)量的損失。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1563386SQ20041001701
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者趙靜雅, 左開井, 孫曉芬, 唐克軒 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)