專利名稱：新型腈水合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型腈水合酶及編碼其的基因、含有該基因的質(zhì)粒、經(jīng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株、及用所述細(xì)胞株生產(chǎn)腈水合酶的方法、以及利用培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞處理物從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的方法。
另外，本發(fā)明還涉及一種改變具有腈水合酶活性的酶的性質(zhì)的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種改變了性質(zhì)的酶及編碼其的基因、含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株、用所述細(xì)胞株生產(chǎn)腈水合酶的方法，以及利用培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞處理物從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的方法。本發(fā)明可有效用于利用生物催化劑的物質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域中。
背景技術(shù)：
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了作為具有腈水合活性的酶的腈水合酶，該酶能夠通過(guò)水合作用將各種化合物的腈基轉(zhuǎn)換成酰胺基，并且公開了多種生產(chǎn)該酶的微生物株。為了在工業(yè)上利用腈水合酶從腈化合物制造酰胺化合物，降低該酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤顯重要。具體而言，必須提高每單位重量酶制備物中該酶的含量。因此為了利用所述酶的基因通過(guò)基因工程學(xué)方法大量表達(dá)所述酶，嘗試對(duì)所述酶的基因進(jìn)行克隆的方法。
作為具有腈水合酶活性的微生物，有紫紅紅球菌J-1株(根據(jù)布達(dá)佩斯條約，保藏在茨城縣筑波市東1-1-1號(hào)中央第6獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號(hào)為FERMBP-1478)、嗜熱假諾卡氏菌(本菌株保藏在理化學(xué)研究所微生物系統(tǒng)保存處(埼玉縣和光市廣澤2-1)，保藏編號(hào)為JCM3095，任何人都可經(jīng)申請(qǐng)獲得；另外，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號(hào)為FERM BP-7379。)(參照專利文獻(xiàn)1及3)。
另外，從上述菌株中分離出了腈水合酶，已經(jīng)確認(rèn)了該酶一般以稱為α亞單位及β亞單位的2種多肽為構(gòu)成要素。并且，從上述菌株中分離出了腈水合酶基因，確定了其氨基酸序列和堿基序列。進(jìn)而，制備了可使上述腈水合酶在轉(zhuǎn)化子內(nèi)表達(dá)的質(zhì)粒及經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株(例如，TG1/pNHJ10H及MT-10822根據(jù)布達(dá)佩斯條約，前者保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號(hào)為FERM BP-2777；后者于1996年2月7日保藏在茨城縣筑波市東1-1-1號(hào)中央第6獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號(hào)為FERM BP-5785)。除此之外，能夠經(jīng)上述細(xì)胞株生產(chǎn)腈水合酶、以及通過(guò)使所述細(xì)胞株或者由其制得的腈水合酶與腈化合物接觸以制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物(參照專利文獻(xiàn)2、4，非專利文獻(xiàn)1)。
另外，也進(jìn)行了分析腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)的嘗試，分析結(jié)果以PDB編號(hào)1AHJ、2AHJ、1IRE被公開。已知所述酶的基本結(jié)構(gòu)單位為α亞單位及β亞單位結(jié)合而成的2聚體，該2聚體進(jìn)一步結(jié)合形成4聚體、8聚體、12聚體(根據(jù)來(lái)源的生物種而不同)而發(fā)揮活性。另外，形成活性中心的區(qū)域、結(jié)構(gòu)也已明確，活性中心并非表露于與反應(yīng)溶劑直接接觸的酶外側(cè)的位置，而是包埋于酶的內(nèi)部。也清楚發(fā)揮活性所必須的金屬原子(鈷原子或者鐵原子根據(jù)來(lái)源的生物種而不同)在活性中心的配位形態(tài)，并已知作為伴隨金屬原子配位發(fā)生的現(xiàn)象，形成活性中心區(qū)域的氨基酸序列中半胱氨酸殘基在翻譯后發(fā)生氧化。具體而言，α亞單位的氨基酸序列中序列X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示絲氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸)表示的區(qū)域?yàn)闃?gòu)成金屬原子在活性中心進(jìn)行配位的區(qū)域(參照非專利文獻(xiàn)2～4)。
但是，還沒(méi)有任何發(fā)明公開關(guān)于在不影響腈水合酶自身活性的情況下，改變其活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)的具體方法。特別是著眼于腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)、通過(guò)改變結(jié)構(gòu)而改變上述性質(zhì)的方法還未作任何嘗試。
另外，專利文獻(xiàn)5中公開了使編碼腈水合酶的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)而生產(chǎn)具有酶活性的腈水合酶時(shí)，存在一種參與激活所述酶的蛋白質(zhì)。
專利文獻(xiàn)1特開平2-470號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開平4-211379號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3特開平8-56684號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4特開平9-275978號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5特開平11-253168號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1Kobayashi M，Nishiyama M，Nagasawa T，Horinouchi S，Beppu T，Yamada H.Cloning，nucleotide sequence and expression inEscherichia coli of two cobalt-containing nitrile hydratase genes fromRhodococcus rhodochrous J1.Biochim Biophys Acta.1991 Dec 2；1129(1)23-33.
非專利文獻(xiàn)2Huang W，Jia J，Cummings J，Nelson M，Schneider G，Lindqvist Y.Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centrein a novel fold.Structure.1997May 15；5(5)691-9.
非專利文獻(xiàn)3Nagashima S，Nakasako M，Dohmae N，Tsujimura M，Takio K，Odaka M，Yohda M，Kamiya N，Endo I.Novel non-heme ironcenter of nitrile hydratase with a claw setting of oxygen atoms.Nat StructBiol.1998 May；5(5)347-51.
非專利文獻(xiàn)4Miyanaga，A.，F(xiàn)ushinobu，S.，Ito，K.，and Wakagi，T.Crystal structure of cobalt-containing nitrile hydratase.Biochem.Biochem Biophys Res Commun.2001 Nov 16；288(5)1169-74.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有新型置換突變位點(diǎn)但功能無(wú)實(shí)質(zhì)變化的腈水合酶的氨基酸序列和該基因的堿基序列，還提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株、及用所述細(xì)胞株生產(chǎn)所述酶的方法，以及利用培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞處理物從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的方法。
本發(fā)明的其它目的在于提供一種在不損害腈水合酶自身活性的情況下，改變其活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)中的一種或一種以上的具體方法。具體而言，提供一種通過(guò)在腈水合酶基因中引入導(dǎo)致腈水合酶立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的突變而改變上述性質(zhì)的方法，進(jìn)而，提供一種經(jīng)修飾方法得到的腈水合酶、編碼所述腈水合酶的基因、含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述基因或所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株、用所述細(xì)胞株生產(chǎn)所述腈水合酶的方法、以及利用培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞處理物從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的方法。
本發(fā)明人等基于上述情況，在特開平9-275978號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)4)中公開的腈水合酶基因中引入了未在該文獻(xiàn)中公開的新型置換突變位點(diǎn)，并確定了導(dǎo)入所述突變后所述基因的堿基序列。進(jìn)而制備出了含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株。另外，通過(guò)反復(fù)深入地研究了利用所述細(xì)胞株生產(chǎn)所述酶、或利用培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞處理物從腈化合物制備出對(duì)應(yīng)的酰胺化合物，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的腈水合酶的α亞單位的特征為，其氨基酸序列具有下述突變，即，在序列號(hào)1表示的α亞單位的氨基酸序列中第36、71、148、及204位氨基酸中的任何一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
本發(fā)明的腈水合酶的β亞單位的特征為，其氨基酸序列具有下述突變，即，在序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任何一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
本發(fā)明的腈水合酶的特征為，具有α亞單位和β亞單位，上述亞單位中至少一方存在上述突變。
編碼本發(fā)明腈水合酶的α亞單位的基因的特征為，其負(fù)責(zé)編碼存在于上述α亞單位中的突變的氨基酸序列；編碼本發(fā)明腈水合酶的β亞單位的基因的特征為，其負(fù)責(zé)編碼存在于上述β亞單位中的突變的氨基酸序列。
編碼本發(fā)明腈水合酶的基因的特征為，包含編碼α亞單位的基因和編碼β亞單位的基因，上述亞單位中至少一方存在上述突變。
本發(fā)明的質(zhì)粒的特征為，具有上述的任一種基因。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子的特征為，通過(guò)利用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到。
本發(fā)明中腈水合酶的制備方法特征為，其包含從上述轉(zhuǎn)化子、上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、或者上述轉(zhuǎn)化子或上述培養(yǎng)液的處理物中回收腈水合酶的步驟。
本發(fā)明的酰胺化合物的制備方法的特征為包含下述步驟在水性介質(zhì)中使腈化合物與上述腈水合酶接觸，從而將所述腈化合物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的步驟。
另外，本發(fā)明人等鑒于上述情況，以專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)4中公開的腈水合酶基因?yàn)槔?，基于新觀點(diǎn)規(guī)定了作為突變對(duì)象的區(qū)域，并實(shí)施對(duì)腈水合酶進(jìn)行修飾的方法，即對(duì)形成該區(qū)域的氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進(jìn)行置換、插入、或缺失等改變而修飾腈水合酶。具體而言，參照非專利文獻(xiàn)2、3、4、及以PDB號(hào)1AHJ、2AHJ、1IRE中公開的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)，經(jīng)深入分析研究，確定了符合要求的修飾對(duì)象區(qū)域。更具體而言，通過(guò)解析立體結(jié)構(gòu)，確定了形成孔穴的區(qū)域、以及形成界面的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴，所述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間結(jié)合的界面及參與2聚體之間相互結(jié)合的界面。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行置換、插入、缺失等修飾的方法沒(méi)有特別的限制，可以舉出例如采用基因重組手段引入突變的方法。
進(jìn)一步確定了經(jīng)所述修飾后該基因的堿基序列，制備了含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述基因或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞株，用所述細(xì)胞株生產(chǎn)所述酶或利用培養(yǎng)所述細(xì)胞株得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、細(xì)胞處理物從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物，從而觀察了修飾方法對(duì)腈水合酶的性質(zhì)造成了何種改變。經(jīng)過(guò)反復(fù)深入研究構(gòu)成作為修飾對(duì)象的腈水合酶的氨基酸序列中各位點(diǎn)的改變及由此得到的各種修飾酶，從而完成了本發(fā)明。
即，除了上述特征，本發(fā)明還涉及下述[1]～[22]中所述內(nèi)容。
.一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法通過(guò)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)特定的氨基酸殘基中1個(gè)或1個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變?cè)撁傅幕钚?、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中的任何1種或1種以上的性質(zhì)，這些步驟為(a)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表中序列號(hào)98記載的氨基酸序列及序列表中序列號(hào)99記載的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比；(b)根據(jù)對(duì)比的結(jié)果確定與下述區(qū)域?qū)?yīng)的氨基酸殘基，所述區(qū)域?yàn)?，序列表中序列?hào)98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表中序列號(hào)99記載的氨基酸序列中從第31位的賴氨酸到第51位的苯丙氨酸的區(qū)域、以及從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域；(c)對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法通過(guò)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)特定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何1種或1種以上性質(zhì)，這些步驟為(d)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表中序列號(hào)98記載的氨基酸序列及序列表中序列號(hào)99記載的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比；(e)根據(jù)對(duì)比的結(jié)果確定與序列表中序列號(hào)98記載的氨基酸序列中第36、48、71、148、188、204位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基、與序列表中序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第10、32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基；(f)對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法通過(guò)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)特定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何1種或1種以上性質(zhì)，(g)基于PDB(Protein Data Bank)號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和與氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(h)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)的A鏈(Chain 1IREA)中從N末端算起的第2個(gè)螺旋對(duì)應(yīng)的區(qū)域的氨基酸殘基；以及與B鏈(Chain 1IREB)中從N末端算起的第1個(gè)螺旋、第2個(gè)螺旋、及夾在其間的環(huán)狀部分、和從C末端算起的第3個(gè)螺旋對(duì)應(yīng)的區(qū)域的氨基酸殘基；(i)對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何1種或1種以上性質(zhì)，(j)基于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和與氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(k)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)的A鏈中從N末端算起作為第89位氨基酸殘基的谷氨酰胺、作為第165位氨基酸殘基的谷氨酸、以及從B鏈N末端算起作為第37位氨基酸殘基的苯丙氨酸、作為第48位氨基酸的亮氨酸對(duì)應(yīng)的4個(gè)氨基酸殘基；(l)確定下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子位于立體結(jié)構(gòu)中半徑為5_的范圍內(nèi)，該立體結(jié)構(gòu)分別以上述確定的4個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子為其中心點(diǎn)；(m)對(duì)上述1中確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上的性質(zhì)，(n)基于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)對(duì)比結(jié)果來(lái)推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(o)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定形成下述孔穴的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴；(p)在構(gòu)成確定的區(qū)域的氨基酸殘基中確定如下的氨基酸殘基，這些氨基酸殘基的改變使孔穴尺寸發(fā)生變化，進(jìn)而可控制底物/產(chǎn)物通過(guò)的難易程度；
(q)對(duì)上述p中確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.一種具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上性質(zhì)，(r)基于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)對(duì)比結(jié)果來(lái)推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(s)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定以下共計(jì)4個(gè)氨基酸殘基，該氨基酸殘基為與PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中從A鏈的N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，以及與從B鏈的N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、作為第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基；(t)規(guī)定對(duì)應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d1，對(duì)應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d2，對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d3，確定使d1～d3中的1項(xiàng)或1項(xiàng)以上發(fā)生變化的氨基酸殘基；(u)對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.在[6]記載的修飾方法中，(t)的步驟如下述(t’)所述，(t’)規(guī)定對(duì)應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d1，對(duì)應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d2，對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d3，對(duì)應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d4，對(duì)應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基與對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d5，確定使d1～d5中的1項(xiàng)或1項(xiàng)以上發(fā)生變化的氨基酸殘基。
.如[1]～[7]中任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征為，修飾前的具有腈水合酶活性的酶含有下述[A]和[B]所述的2種多肽[A]由與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽；[B]由與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。
.如[8]所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[C]所述的多肽，[B]所述的多肽為下述[D]所述的多肽，[C]由下述任一種氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列；對(duì)序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中的至少1個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入、或缺失處理而得到的氨基酸序列；將序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的至少1個(gè)氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
由下述任一種氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表中序列號(hào)99記載的氨基酸序列；對(duì)序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中的至少1個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入、或缺失處理而得到的氨基酸序列；將序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中的第20、21、108、200、212位氨基酸中的至少1個(gè)氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
.如[8]所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[E]所述的多肽，[B]所述的多肽為下述[F]所述的多肽。
由與下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第704位到第1315位堿基形成的ORF(Open Reading Frame，開放讀碼框)所編碼的氨基酸序列。
由與下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1位到第680位堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列。
.一種修飾前具有腈水合酶活性的酶的修飾方法，該方法經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中的任何1種或1種以上性質(zhì)，其特征為，所述修飾前具有腈水合酶活性的酶中作為構(gòu)成要素含有的2種多肽中，一種為[10]中的[E]記載的多肽，另一種為[10]中的[F]記載的多肽，(d’)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，(e’)根據(jù)對(duì)比的結(jié)果確定與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第48、51位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，(f’)對(duì)確定的氨基酸殘基中的1個(gè)或1個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
.如[8]所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[G]所述的多肽，[G]含有氨基酸序列為X1CXLC1SC2X2X3X4X5的區(qū)域的多肽(其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示絲氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenic acid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸)。
.如[12]所述的修飾方法，其特征為，所述序列中X1表示纈氨酸，X4表示色氨酸，X5表示脯氨酸。
.如[13]所述的修飾方法，其特征為，所述序列中X2表示酪氨酸，X3表示脯氨酸。
.如[12]～[14]中任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征為，通過(guò)X1CXLC1SC2X2X3X4X5序列表示的區(qū)域與金屬原子結(jié)合。
.如[15]所述的修飾方法，其特征為，所述金屬原子為鈷原子。
.一種修飾酶，其特征為，所述酶是利用[1]～[16]中任一項(xiàng)所述的修飾方法而得到的。
.一種基因，其特征為，所述基因是編碼[17]所述修飾酶的基因。
.一種質(zhì)粒，其特征為，所述質(zhì)粒含有[18]所述的基因。
.一種轉(zhuǎn)化子，其特征為，所述轉(zhuǎn)化子是利用[18]所述基因或[19]所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物而得到的。
.一種制備修飾酶的方法，其特征為，所述方法包含從培養(yǎng)[20]所述的轉(zhuǎn)化子而得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、或其處理物中回收修飾酶的步驟。
.一種制備酰胺化合物的方法，其特征為，所述方法包含以下步驟在溶劑中，使培養(yǎng)[20]所述的轉(zhuǎn)化子而得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、或其處理物、或者經(jīng)[21]所述的制備方法得到的修飾酶與腈化合物接觸，從而將該腈化合物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物。
本發(fā)明提供一種腈水合酶的氨基酸序列及所述基因的堿基序列，所述腈水合酶來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌，具有新型突變位點(diǎn)，但其本質(zhì)功能未發(fā)生變化。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、含有所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子、用所述轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)所述酶的方法、以及利用所述轉(zhuǎn)化子從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的方法。
本發(fā)明還提供一種酶的修飾方法，其采用以改變具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)為特征的方法來(lái)修飾在修飾前具有腈水合酶活性的酶。作為采用上述方法的修飾方法可獲得的效果的特征可以舉出，能夠改變活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)中的1種或1種以上性質(zhì)。另外本發(fā)明提供一種具有新型突變位點(diǎn)的腈水合酶、及編碼構(gòu)成所述酶的多肽鏈的基因。還可以提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、含有所述基因或所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子、利用所述轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)所述酶的方法，以及利用所述轉(zhuǎn)化子從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的方法。


圖1表示從MT10822提取的質(zhì)粒pPT-DB1的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切圖。(參考例1、實(shí)施例1、83)圖2表示用于表達(dá)具有活性的來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶而構(gòu)建的質(zhì)粒pJ1H-DB1的限制性核酸內(nèi)切酶的酶切圖。(實(shí)施例84)圖1及圖2中使用的省略符號(hào)的含義如下bla表示編碼β-內(nèi)酰胺酶的ORF。
Col E1-ori表示Col E1系統(tǒng)的復(fù)制起始位點(diǎn)。
lacZ表示來(lái)源于pUC18的乳糖操縱子中的啟動(dòng)子和操縱基因區(qū)域。
NHα表示編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的α亞單位的ORF。
NHβ表示編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的β亞單位的ORF。
P16表示編碼下述蛋白質(zhì)的ORF，所述蛋白質(zhì)的特征為，其參與來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶的激活。
nhhA表示編碼來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的α亞單位的ORF。
nhhB表示編碼來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的β亞單位的ORF。
具體實(shí)施例方式
下面更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明的腈水合酶是在具有腈水合酶活性的酶中引入突變而得到的，例如，在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到。具體而言，其基本上可通過(guò)序列表的序列號(hào)1及2表示的氨基酸序列中至少1個(gè)或1個(gè)以上特定位點(diǎn)的氨基酸經(jīng)其它氨基酸置換而構(gòu)成。即，本發(fā)明包含以下腈水合酶以序列表的序列號(hào)1中的205個(gè)氨基酸的序列所表示的α亞單位內(nèi)至少1個(gè)或1個(gè)以上氨基酸被其它氨基酸置換而得到的序列為構(gòu)成要素的腈水合酶、以序列表的序列號(hào)2中的233個(gè)氨基酸的序列所表示的β亞單位的構(gòu)成氨基酸共計(jì)438個(gè)中至少1個(gè)或1個(gè)以上氨基酸被其它氨基酸置換而得到的序列為構(gòu)成要素的腈水合酶、以及同時(shí)以上述兩種序列為構(gòu)成要素的腈水合酶。
本發(fā)明中在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到的腈水合酶中所使用的具體氨基酸序列中包括以下序列(a-0)序列號(hào)1表示的α亞單位的氨基酸序列，(a-1)具有突變的氨基酸序列，即，序列號(hào)1表示的α亞單位的氨基酸序列中第36、71、148、204位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
(a-2)具有突變的氨基酸序列，即，序列表中序列號(hào)1表示的α亞單位的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
(b-0)序列表中序列號(hào)2表示的β亞單位的氨基酸序列，(b-1)具有突變的氨基酸序列，即，序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、217位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
(b-2)具有突變的氨基酸序列，即，序列表的序列號(hào)2表示的β亞單位的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
上述各突變至少能夠維持突變前的腈水合酶的活性。
本發(fā)明在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到的腈水合酶由以下構(gòu)成要素形成，所述構(gòu)成要素具有選自上述(a-0)～(b-2)的氨基酸序列。
(A-1)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)所述突變的氨基酸序列。
(A-2)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列。
(B-1)腈水合酶的β亞單位具有包含上述(b-1)所述突變的氨基酸序列。
(B-2)腈水合酶的β亞單位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(A-3)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有上述(b-0)所述氨基酸序列。
(A-4)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)所述突變的氨基酸序列。
(A-5)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(A-6)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(A-7)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有上述(b-0)所述氨基酸序列。
(A-8)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)所述突變的氨基酸序列。
(A-9)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(A-10)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(B-3)腈水合酶的α亞單位具有上述(a-0)所述氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)的氨基酸序列。
(B-4)腈水合酶的α亞單位具有上述(a-0)所述氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(B-5)腈水合酶的α亞單位具有包含上述(a-2)所述突變的氨基酸序列、且β亞單位具有包含上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
另外，對(duì)于上述確定的突變位點(diǎn)以外的氨基酸，只要在不損害經(jīng)上述特定位點(diǎn)突變而得到的目標(biāo)腈水合酶活性的范圍內(nèi)，也可以進(jìn)行氨基酸的置換、插入、缺失處理。
本發(fā)明在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶中引入突變而得到的腈水合酶基因包括編碼腈水合酶的α亞單位的基因和編碼腈水合酶的β亞單位的基因。
作為本發(fā)明所述基因的一族，可以舉出在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶基因中實(shí)施引入突變處理而得到的基因，其中包括編碼α亞單位的氨基酸序列的基因、編碼β亞單位的基因、以及同時(shí)含有編碼α亞單位的基因和編碼β亞單位的基因的腈水合酶基因。
具體可以舉出以下基因。
(G-1)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(a-1)所述突變的氨基酸序列。
(G-2)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列。
(G-3)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(b-1)所述突變的氨基酸序列。
(G-4)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼具有上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(G-3)具有下述堿基序列的基因，所述堿基序列編碼上述(A-1)～(B-4)所述的任一腈水合酶。
編碼作為上述突變基礎(chǔ)的序列號(hào)1所述的α亞單位的氨基酸序列的堿基序列優(yōu)選為序列號(hào)3所述的堿基序列。編碼作為上述突變基礎(chǔ)的序列號(hào)2所述的β亞單位的氨基酸序列的堿基序列優(yōu)選為序列號(hào)4所述的堿基序列。
例如，以序列號(hào)3為基礎(chǔ)時(shí)，上述(a-1)所述突變可通過(guò)將序列號(hào)3的堿基序列中的下述任何1個(gè)或1個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到第106到第108位、從第211到第213位、從第442到第444位、及從第610到第612位。
另外，以序列號(hào)3為基礎(chǔ)時(shí)，上述(a-2)所述突變可通過(guò)將序列號(hào)3的堿基序列中的下述任何1個(gè)或1個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到第16到第18位、從第55到第57位、從第112到第114位、從第229到第231位、從第268到第270位、從第304到第306位、從第316到第318位、從第376到第378位、從第388到第390位、從第424到第426位、從第436到第438位、從第559到第561位、從第580到第582位、從第607到第609位。
以序列號(hào)4為基礎(chǔ)時(shí)，上述(b-1)所述突變可通過(guò)將序列號(hào)4的堿基序列中的下述任何1個(gè)或1個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到第28到第30位、從第94到第96位、從第109到第111位、從第121到第123位、從第136到第138位、從第142到第144位、從第151到第153位、從第214到第216位、從第352到第354位、從第379到第381位、從第436到第438位、從第478到第480位、從第556到第558位、從第649到第651位。
另外，以序列號(hào)4為基礎(chǔ)時(shí)，上述(b-2)所述突變可通過(guò)將序列號(hào)4的堿基序列中的下述任何1個(gè)或1個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到第58到第60位、從第61到第63位、從第322到第324位、從第598到第600位、以及從第634到第636位。
上述置換在將腈水合酶的活性保持置換前的狀態(tài)、或者較之有所提高的范圍內(nèi)進(jìn)行，所述腈水合酶中具有由各基因編碼的α及β亞單位中的至少其一。另外，引入突變的方式?jīng)]有特別的限制。
對(duì)于本發(fā)明的腈水合酶基因中(a-1)、(a-2)、(b-1)、及(b-2)所述突變位點(diǎn)之外的位點(diǎn)，在能夠作為具有腈水合酶活性的蛋白質(zhì)模型而發(fā)揮功能的范圍內(nèi)，也可具有經(jīng)堿基的置換、插入、或缺失處理產(chǎn)生的附加突變。
上述附加突變可以舉出以下例子。即使在以具有某種特定的堿基序列的基因作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯時(shí)，因其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的種類、或培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基的成分或組成、或培養(yǎng)時(shí)的溫度、pH等因素的不同，在經(jīng)基因表達(dá)后宿主細(xì)胞內(nèi)酶的修飾后，在保留所期望的酶活性的情況下，仍可能出現(xiàn)以下的突變體，即在酶的序列表中N-末端附近的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上氨基酸發(fā)生缺失、或在N-末端插入1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上氨基酸而得到的突變體。因此此類突變的腈水合酶也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的腈水合酶生產(chǎn)用質(zhì)?？梢岳蒙鲜鲭嫠厦富蜻M(jìn)行制備，可以舉出以下具體例。
(P-1)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(a-1)所述突變的氨基酸序列。
(P-2)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(a-1)和(a-2)所述突變的氨基酸序列。
(P-3)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(b-1)所述突變的氨基酸序列。
(P-4)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼具有上述(b-1)和(b-2)所述突變的氨基酸序列。
(P-3)具有下述堿基序列的質(zhì)粒，所述堿基序列編碼上述(A-1)～(B-4)中所述的任一腈水合酶。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子或細(xì)胞株是利用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化任意宿主細(xì)胞而得到的。本發(fā)明的腈水合酶的生產(chǎn)方法包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子、細(xì)胞株以生產(chǎn)腈水合酶的步驟。另外，本發(fā)明的酰胺化合物的制備方法包括下述步驟使培養(yǎng)用于生產(chǎn)上述腈水合酶的轉(zhuǎn)化子、細(xì)胞株而得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞或細(xì)胞處理物在溶媒中與腈化合物接觸而制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物。
下面對(duì)本發(fā)明中具有腈水合酶活性的酶的修飾方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明的腈水合酶活性是指將腈化合物水合成為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的水合活性。一般而言，具有所述活性的酶的特征為，以稱為α亞單位、β亞單位的2種多肽鏈作為構(gòu)成要素，腈水合酶基因是指以形成上述兩種多肽鏈為特征的兩個(gè)氨基酸序列，或構(gòu)成下述兩個(gè)ORF(開放讀碼框)的堿基序列，所述ORF的特征為編碼上述兩個(gè)氨基酸序列。
以來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶(參照序列表的序列號(hào)98及99、專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4、PDB號(hào)1IRE)為例進(jìn)行具體說(shuō)明，由序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列形成的多肽及PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的A鏈為α亞單位；由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列形成的多肽及PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的B鏈為β亞單位。而由序列表的序列號(hào)100記載的堿基序列形成的ORF和由序列表的序列號(hào)101記載的堿基序列形成的ORF稱為腈水合酶基因。
另外，對(duì)于來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶(參照序列表中序列號(hào)104、專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)1)而言，由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第704位到第1315位形成的ORF編碼的氨基酸序列形成的多肽為α亞單位；由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1位到第690位形成的ORF編碼的氨基酸序列形成的多肽為β亞單位。另外，序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列編碼的兩個(gè)ORF稱為腈水合酶基因。
本發(fā)明的修飾方法是指，改變修飾前具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)的方法，其目的為在不損害腈水合酶本來(lái)的活性的前提下，改變?cè)撁傅幕钚?、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任何一種或一種以上的性質(zhì)，該方法的特征為包括以下步驟通過(guò)解析立體結(jié)構(gòu)，確定形成下述孔穴的區(qū)域和/或形成下述界面的區(qū)域，并對(duì)與該區(qū)域中存在的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸中的任一或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入、缺失等修飾；上述孔穴指底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴，上述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面；以來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶(參照序列表的序列號(hào)98及99、專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4、PDB號(hào)1IRE)為例進(jìn)行具體說(shuō)明，與形成底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴的區(qū)域中存在的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基可以舉出，形成對(duì)應(yīng)于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的B鏈從N末端算起第1個(gè)螺旋、第2個(gè)螺旋、以及夾在其間的環(huán)狀部分的區(qū)域的氨基酸殘基；側(cè)鏈前端重原子位于以下述4個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子為各自中心點(diǎn)的立體結(jié)構(gòu)中半徑5_的區(qū)域以內(nèi)的氨基酸殘基，上述4個(gè)氨基酸殘基為，PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的從A鏈N末端算起第89位氨基酸殘基的谷氨酰胺、第165位氨基酸殘基的谷氨酸、以及從B鏈N末端算起第37位氨基酸殘基的苯丙氨酸、第48位氨基酸的亮氨酸所對(duì)應(yīng)的4個(gè)氨基酸殘基；序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中從第31位的賴氨酸到第51位的苯丙氨酸的區(qū)域、以及從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域所對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基；序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127位所對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基等。
另外，作為存在于參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面的區(qū)域中的氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，可以舉出對(duì)應(yīng)于下述區(qū)域的氨基酸殘基，所述區(qū)域?yàn)镻DB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中從A鏈N末端算起第2個(gè)螺旋、從B鏈N末端算起第2個(gè)螺旋、序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表的序列號(hào)99記載的從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域；以及與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中第36、71、148、188、204位、與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第10、32、33、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基等。
在構(gòu)成底物從酶外部進(jìn)入活性中心、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴的形成區(qū)域的氨基酸殘基中，對(duì)通過(guò)修飾可改變孔穴的大小從而控制底物/產(chǎn)物通過(guò)的難易程度的氨基酸殘基加以確定的方法可以舉出，確定PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中從A鏈N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(AS9Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，以及從B鏈N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)所對(duì)應(yīng)的4個(gè)氨基酸殘基，規(guī)定A165E和B48L之間的最短重原子間距為d1，A89Q和B48L之間的最短重原子間距為d2，B37F和B48L之間的最短重原子間距為d3，A165E和B37F之間的最短重原子間距為d4，A89Q和B37F之間的最短重原子間距為d5，確定使d1～d5中的1項(xiàng)或1項(xiàng)以上發(fā)生變化的氨基酸殘基，或確定使d1～d3中的1項(xiàng)或1項(xiàng)以上發(fā)生變化的氨基酸殘基。
因此，由下述步驟構(gòu)成的修飾方法也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，即，對(duì)于作為對(duì)象的腈水合酶(以來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶為代表例)中與上述確定的任何一種或一種以上氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進(jìn)行置換、插入、或缺失等修飾的步驟。
另外，本發(fā)明也包含下述修飾方法，即，將來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095以外的生物種的腈水合酶(例如，來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶)與來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)、氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，從而找出與上述氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，并修飾對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸。
實(shí)施上述例舉的修飾方法時(shí)，在基于立體結(jié)構(gòu)或氨基酸序列進(jìn)行的對(duì)比中使用的裝置沒(méi)有特別的限制，作為氨基酸序列的對(duì)比裝置可以舉出日立Soft社制的DNASIS、Free-Soft的CLUSTALW或BLAST等基因序列分析軟件；而作為基于氨基酸序列的對(duì)比結(jié)果的立體結(jié)構(gòu)模擬裝置可以舉出Accelrys社制的Modeler或Homology等蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件。
舉一例而言，對(duì)于來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶(參照序列表的序列號(hào)104、專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)1)，對(duì)比的結(jié)果為，對(duì)應(yīng)于序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第48位的氨基酸殘基Leu的氨基酸殘基為Trp，該Trp與由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1個(gè)到第690個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列中第48位對(duì)應(yīng)；對(duì)應(yīng)于序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第51位的氨基酸殘基Phe的氨基酸殘基為Ser，該Ser與由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1個(gè)到第690個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列中第51位對(duì)應(yīng)。上述結(jié)果與基于氨基酸序列的對(duì)比和基于立體結(jié)構(gòu)的對(duì)比結(jié)果相一致。本發(fā)明也包含改變上述兩個(gè)氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的氨基酸中的任一方或雙方的修飾方法。
需要說(shuō)明的是，在實(shí)施上述修飾方法時(shí)，用于改變氨基酸殘基所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中氨基酸的引入突變的方法沒(méi)有特別的限制，可以舉出利用基因重組技術(shù)將氨基酸序列中的氨基酸置換為其它氨基酸的突變引入法。
另外，對(duì)于計(jì)劃引入的突變之外的附加引入的突變所引起的氨基酸序列或堿基序列的變化而言，在不影響計(jì)劃突變引入得到的目標(biāo)腈水合酶的活性的范圍內(nèi)，也可發(fā)生氨基酸或堿基的置換、插入或缺失。
上述附加導(dǎo)入的突變可以舉例如下即使使用特定堿基序列的基因作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯時(shí)，根據(jù)導(dǎo)入其的宿主細(xì)胞的種類、培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基的成分或組成、培養(yǎng)時(shí)的溫度、或pH等因素的不同，經(jīng)基因表達(dá)后宿主細(xì)胞內(nèi)酶的修飾等作用，在保留最初酶活性的情況下，仍可能出現(xiàn)以下突變體，即序列表中N-末端附近的氨基酸中的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上發(fā)生缺失、或N-末端中插入1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上氨基酸。因此產(chǎn)生上述突變的腈水合酶修飾方法也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
作為本發(fā)明修飾方法的對(duì)象的修飾前的腈水合酶，可以舉出例如來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶和來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶。具體可以舉出下述兩種腈水合酶，其中一種為，以下述兩個(gè)多肽鏈為構(gòu)成要素的腈水合酶，所述的兩個(gè)多肽鏈分別由與下述兩個(gè)氨基酸序列相同的氨基酸序列形成，即由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1個(gè)到第690個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列和由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第704個(gè)到第1315個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列；另一種腈水合酶以下述兩個(gè)多肽鏈為構(gòu)成要素，即，以由序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列形成的多肽鏈和由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列形成的多肽鏈為構(gòu)成要素。
作為本發(fā)明修飾方法的對(duì)象的修飾前的腈水合酶，也包括以下述兩種多肽為構(gòu)成要素的腈水合酶，所述兩種多肽的其中一種為，與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，另一種為與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。
作為與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以舉出序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列形成的多肽、對(duì)序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中至少一個(gè)位點(diǎn)實(shí)施置換、插入或缺失的任一種修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽、序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一個(gè)氨基酸被其它氨基酸置換后得到的氨基酸序列形成的多肽、與序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第704到第1315個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。
另外，由與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽可以具有如下特征，即，其序列中含有X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示絲氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸)結(jié)構(gòu)的區(qū)域。除此之外，其還可以具有下述特征，即，上述區(qū)域中X1為纈氨酸，X4為色氨酸，X5為脯氨酸。另外，其也可以具有下述特征，即，上述區(qū)域中X2為酪氨酸，X3為脯氨酸。
在上述情況下，其特征也可以為通過(guò)X1CXLC1SC2X2X3X4X5結(jié)構(gòu)的區(qū)域與金屬原子結(jié)合。另外，其特征還可為所述金屬為鈷。
作為由與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽，可以舉出由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中至少一個(gè)位點(diǎn)經(jīng)置換、插入或缺失的任一修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽；由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一個(gè)氨基酸被其它氨基酸置換后得到的氨基酸序列形成的多肽；由與序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1到第690個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽等。
舉一例而言，來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶以下述多肽為構(gòu)成要素，所述多肽為由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第704到第1315個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1到第690個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列形成的多肽，因此，本發(fā)明中作為修飾方法的對(duì)象的修飾前的腈水合酶中包括上述腈水合酶。
另外，來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶以由序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列形成的多肽和由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列形成的多肽為構(gòu)成要素，因此，其也包含在本發(fā)明中作為修飾方法的對(duì)象的修改前的腈水合酶的范圍內(nèi)。
另外，作為從來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶，可以舉出滿足下述兩種條件中任一方或雙方的腈水合酶。第一種條件為，在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的構(gòu)成要素中，由序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列形成的多肽被下述兩種多肽之一置換而得到的酶，所述兩種多肽為，由對(duì)序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中至少一個(gè)位點(diǎn)實(shí)施置換、插入或缺失的任一修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中至少一個(gè)氨基酸被置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列形成的多肽；第二種條件為，在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的構(gòu)成要素中，由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列形成的多肽被下述兩種多肽之一置換而得到的酶，所述兩種多肽為，由對(duì)序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中至少一個(gè)位點(diǎn)實(shí)施置換、插入或缺失的任一修飾后得到的氨基酸序列形成的多肽，或者由序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列的第20、21、108、200、212位氨基酸中至少一個(gè)氨基酸被置換為其它氨基酸后的氨基酸序列形成的多肽。
作為本發(fā)明修飾方法的對(duì)象的修改前的腈水合酶也包括由來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶。
本發(fā)明中修飾酶是指，以具有腈水合酶活性的酶為對(duì)象進(jìn)行修飾后得到的腈水合酶。例如可以舉出具有如下特征的修飾酶，即，該修飾酶是采用上述修飾方法改變修飾前的腈水合酶的特性而得到的。
與修飾前的腈水合酶相比較，作為特性的改變可以舉出底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物(可以舉出例如以該酶作為催化劑時(shí)，能夠轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的任意腈化合物)穩(wěn)定性、產(chǎn)物(可以舉出例如以該酶作為催化劑時(shí)，轉(zhuǎn)化任意腈化合物而得到的對(duì)應(yīng)酰胺化合物)穩(wěn)定性等性質(zhì)中的任一種或一種以上性質(zhì)發(fā)生的改變。具體可以舉出以下8種改變等，1)相對(duì)而言，空間體積更大的腈化合物容易成為底物。
2)相對(duì)而言，空間體積更小的腈化合物容易成為底物。
3)以任意腈化合物作為底物時(shí)，Vmax增大。
4)以任意腈化合物作為底物時(shí)，Km減小。
5)將酶暴露于任意熱量中時(shí)，其不可逆失活率降低。
6)將酶暴露于任意濃度的底物中時(shí)，其不可逆失活率降低。
7)因反應(yīng)中存在任意濃度產(chǎn)物所引起的反應(yīng)抑制率降低。
8)將酶暴露于任意濃度的產(chǎn)物中時(shí)，其不可逆失活率降低。
作為本發(fā)明中以修飾前的腈水合酶為對(duì)象的修飾方法所產(chǎn)生的特性改變的指標(biāo)，可以以底物特異性的變化作為其代表例之一。當(dāng)經(jīng)本發(fā)明的修飾方法得到的修飾酶為改變了底物特異性的酶時(shí)，該修飾酶也包含在本發(fā)明的修飾酶的范圍中。
作為得到的修飾酶的底物特異性變化的觀察方法，可以舉出如下方法以空間體積不同的多種腈化合物作為底物進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定生成的對(duì)應(yīng)酰胺化合物的量的差異。例如，比較以丙烯腈為底物反應(yīng)生成的丙烯酰胺與以甲基丙烯腈為底物反應(yīng)生成的甲基丙烯酰胺的摩爾比的方法。此時(shí)，與修飾前的對(duì)象相比較，可以認(rèn)為[生成的甲基丙烯酰胺的摩爾量]÷[生成的丙烯酰胺的摩爾量]的值向增大的方向變化的修飾酶表現(xiàn)出使空間體積更大的腈化合物容易成為底物的特性變化；上述值向減小的方向變化的修飾酶表現(xiàn)出使空間體積更小的腈化合物容易成為底物的特性變化。
以來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶、以及從來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶衍生出的腈水合酶為對(duì)象的例子中，實(shí)施包括下述步驟的修飾方法時(shí)，與修飾前的對(duì)象比較，得到了以丙烯腈為底物反應(yīng)生成的丙烯酰胺與以甲基丙烯腈為底物反應(yīng)生成的甲基丙烯酰胺的摩爾比發(fā)生變化的修飾酶，該步驟為通過(guò)解析立體結(jié)構(gòu)，確定形成下述孔穴的區(qū)域和/或形成下述界面的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴，所述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面；并對(duì)與所述區(qū)域中存在的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸的任一或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入、缺失等修飾的步驟。上述性質(zhì)可稱為底物特異性，即，特性改變的產(chǎn)物，因此得到的修飾酶包含在本發(fā)明的修飾酶范圍內(nèi)。
在以來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶為對(duì)象的例子中，序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1個(gè)到第690個(gè)堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列的第48位所對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基Trp被變更為其它氨基酸殘基，采用上述修飾方法時(shí)，與修飾前的對(duì)象相比較，顯示出空間體積更大的腈化合物易作為底物的特性變化。因此，獲得的表現(xiàn)出特性改變的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的修飾酶范圍內(nèi)。
另外，容易推測(cè)，通過(guò)組合得到的修飾酶的突變位點(diǎn)，可獲得附加的特性改變。因此，上述經(jīng)突變位點(diǎn)組合而得到的修飾酶也包含在本發(fā)明的修飾酶范圍之內(nèi)。
本發(fā)明中編碼修飾酶的基因是指，以形成構(gòu)成修飾酶的2種多肽鏈為特征的2個(gè)氨基酸序列，或形成以編碼上述2個(gè)氨基酸序列為特征的2個(gè)ORF的堿基序列。
本發(fā)明中以含有基因?yàn)樘卣鞯馁|(zhì)粒是指具有下述特征的質(zhì)粒，即，該質(zhì)粒的序列中含有形成下述2個(gè)ORF的堿基序列，所述2個(gè)ORF的特征為編碼下述2個(gè)氨基酸序列，而所述2個(gè)氨基酸序列的特征為形成構(gòu)成修飾酶的2種多肽鏈。
上述質(zhì)粒除本發(fā)明的基因之外，還可具有能夠通過(guò)轉(zhuǎn)化任意宿主細(xì)胞得到的轉(zhuǎn)化子或細(xì)胞株生產(chǎn)修飾酶的所需的結(jié)構(gòu)，如各基因表達(dá)中必需的控制區(qū)域及自我復(fù)制的必需區(qū)域等。此處所謂任意的宿主細(xì)胞，例如為下述實(shí)施例中舉出的大腸桿菌，但并不限定于此，也可以使用枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌屬菌、酵母菌或鏈霉菌屬等其它微生物。
作為表達(dá)中必需的控制區(qū)域，可以舉出啟動(dòng)子序列(含有控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列)、核糖體結(jié)合序列(SD序列)、轉(zhuǎn)錄終止序列等。
具體的啟動(dòng)子序列，可以舉出來(lái)源于大腸桿菌的色氨酸操縱子的Trp啟動(dòng)子、乳糖操縱子的Lac啟動(dòng)子、來(lái)源于λ噬菌體的PL啟動(dòng)子和PR啟動(dòng)子；以及來(lái)源于枯草芽胞桿菌的葡糖醛酸合成酶啟動(dòng)子(gnt)、堿性蛋白酶啟動(dòng)子(apr)、中性蛋白酶啟動(dòng)子(npr)和α-淀粉酶啟動(dòng)子(amy)等。另外也可以利用人為設(shè)計(jì)、改良的序列，如tac啟動(dòng)子或trc啟動(dòng)子。
作為核糖體結(jié)合序列可以舉出來(lái)源于大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的序列或紅球菌屬/假諾卡氏菌屬固有的序列，只要是能在諸如大腸桿菌或枯草芽胞桿菌等所希望的宿主細(xì)胞中起作用的序列即可，沒(méi)有特別的限制。例如，可以利用由DNA合成制備的下述共有序列，所述共有序列由4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)堿基組成，并可與16S核糖體RNA的3’-末端區(qū)互補(bǔ)。轉(zhuǎn)錄終止序列不是必須的，然而，可以利用ρ-因子非依賴性序列，例如，脂蛋白終止子或trp操縱子終止子等。上述控制區(qū)域在質(zhì)粒上的序列順序優(yōu)選為，啟動(dòng)子序列和核糖體結(jié)合序列位于靠近5’-末端側(cè)本發(fā)明基因的上游位置，轉(zhuǎn)錄終止序列位于靠近3’-末端側(cè)本發(fā)明基因的下游的位置。編碼構(gòu)成本發(fā)明基因的各種ORF的堿基序列可以通過(guò)上述控制區(qū)域以各自獨(dú)立的順?lè)醋有问竭M(jìn)行表達(dá)，也可以通過(guò)共同的控制區(qū)域以多順?lè)醋有问竭M(jìn)行表達(dá)。
作為滿足上述要求的質(zhì)粒載體實(shí)例，可以舉出在大腸桿菌中具有可自我復(fù)制的區(qū)域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223-3、pSC101；在枯草芽胞桿菌中具有可自我復(fù)制的區(qū)域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1、φ105等。另外，作為可在2種或2種以上宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制的質(zhì)粒載休實(shí)例可以舉出，pHV14、TRp7、YEp7和pBS7。
本發(fā)明中表達(dá)基因以生產(chǎn)具有所期望的活性的腈水合酶時(shí)，有時(shí)需要參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)。
參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)是具有下述性質(zhì)的蛋白質(zhì)，即，所述蛋白質(zhì)表達(dá)與否直接影響腈水合酶的激活，可以舉出專利文獻(xiàn)4中記載的參與來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酶激活的蛋白質(zhì)(腈水合酶激活蛋白質(zhì))。具體而言，作為腈水合酶激活蛋白質(zhì)可以舉出由序列號(hào)102的氨基酸序列所表示的144個(gè)氨基酸的序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。另外，將序列號(hào)102的氨基酸序列的一部分氨基酸置換、插入或缺失等得到的突變蛋白質(zhì)只要參與腈水合酶的激活，則也包含在腈水合酶激活蛋白質(zhì)的范疇內(nèi)。作為上述突變蛋白質(zhì)，可以舉出具有對(duì)序列號(hào)102的氨基酸序列中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸進(jìn)行置換、插入或缺失等處理而得到的突變并保持參與腈水合酶激活的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
作為編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因，只要是編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因即可，并無(wú)特別的限制。作為上述基因，可以舉出具有編碼上述序列號(hào)102的氨基酸序列的堿基序列的基因、及編碼上述突變蛋白質(zhì)的基因。另外，作為編碼上述腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因的優(yōu)選例，可以舉出具有序列號(hào)103的堿基序列的基因。編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因中，即使是對(duì)序列號(hào)103記載的堿基序列中的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上堿基進(jìn)行置換、插入、缺失而得到的序列，只要其能夠作為編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因而發(fā)揮作用，則也包含在編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因的范圍之內(nèi)。
在使用編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的基因時(shí)，可以舉出例如將其ORF與本發(fā)明中形成基因的2個(gè)ORF共同包含在本發(fā)明的質(zhì)粒中。此時(shí)，上述ORF在質(zhì)粒上的順序沒(méi)有特別的限制，另外，可以是3個(gè)ORF被同一個(gè)控制區(qū)域控制；也可以是2個(gè)ORF被同一個(gè)控制區(qū)域控制、而剩余1個(gè)ORF被不同于前2個(gè)ORF的控制區(qū)域的控制區(qū)域控制；還可以是3個(gè)ORF各自被不同的控制區(qū)域控制。
如上所述，將本發(fā)明的基因與本發(fā)明中修飾酶的活性表達(dá)所必需的區(qū)域一同插入上述質(zhì)粒載體中，從而構(gòu)建本發(fā)明的質(zhì)粒的方法、或?qū)⑺鲑|(zhì)粒在所希望的宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化的方法、以及在上述轉(zhuǎn)化子內(nèi)生產(chǎn)腈水合酶的方法，可以利用例如“《分子克隆第三版》(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)”等記載的分子生物學(xué)、生物工程學(xué)和基因工程學(xué)領(lǐng)域中公知的普通方法和宿主細(xì)胞。
本發(fā)明中以通過(guò)轉(zhuǎn)化而獲得為特征的轉(zhuǎn)化子中，包含利用本發(fā)明的基因或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化子。作為培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子的例子，可以舉出以下述步驟特征的方法將其接種到培養(yǎng)基中之后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度(一般而言為20℃～50℃)下進(jìn)行培養(yǎng)。
需要說(shuō)明的是，當(dāng)宿主細(xì)胞為微生物時(shí)，一般使用LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基等作為培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基，但也可以在上述培養(yǎng)基成分中添加金屬離子。作為添加的金屬離子可以舉出Fe離子及Co離子。添加量例如為0.1μg/mL或0.1μg/mL以上。
本發(fā)明中修飾酶的制備方法以下述步驟為特征從培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、或其處理物中回收修飾酶，可以舉出具有如下特征的方法，即，該方法包含從上述轉(zhuǎn)化子、所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、或者所述轉(zhuǎn)化子或培養(yǎng)液的處理物中回收活性腈水合酶的步驟。
本發(fā)明中以包含將腈化合物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)酰胺化合物的步驟為特征的酰胺化合物制備方法，可以舉出以含有下述轉(zhuǎn)化步驟為特征的方法，所述步驟為使用上述轉(zhuǎn)化子、所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、或所述轉(zhuǎn)化子或所述培養(yǎng)液的處理物、或經(jīng)上述制備方法回收的活性腈水合酶作為催化劑，從而將腈化合物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的步驟。
本發(fā)明中作為利用修飾酶或具有該酶活性的轉(zhuǎn)化子從腈化合物制備對(duì)應(yīng)的酰胺化合物的例子，可以舉出包含下述步驟的方法，即，將所希望的腈化合物與所述酶的精制物或酶的粗產(chǎn)物、本發(fā)明中轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液、從培養(yǎng)液得到的轉(zhuǎn)化子、或者轉(zhuǎn)化子的處理物在溶劑中接觸的步驟。此處所謂處理物包括從所述轉(zhuǎn)化子得到的提取物、粉碎物；分離上述提取物或粉碎物中腈水合酶活性成分而得到的酶粗產(chǎn)物；進(jìn)一步精制而得到的酶精制物等后分離物；以及將所述轉(zhuǎn)化子或所述轉(zhuǎn)化子的提取物、粉碎物或后分離物用適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ɑ玫降墓潭ɑ?。接觸溫度沒(méi)有特別的限制，優(yōu)選在所述腈水合酶不失活的溫度范圍內(nèi)，更優(yōu)選為凝固點(diǎn)或凝固點(diǎn)以上，60℃或60℃以下。
作為腈化合物，只要是能夠作為本發(fā)明的改良酶的底物發(fā)揮作用的化合物即可，可以舉出碳原子為2～4的腈化合物，例如，乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、異丁腈、丁烯腈和α-羥基異丁腈等。所述腈化合物在溶劑中的濃度沒(méi)有特別的限定，另外，反應(yīng)溫度也無(wú)特別的限定，但優(yōu)選在所述腈水合酶不失活的溫度范圍內(nèi)，更優(yōu)選為凝固點(diǎn)或凝固點(diǎn)以上，50℃或50℃以下。
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)地說(shuō)明，但本發(fā)明并不受到下述實(shí)施例的任何限定。應(yīng)予說(shuō)明，各實(shí)施例及比較例中的HPLC分析使用日本分光制的Finepak SIL C 18-5(250×4.6φmm)作為色譜柱，并以含有4體積％乙腈的10mM磷酸水溶液為流動(dòng)相。利用210nm處的吸光度檢測(cè)丙烯酰胺、丙烯腈、丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸。
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(1)為了將α亞單位中的第6位的Leu置換為Met，使用寶酒造社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”引入位點(diǎn)特異性突變。下文中“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”簡(jiǎn)稱為試劑盒。在以下參考例中基本按照試劑盒的原理和操作方法來(lái)進(jìn)行。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并通過(guò)高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使其最終濃度為100μg/ml后，使用鉑金接菌環(huán)將MT-10822接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法由該菌體制備質(zhì)粒pPT-DB1。
分別以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)下述步驟完成在分別含有50pmol序列表的序列號(hào)7記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)下述步驟完成在分別含有50pmol MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用Microcon 100(寶酒造社制)從各PCR最終反應(yīng)液中除去過(guò)量的引物和dNTP后，加入TE分別配制成50μl的溶液。配制總計(jì)47.5μl的分別含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(組成遵照試劑盒中記載的條件)，實(shí)施10分鐘熱變性處理(98℃)后，經(jīng)60分鐘以恒定的速度冷卻至37℃，接著在37℃下保持15分鐘進(jìn)行退火處理。將0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火處理液中，并在72℃下加熱處理3分鐘，由此形成了異源雙鏈。使其進(jìn)行PCR反應(yīng)No.3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)及M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol，使總量達(dá)到50μl后，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。取5μl PCR反應(yīng)No.3的最終反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約2kbp的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。接著從瓊脂糖凝膠中僅切出約2kbp的DNA片段，將該瓊脂糖片(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml的TE溶液中，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)所得熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割上述純化后的約2kbp的擴(kuò)增DNA片段，然后對(duì)該限制性核酸內(nèi)切酶處理液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段，最終使其溶于10μl的TE中。同樣用EcoRI及HindIII切割pPT-DB1后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.7％)，僅將約2.7kbp的DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml TE溶液中，將其在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化該DNA片段，使該片段最終溶于10μl的TE中。用DNAligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的約2kbp及約2.7kbp的DNA片段進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)，得到轉(zhuǎn)化子No.1。
利用下述方法求出用得到的轉(zhuǎn)化子制備酰胺化合物時(shí)的轉(zhuǎn)化率和選擇率。
在500ml裝有擋板的三角燒瓶中配制含有40μg/ml硫酸鐵·七水合物和10μg/ml氯化鈷·二水合物的LB液體培養(yǎng)基100ml，并通過(guò)高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使其最終濃度為100μg/ml。然后使用鉑金接菌環(huán)將轉(zhuǎn)化子No.1接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、130rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。通過(guò)離心分離(5000G×15分鐘)從該最終培養(yǎng)液中分離出菌體，接著將上述分離后的菌體重懸在50ml的生理鹽水中，并再次離心分離(5000G×15分鐘)出菌體。將0.1g該菌體混懸在20ml、50mM的磷酸鉀水溶液(pH7.0)中，向其中加入1ml丙烯腈或甲基丙烯腈，并在10℃下邊緩慢地?cái)嚢柽吺蛊浞磻?yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC分析反應(yīng)液，結(jié)果確認(rèn)了在反應(yīng)液中僅存在與反應(yīng)液中添加的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)相當(dāng)摩爾量的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)，而不存在腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)及對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。即，轉(zhuǎn)化率和選擇率都是100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表1所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Met。
表1
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(2)為了將α亞單位中的第6位的Leu置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)下述步驟而完成在含有序列表中序列號(hào)11記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(以試劑盒中記載的條件組合)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)下述步驟而完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。使用PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。然后，通過(guò)進(jìn)行與包含PCR反應(yīng)No.2的參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.2。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果為100％。
然后，利用堿性SDS提取法由上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表2所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Thr。
表2
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(3)為了將α亞單位中的第6位的Leu置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)下述步驟完成在含有序列表中序列號(hào)12記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)下述步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.3。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表3所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Ala。
表3
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(4)為了將α亞單位中的第6位的Leu置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)13記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.4。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表4所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Val。
表4
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(5)為了將α亞單位中的第19位的Ala置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)14記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μL的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.5。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表5所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第19位的Ala被置換為Val。
表5
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(6)為了將α亞單位中的第38位的Met置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)15記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.6。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表6所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第38位的Met被置換為L(zhǎng)eu。
表6
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(7)為了將α亞單位中第77位的Thr置換為Ser，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)16記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.7。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表7所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第77位的Thr被置換為Ser。
表7
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(8)為了將α亞單位中第90位的Gly置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)17記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.8。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表8所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第90位的Gly被置換為Ala。
表8
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(9)為了將α亞單位中第102位的Val置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)18記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有-序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.9。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表9所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第102位的Val被置換為Ala。
表9
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(10)為了將α亞單位中第106位的Val置換為Ile，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DBl質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)在含有序列表中序列號(hào)19記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.10。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表10所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第106位的Val被置換為Ile。
表10
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(11)為了將α亞單位中第126位的Phe置換為Tyr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)20記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.11。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表11所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表11
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(12)為了將α亞單位中第130位的Gln置換為Glu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)21記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.12。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表12所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第130位的Gln被置換為Glu。
表12
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(13)為了將α亞單位中第142位的Leu置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)22記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.13。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表13所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第142位的Leu被置換為Val。
表13
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(14)為了將α亞單位中第146位的Glu置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)23記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.14。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表14所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第146位的Glu被置換為Asp。
表14
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(15)為了將α亞單位中第187位的Ala置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)24記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.15。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表15所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第187位的Ala被置換為Thr。
表15
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(16)為了將α亞單位中第194位的Ser置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)25記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2以下步驟完成通過(guò)在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.16。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表16所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第194位的Ser被置換為L(zhǎng)eu。
表16
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(17)為了將α亞單位中第203位的Ala置換為Glu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)26記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.17。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表17所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第203位的Ala被置換為Glu。
表17
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(18)為了將β亞單位中第20位的Ala置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)27記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)而完成，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2以下步驟完成通過(guò)在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作而完成。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.18。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表18所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第20位的Ala被置換為Val。
表18
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(19)為了將β亞單位中第21位的Asp置換為Asn，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)28記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.19。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表19所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第21位的Asp被置換為Asn。
表19
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(20)為了將β亞單位中第108位的Glu置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)29記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作而完成。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.20。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表20所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp。
表20
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(21)為了將β亞單位中第108位的Glu置換為Pro，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)30記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.21。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表21所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Pro。
表21
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(22)為了將β亞單位中第108位的Glu置換為Ser，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)31記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.22。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表22所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Ser。
圖6是根據(jù)該發(fā)明研制成的收看限制方法流程圖。
電視臺(tái)在播放節(jié)目時(shí)，首先按Parentalrate(以年齡段分類的基準(zhǔn))，劃分有害場(chǎng)面和無(wú)害場(chǎng)面(S601)。
在開始播放的同時(shí)，將元數(shù)據(jù)(MetaData)與圖像和聲音內(nèi)容進(jìn)行同步化處理，并向外傳送，此時(shí)成為基準(zhǔn)的值為PCR值(S601)。
在具備圖像和聲音基準(zhǔn)的條件下，通過(guò)元數(shù)據(jù)頻道，發(fā)送不當(dāng)內(nèi)容提示訊息(S603)。
由播放接收器設(shè)置年齡段收看限制基準(zhǔn)(parental ratesetting)(S604)，并播放A/V頻道(S605)。
如果由電視臺(tái)發(fā)送不當(dāng)內(nèi)容提示訊息，播放接收器中控制這一訊息的應(yīng)用程序便開始操作(Rate Control application)，并對(duì)不當(dāng)內(nèi)容提示訊息的元數(shù)據(jù)和當(dāng)前配置上設(shè)定的基準(zhǔn)進(jìn)行比較和判斷(rate_control)rate_setting_value)(S606)。
根據(jù)上述判斷結(jié)果，進(jìn)行畫面的空白處理、拼圖處理及模糊處理，或一時(shí)間切斷聲音信息的輸出(S607)。
對(duì)根據(jù)該發(fā)明研發(fā)出的數(shù)字廣播接收器收看限制方法的上述說(shuō)明，是以電視臺(tái)播放僅供18歲以上的年齡段收看的電影舉例說(shuō)明。
電視臺(tái)在播放電影時(shí)，以年齡段控制收看限制(Parental rateControl)為目的獲取PID，并在必要時(shí)，電視臺(tái)方面將生成<p>表23
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(24)為了將β亞單位中第108位的Glu置換為Cys，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)33記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.24。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表24所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Cys。
表24
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(25)為了將β亞單位中第108位的Glu置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)34記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.25。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表25所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為L(zhǎng)eu。
表25
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(26)為了將β亞單位中第108位的Glu置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)35記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.26。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表26所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Thr。
表26
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(27)為了將β亞單位中第200位的Ala置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)36記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.27。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表27所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第200位的Ala被置換為Asp。
表27
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(28)為了將β亞單位中第200位的Ala置換為Ile，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)37記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.28。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表28所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第200位的Ala被置換為Ile。
表28
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(29)為了將β亞單位中第200位的Ala置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)38記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.29。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表29所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第200位的Ala被置換為Val。
表29
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(30)為了將β亞單位中第200位的Ala置換為Glu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)39記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.30。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表30所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表30
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(31)為了將β亞單位中第212位的Ser置換為Tyr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與參考例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng參考例1制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)40記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.31。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果為，表31所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表31
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(32)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.5的氨基酸突變(α亞單位中第19位的Ala變?yōu)閂al)和克隆No.11的氨基酸突變(α亞單位中第126位的Phe變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例11得到的克隆No.11接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備克隆No.11的質(zhì)粒DNA。
以1μg克隆No.11的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)14記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.32。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表32所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表32
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(33)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.1的氨基酸突變(α亞單位的第6位的Leu變?yōu)镸et)和克隆No.32的氨基酸突變(α亞單位的第19位的Ala變?yōu)閂al、α亞單位的第126位的Phe變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例32得到的克隆No.32接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備克隆No.32的質(zhì)粒DNA。
以1μg克隆No.32的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)7記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.33。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表33所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Met、α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表33
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(34)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.2的氨基酸突變(α亞單位的第6位的Leu變?yōu)門hr)和克隆No.32的氨基酸突變(α亞單位的第19位的Ala變?yōu)閂al、α亞單位的第126位的Phe變?yōu)門yr)。
以1μg參考例33中制備的克隆No.32的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)11記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.34。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表34所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Thr、α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表34
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(35)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.3的氨基酸突變(α亞單位的第6位的Leu變?yōu)锳la)和克隆No.32的氨基酸突變(α亞單位的第19位的Ala變?yōu)閂al、α亞單位的第126位的Phe變?yōu)門yr)。
以1μg參考例33中制備的克隆No.32的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)12記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作而完成。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.35。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表35所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Ala、α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表35
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(36)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.20的氨基酸突變(β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳sp)和克隆No.31的氨基酸突變(β亞單位的第212位的Ser變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例31得到的克隆No.31接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備克隆No.31的質(zhì)粒DNA。
以1μg克隆No.31的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)29記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.36。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表36所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表36
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(37)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.23的氨基酸突變(β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳rg)和克隆No.31的氨基酸突變(β亞單位的第212位的Ser變?yōu)門yr)。
以1μg參考例36中制備的克隆No.31的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)32記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.37。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表37所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Arg、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表37
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(38)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.27的氨基酸突變(β亞單位的第200位的Ala變?yōu)锳sp)和克隆No.31的氨基酸突變(β亞單位的第212位的Ser變?yōu)門yr)。
以1μg參考例36中制備的克隆No.31的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)36記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.38。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表38所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第200位的Ala被置換為Asp、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表38
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(39)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.30的氨基酸突變(β亞單位的第200位的Ala變?yōu)镚lu)和克隆No.31的氨基酸突變(β亞單位的第212位的Ser變?yōu)門yr)。
以1μg參考例36中制備的克隆No.31的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)39記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作而完成。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與參考例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.39。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表39所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表39
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(40)為了將α亞單位中第36位的Thr置換為Met，使用寶酒造社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”引入位點(diǎn)特異性突變。下文中“LAPCR in vitro mutagenesis Kit”簡(jiǎn)稱為試劑盒。在以下實(shí)施例中基本按照試劑盒的原理和操作方法來(lái)進(jìn)行。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml。使用鉑金及菌環(huán)將MT-10822接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，以堿性SDS提取法利用該菌體制備質(zhì)粒pPT-DB1。
分別以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)41記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μ1的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。使用Microcon 100(寶酒造社制)從各種PCR最終反應(yīng)液中除去過(guò)量的引物和dNTP后，加入TE分別配制成50μl的溶液。配制總計(jì)47.5μl的分別含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(組成遵照試劑盒中記載的條件)，實(shí)施10分鐘熱變性處理(98℃)后，以恒定的速度經(jīng)60分鐘冷卻至37℃，接著在37℃下保持15分鐘進(jìn)行退火處理。將0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火處理液中，并在72℃下加熱處理3分鐘，由此完成了異源雙鏈的形成。通過(guò)以下步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)No.3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)及M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol使總量達(dá)到50μl后，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。用5μl PCR反應(yīng)No.3的最終反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約2kbp的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。接著從瓊脂糖凝膠中僅切出約2kbp的DNA片段，將該瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml的TE溶液中，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將所得熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割上述純化后的約2kbp的擴(kuò)增DNA片段，然后對(duì)該限制性核酸內(nèi)切酶處理液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶于10μl TE中。同樣用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割pPT-DB1后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.7％)，僅將約2.7kbp的DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml TE溶液中，將其在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化該DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的約2kbp及約2.7kbp的DNA片段進(jìn)行連接后，對(duì)大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.40。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表40所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第36位的Thr被置換為Met。
表40
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(41)為了將α亞單位中第71位的Arg置換為His，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)42記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.41。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表41所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第71位的Arg被置換為His。
表41
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(42)為了將α亞單位中第148位的Gly置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)43記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.42。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表42所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第148位的Gly被置換為Asp。
表42
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(43)
為了將α亞單位中第204位的Val置換為Arg，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)44記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.43。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表43所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第204位的Val被置換為Arg。
表43
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(44)為了將α亞單位中第204位的Val置換為L(zhǎng)ys，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)45記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.44。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表44所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第204位的Val被置換為L(zhǎng)ys。
表44
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(45)為了將α亞單位中第204位的Val置換為Trp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)46記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.45。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表45所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第204位的Val被置換為Trp。
表45
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(46)為了將α亞單位中第204位的Val置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)47記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.46。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表46所示的克隆中腈水合酶的α亞單位中第204位的Val被置換為Thr。
表46
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(47)為了將3亞單位中第10位的Thr置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)48記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.47。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表47所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Asp。
表47
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(48)為了將β亞單位中第10位的Thr置換為Glu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)49記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.48。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表48所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Glu。
表48
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(49)為了將β亞單位中第10位的Thr置換為Trp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)50記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmo1的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.49。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表49所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Trp。
表49
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(50)為了將β亞單位中第10位的Thr置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)51記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.50。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表50所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Gly。
表50
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(51)為了將β亞單位中第10位的Thr置換為Tyr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)52記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.51。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表51所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Tyr。
表51
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(52)為了將β亞單位中第10位的Thr置換為Cys，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)53記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.52。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表52所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Cys。
表52
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(53)為了將β亞單位中第32位的Val置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)54記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.53。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表53所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第32位的Val被置換為Gly。
表53
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(54)為了將β亞單位中第37位的Phe置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)55記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.54。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表54所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為Thr。
表54
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(55)為了將β亞單位中第37位的Phe置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)56記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.55。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表55所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為Ala。
表55
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(56)為了將β亞單位中第37位的Phe置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)57記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)而完成，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.56。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表56所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為L(zhǎng)eu。
表56
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(57)為了將β亞單位中第37位的Phe置換為Ile，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)58記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)而完成，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.57。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表57所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為Ile。
表57
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(58)為了將β亞單位中第37位的Phe置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)59記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.58。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表58所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為Val。
表58
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(59)為了將β亞單位中第41位的Phe置換為Glu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)60記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.59。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表59所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為Glu。
表59
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(60)為了將β亞單位中第41位的Phe置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)61記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.60。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表60所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為Thr。
表60
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(61)為了將β亞單位中第41位的Phe置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)62記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)而完成，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.61。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表61所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為Ala。
表61
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(62)為了將β亞單位中第41位的Phe置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)63記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.62。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表62所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為L(zhǎng)eu。
表62
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(63)為了將β亞單位中第41位的Phe置換為Ile，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)64記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.63。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表63所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為Ile。
表63
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(64)為了將β亞單位中第41位的Phe置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)65記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.64。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表64所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為Val。
表64
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(65)為了將β亞單位中第46位的Met置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)66記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.65。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表65所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第46位的Met被置換為Gly。
表65
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(66)為了將β亞單位中第46位的Met置換為Tyr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)67記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.66。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表66所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第46位的Met被置換為Tyr。
表66
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(67)為了將β亞單位中第46位的Met置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)68記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μ1的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.67。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表67所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第46位的Met被置換為L(zhǎng)eu。
表67
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(68)為了將β亞單位中第46位的Met置換為L(zhǎng)ys，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)69記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol MUT4引物的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.68。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表68所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第46位的Met被置換為L(zhǎng)ys。
表68
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(69)為了將β亞單位中第46位的Met置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)70記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.69。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表69所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第46位的Met被置換為Asp。
表69
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(70)為了將β亞單位中第48位的Leu置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)71記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.70。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表70所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Gly。
表70
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(71)為了將β亞單位中第48位的Leu置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)72記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.71。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表71所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Ala。
表71
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(72)為了將β亞單位中第48位的Leu置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)73記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.72。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表72所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Val。
表72
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(73)為了將β亞單位中第48位的Leu置換為Ser，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)74記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.73。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表73所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Ser。
表73
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(74)為了將β亞單位中第48位的Leu置換為Thr，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)75記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.74。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表74所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Thr。
表74
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(75)為了將β亞單位中第48位的Leu置換為Arg，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)76記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.75。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表75所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Arg。
表75
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(76)為了將β亞單位中第51位的Phe置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)77記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μ1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.76。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表76所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第51位的Phe被置換為Ala。
表76
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(77)為了將β亞單位中第51位的Phe置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)78記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.77。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表77所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第51位的Phe被置換為Val。
表77
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(78)為了將β亞單位中第72位的Trp置換為Phe，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)79記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.78。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表78所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第72位的Trp被置換為Phe。
表78
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(79)為了將β亞單位中第118位的Phe置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)80記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.79。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表79所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第118位的Phe被置換為Ala。
表79
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(80)為了將β亞單位中第118位的Phe置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)81記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.80。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表80所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第118位的Phe被置換為L(zhǎng)eu。
表80
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(81)為了將β亞單位中第118位的Phe置換為Ile，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)82記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.81。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表81所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第118位的Phe被置換為Ile。
表81
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(82)為了將β亞單位中第118位的Phe置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)83記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.82。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表82所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第118位的Phe被置換為Val。
表82
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(83)為了將β亞單位中第127位的Leu置換為Ala，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)84記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.83。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表83所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第127位的Leu被置換為Ala。
表83
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(84)為了將β亞單位中第127位的Leu置換為Val，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)85記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.84。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表84所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第127位的Leu被置換為Val。
表84
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(85)為了將β亞單位中第127位的Leu置換為Ser，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)86記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.85。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表85所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第127位的Leu被置換為Ser。
表85
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(86)為了將β亞單位中第146位的Arg置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)87記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.86。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表86所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第146位的Arg被置換為Gly。
表86
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(87)為了將β亞單位中第160位的Arg置換為L(zhǎng)eu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)88記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.87。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表87所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第160位的Arg被置換為L(zhǎng)eu。
表87
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(88)為了將β亞單位中第160位的Arg置換為Trp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)89記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.88。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表88所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第160位的Arg被置換為Trp。
表88
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(89)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為Glu，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)90記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.89。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表89所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為Glu。
表89
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(90)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為Asp，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)91記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.90。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表90所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為Asp。
表90
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(91)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為L(zhǎng)ys，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)92記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.91。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表91所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為L(zhǎng)ys。
表91
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(92)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為Arg，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)93記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.92。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表92所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為Arg。
表92
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(93)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為Asn，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)94記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.93。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表93所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為Asn。
表93
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(94)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為Ser，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)95記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.94。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表94所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為Ser。
表94
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(95)為了將β亞單位中第186位的Leu置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)96記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.95。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表95所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第186位的Leu被置換為Gly。
表95
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(96)為了將β亞單位中第217位的Asp置換為Gly，以pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1相同的操作而引入位點(diǎn)特異性突變。
分別以10ng實(shí)施例1中制備的pPT-DB1質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)97記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。取PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.96。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了表96所示的克隆中腈水合酶的β亞單位中第217位的Asp被置換為Gly。
表96
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(97)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.40的氨基酸突變(α亞單位的第36位的Thr變?yōu)镸et)和克隆No.11的氨基酸突變(α亞單位的第126位的Phe變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例11得到的克隆No.11接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)41記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.97。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表97所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第36位的Thr被置換為Met、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表97
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(98)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.42的氨基酸突變(α亞單位的第148位的Gly變?yōu)锳sp)和克隆No.43的氨基酸突變(α亞單位的第204位的Val變?yōu)锳rg)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后將一白金環(huán)實(shí)施例4得到的克隆No.43接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)43記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.98。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表98所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第14位的Gly被置換為Asp、α亞單位中第204位的Val被置換為Arg。
表98
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(99)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.77的氨基酸突變(β亞單位的第51位的Phe變?yōu)閂al)和克隆No.20的氨基酸突變(β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳sp)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例20得到的克隆No.20接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)78記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.99。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表99所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第51位的Phe被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp。
表99
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(100)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.20的氨基酸突變(β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳sp)和克隆No.30的氨基酸突變(β亞單位的第200位的Ala變?yōu)镚lu)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例30得到的克隆No.30接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)29記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.100。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表100所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表100
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(101)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.82的氨基酸突變(β亞單位的第118位的Phe變?yōu)閂al)和克隆No.30的氨基酸突變(β亞單位的第200位的Ala變?yōu)镚lu)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例30得到的克隆No.30接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)83記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μ1進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.101。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表101所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第118位的Phe被置換為Val、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表101
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(102)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.88的氨基酸突變(β亞單位的第160位的Arg變?yōu)門rp)和克隆No.92的氨基酸突變(β亞單位的第186位的Leu變?yōu)锳rg)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例53得到的克隆No.92接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)89記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.102。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表102所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第160位的Arg被置換為Trp、β亞單位中第186位的Leu被置換為Arg。
表102
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(103)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.2的氨基酸突變(α亞單位的第6位的Leu變?yōu)門hr)和克隆No.97的氨基酸突變(α亞單位的第36位的Thr變?yōu)镸et、α亞單位中第126位的Phe變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金滅菌環(huán)將實(shí)施例58得到的克隆No.97接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)11記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.103。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表103所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Thr、α亞單位中第36位的Thr被置換為Met、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表103
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(104)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.41的氨基酸突變(α亞單位的第71位的Arg變?yōu)镠is)和克隆No.32的氨基酸突變(α亞單位的第19位的Ala變?yōu)閂al、α亞單位中第126位的Phe變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金滅菌環(huán)將參考例32得到的克隆No.32接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)42記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.104。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表104所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第71位的Arg被置換為His、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr。
表104
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(105)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.40的氨基酸突變(α亞單位的第36位的Thr變?yōu)镸et)和克隆No.98的氨基酸突變(α亞單位的第148位的Gly變?yōu)锳sp、α亞單位中第204位的Val變?yōu)锳rg)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例59得到的克隆No.98接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)41記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.105。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表105所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第36位的Thr被置換為Met、α亞單位中第148位的Gly被置換為Asp、α亞單位中第204位的Val被置換為Arg。
表105
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(106)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.47的氨基酸突變(β亞單位的第10位的Thr變?yōu)锳sp)和克隆No.101的氨基酸突變(β亞單位的第118位的Phe變?yōu)閂al、β亞單位中第200位的Ala變?yōu)镚lu)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金滅菌環(huán)將實(shí)施例61得到的克隆No.101接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)48記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.106。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表106所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第10位的Thr被置換為Asp、β亞單位中第118位的Phe被置換為Val、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表106
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(107)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.56的氨基酸突變(β亞單位的第37位的Phe變?yōu)長(zhǎng)eu)和克隆No.100的氨基酸突變(β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳sp、β亞單位中第200位的Ala變?yōu)镚lu)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金滅菌環(huán)將參考例40得到的克隆No.100接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)57記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.107。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表107所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為L(zhǎng)eu、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表107
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(108)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.58的氨基酸突變(β亞單位的第37位的Phe變?yōu)閂al)和克隆No.100的氨基酸突變(β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳sp、β亞單位中第200位的Ala變?yōu)镚lu)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例40得到的克隆No.100接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)59記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.108。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表108所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第37位的Phe被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表108
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(109)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.63的氨基酸突變(β亞單位的第41位的Phe變?yōu)镮le)和克隆No.99的氨基酸突變(β亞單位中第51位的Phe變?yōu)閂al、β亞單位的第108位的Glu變?yōu)锳sp)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例60得到的克隆No.99接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)64記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.109。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表109所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第41位的Phe被置換為Ile、β亞單位中第51位的Phe被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp。
表109
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(110)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.68的氨基酸突變(β亞單位的第46位的Met變?yōu)長(zhǎng)ys)和克隆No.37的氨基酸突變(β亞單位中第108位的Glu變?yōu)锳rg、β亞單位的第212位的Ser變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例37得到的克隆No.37接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)69記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.110。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表110所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第46位的Met被置換為L(zhǎng)ys、β亞單位中第108位的Glu被置換為Arg、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表110
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(111)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.72的氨基酸突變(β亞單位的第48位的Leu變?yōu)閂al)和克隆No.37的氨基酸突變(β亞單位中第108位的Glu變?yōu)锳rg、β亞單位的第212位的Ser變?yōu)門yr)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金滅菌環(huán)將參考例37得到的克隆No.37接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)73記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.111。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表111所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第48位的Leu被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Arg、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表111
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(112)確認(rèn)了在下述氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性，所述氨基酸置換體同時(shí)具有克隆No.85的氨基酸突變(β亞單位的第127位的Leu變?yōu)镾er)和克隆No.102的氨基酸突變(β亞單位中第160位的Arg變?yōu)門rp、β亞單位的第186位的Leu變?yōu)锳rg)。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例62得到的克隆No.102接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出該菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體制備質(zhì)粒DNA。
分別以10ng制備的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)No.1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)86記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)8中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述各反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)120秒。PCR反應(yīng)No.2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)9中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)10中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)No.1同樣的操作。以PCR反應(yīng)No.1及No.2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確定擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的存在。然后，通過(guò)進(jìn)行與實(shí)施例1完全相同的操作而得到轉(zhuǎn)化子No.112。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表112所示，野生型的腈水合酶的β亞單位中第127位的Leu被置換為Ser、β亞單位中第160位的Arg被置換為Trp、β亞單位中第186位的Leu被置換為Arg。
表112
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(113)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.34的氨基酸突變和克隆No.110的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例34得到的克隆No.34和實(shí)施例70得到的克隆No.110接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.34和克隆No.110的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.110的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.34的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.110的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.34的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101的感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)，得到轉(zhuǎn)化子No.113。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表113所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Thr、α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr、β亞單位中第46位的Met被置換為L(zhǎng)ys、β亞單位中第108位的Glu被置換為Arg、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。

保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(114)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.34的氨基酸突變和克隆No.111的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將參考例34得到的克隆No.34和實(shí)施例71得到的克隆No.111接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以所述菌體分別制備克隆No.34和克隆No.111的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.111的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.34的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.111的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.34的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB101的感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.114。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表114所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Thr、α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr、β亞單位中第48位的Leu被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Arg、β亞單位中第212位的Ser被置換為Tyr。
表114
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(115)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.35的氨基酸突變和克隆No.112的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將一白金環(huán)參考例35得到的克隆No.35和實(shí)施例72得到的克隆No.112接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.35和克隆No.112的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.112的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.35的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.112的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.35的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.115。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表115所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Ala、α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr、β亞單位中第127位的Leu被置換為Ser、β亞單位中第160位的Arg被置換為Trp、β亞單位中第186位的Leu被置換為Arg。

保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(116)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.103的氨基酸突變和克隆No.106的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例63得到的克隆No.103和實(shí)施例66得到的克隆No.106接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.103和克隆No.106的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.106的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.103的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.106的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.103的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB 101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.116。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表116所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第6位的Leu被置換為Thr、α亞單位中第36位的Thr被置換為Met、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr、β亞單位中第10位的Thr被置換為Asp、β亞單位中第118位的Phe被置換為Val、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表116
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(117)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.104的氨基酸突變和克隆No.107的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金滅菌環(huán)將實(shí)施例64得到的克隆No.104和實(shí)施例67得到的克隆No.107接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.104和克隆No.107的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.107的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.104的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.107的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.104的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.117。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表117所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第71位的Arg被置換為His、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr、β亞單位中第37位的Phe被置換為L(zhǎng)eu、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表117
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(118)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.104的氨基酸突變和克隆No.108的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例64得到的克隆No.104和實(shí)施例68得到的克隆No.108接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.104和克隆No.108的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.108的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.104的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.108的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.104的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB 101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.118。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表118所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第19位的Ala被置換為Val、α亞單位中第71位的Arg被置換為His、α亞單位中第126位的Phe被置換為Tyr、β亞單位中第37位的Phe被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表118
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(119)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.105的氨基酸突變和克隆No.109的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例65得到的克隆No.105和實(shí)施例69得到的克隆No.109接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.105和克隆No.109的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.109的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.105的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.109的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.105的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.119。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表119所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第36位的Thr被置換為Met、α亞單位中第148位的Gly被置換為Asp、α亞單位中第204位的Val被置換為Arg、β亞單位中第41位的Phe被置換為Ile、β亞單位中第51位的Phe被置換為Val、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp。
表119
保持了腈水合酶活性的氨基酸置換體的獲得(120)確認(rèn)了同時(shí)具有克隆No.98的氨基酸突變和克隆No.100的氨基酸突變的氨基酸置換體中也保持有腈水合酶活性。
在30ml試管中裝入10ml的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml，然后使用鉑金接菌環(huán)將實(shí)施例59得到的克隆No.98和參考例40得到的克隆No.100接種在培養(yǎng)基上，并在37℃、300rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。取出1ml上述培養(yǎng)液放入適合的離心管中，離心分離(15000rpm×5分鐘)出各菌體。接著，利用堿性SDS提取法以該菌體分別制備克隆No.98和克隆No.100的質(zhì)粒DNA。
將克隆No.100的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為1.0％)，從瓊脂糖凝膠中切下約770bp的DNA片段。同樣將克隆No.98的質(zhì)粒DNA用EcoRI和NotI切割后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖濃度為0.7％)，從瓊脂糖凝膠中切下約3.8kbp的DNA片段。將切下的2份瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并分別混懸在1ml TE溶液中，然后在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。對(duì)該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化各DNA片段。最后溶于10μl TE中。
用DNA ligation試劑盒(寶酒造社制)將上述得到的來(lái)源于克隆No.100的約770bp的DNA片段和來(lái)源于克隆No.98的約3.8kbp的DNA片段進(jìn)行連接以構(gòu)建質(zhì)粒，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌HB 101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化子No.120。
利用與參考例1相同的方法求出添加率和選擇率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
然后，利用堿性SDS提取法從上述菌體制備質(zhì)粒。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了腈水合酶基因部分的堿基序列。結(jié)果如表120所示，野生型的腈水合酶的α亞單位中第148位的Gly被置換為Asp、α亞單位中第204位的Val被置換為Arg、β亞單位中第108位的Glu被置換為Asp、β亞單位中第200位的Ala被置換為Glu。
表120
從紫紅紅球菌J-1株制備基因組DNA在500ml裝有擋板的三角燒瓶中配制下述組成的培養(yǎng)基100ml，并進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。
培養(yǎng)基的組成葡萄糖10.0g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、硫酸鎂·七水合物0.5g/L、酵母提取物1.0g/L、蛋白胨7.5g/L，尿素7.5g/L，氯化鈷·六水合物10.0mg/L，pH 7.2。
使用鉑金接菌環(huán)將專利文獻(xiàn)1記載的紫紅紅球菌J-1株(基于微生物保藏的國(guó)際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約，通過(guò)專利手續(xù)保藏在上述的保藏機(jī)構(gòu)，保藏編號(hào)為FERM BP-1478，經(jīng)申請(qǐng)任何人都可獲得)接種在上述培養(yǎng)基上，并在30℃、130rpm下培養(yǎng)約72小時(shí)。通過(guò)離心分離(15000G×15分鐘)僅將菌體從培養(yǎng)液中分離出來(lái)，接著將該菌體重懸在50ml的生理鹽水中后，再次離心分離而得到濕菌體。
向上述得到的2g濕菌體中加入40ml含有0.15M NaCl的50mMEDTA·2Na的水溶液(pH8.0)使菌體混懸，在90℃下進(jìn)行10分鐘煮沸處理。將該處理液冷卻至37℃，向其中加入100mg蛋白溶菌酶并在37℃下保溫1小時(shí)。接著向其中加入30mg、20000U/mg的酶解酶(zymolylase)，并在37℃下保溫1小時(shí)。然后向其中加入5mg、20U/mg的蛋白酶K，并在37℃下保溫1小時(shí)。進(jìn)一步向其中加入2ml的10％SDS溶液并在65℃下保溫1小時(shí)后，立即進(jìn)行苯酚/氯仿萃取。首先，加入42ml用TE(含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；pH8.0)飽和的苯酚液并緩慢攪拌。進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并僅收集水相。向所得水相中加入21ml上述TE飽和的苯酚液和21ml氯仿，并再次進(jìn)行緩慢攪拌。然后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并再次僅收集水相。向所得水相中加入42ml氯仿并再次進(jìn)行緩慢攪拌，然后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，僅收集水相。向該水相中加入4ml含有1.1M NaCl的TE溶液和92ml乙醇并在室溫下放置一段時(shí)間后，用玻璃棒卷取析出的絲狀DNA。以70％、80％、90％的乙醇水溶液依次脫水后，將自然干燥的該DNA再次溶于40ml TE溶液中。向其中加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)。接著以限制性核酸內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行部分切割。通過(guò)苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀將部分切割的該DNA再次純化，并溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/ml。
利用PCR從紫紅紅球菌J-1株基因組DNA制備腈水合酶基因基于專利文獻(xiàn)2及非專利文獻(xiàn)1中公開的腈水合酶基因的堿基序列合成了序列表的序列號(hào)105及106記載的引物。以3μg實(shí)施例81中制備的部分切割的染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)為在分別含有200ng各引物和1U KOD聚合酶(東洋紡績(jī)社制)的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)中，將下述循環(huán)重復(fù)40次熱變性(98℃)15秒、退火(58℃)15秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(68℃)2分鐘。將PCR反應(yīng)的最終反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約1.3kbp的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。
接著從瓊脂糖凝膠中僅切出約1.3kbp的DNA片段，將該瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml的TE溶液中，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將所得熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。首先，加入1ml用TE(含有1mM EDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；pH8.0)飽和的苯酚液并緩慢攪拌。進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并僅收集水相。將上述操作重復(fù)3次后，向得到的水相中加入0.4ml上述TE飽和的苯酚液和0.4ml氯仿，并再次進(jìn)行緩慢攪拌。然后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并再次僅收集水相。向所得水相中加入0.8ml氯仿并再次進(jìn)行緩慢攪拌，然后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，僅收集水相。向該水相中加入80μl含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7ml乙醇并在-80℃下放置30分鐘后，離心分離(15000rpm、20分鐘、4℃)以回收DNA片段的沉淀。將該DNA片段風(fēng)干后溶于10μl的TE中。
將純化的約1.3kbp的擴(kuò)增DNA片段用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和ScaI進(jìn)行切割后，以瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制的VII型低熔點(diǎn)瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約1.3kbp的DNA。從瓊脂糖凝膠中切下上述約1.3kbp的DNA片段。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1mlTE溶液中，將其在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。首先，加入1ml用TE(含有1mMEDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；PH8.0)飽和的苯酚液并緩慢攪拌。進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并僅收集水相。將上述操作重復(fù)3次后，向得到的水相中加入0.4ml上述TE飽和的苯酚液和0.4ml氯仿，并再次進(jìn)行緩慢攪拌。然后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并再次僅收集水相。向所得水相中加入0.8ml氯仿并再次進(jìn)行緩慢攪拌后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，僅收集水相。向該水相中加入80μl含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7ml乙醇并在-80℃下放置30分鐘后，離心分離(15000rpm、20分鐘、4℃)以回收DNA片段的沉淀。將該DNA片段風(fēng)干后溶于10μl的TE中。
使來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶基因得以表達(dá)的質(zhì)粒載體的制備在500ml裝有擋板的三角燒瓶中配制100ml含有40μg/ml硫酸鐵·七水合物和10μg/ml氯化鈷·六水合物的下述組成的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。
培養(yǎng)基的組成酵母提取物5.0g/L、聚蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0g/L、氯化鈷·六水合物10.0mg/L、硫酸鐵·七水合物40.0mg/L，pH 7.5。
向上述培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml后，使用鉑金接菌環(huán)將專利文獻(xiàn)3記載的MT10822(FERM BP-5785)接種在上述培養(yǎng)基上，并在37℃、130rpm下培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)離心分離(15000G×15分鐘)僅將菌體從培養(yǎng)液中分離出來(lái)，接著將該菌體重懸在50ml的生理鹽水中后，再次離心分離而得到濕菌體。利用堿性SDS提取法從該濕菌體制備pPT-DB1(圖1)的質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。
將1μg純化的質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Eco47III進(jìn)行切割后，以瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制的VII型低熔點(diǎn)瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約3.3kbp和約1.3kbp的DNA。從瓊脂糖凝膠中僅切下約3.3kbp的DNA片段。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml TE溶液中后，將其在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀。首先，加入1ml用TE(含有1mMEDTA·2Na的10mM Tris-HCl水溶液；pH8.0)飽和的苯酚液并緩慢攪拌。進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，僅收集水相。將上述操作重復(fù)3次后，向得到的水相中加入0.4ml上述TE飽和的苯酚液和0.4ml氯仿后再次進(jìn)行緩慢攪拌。然后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，并再次僅收集水相。向所得水相中加入0.8ml氯仿并再次進(jìn)行緩慢攪拌后，再次進(jìn)行離心(3000rpm、10分鐘)以分離水相和有機(jī)相，僅收集水相。向該水相中加入80μl含有1.1M NaCl的TE溶液和1.7ml乙醇并在-80℃下放置30分鐘后，離心分離(15000rpm、20分鐘、4℃)以回收DNA片段的沉淀。將該DNA片段風(fēng)干后溶于10μl的TE中。
使來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶活性得以表現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建將實(shí)施例82中制備的經(jīng)EcoRI和ScaI切割的約1.3kbp的DNA片段和實(shí)施例83中制備的經(jīng)EcoRI和Eco47III切割的約3.3kbp的DNA片段混合，進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101的感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)，得到轉(zhuǎn)化子No.200。
在500ml裝有擋板的三角燒瓶中配制100ml含有40μg/ml硫酸鐵·七水合物和10μg/ml氯化鈷·六水合物的LB液體培養(yǎng)基，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向該培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使最終濃度為100μg/ml后，使用鉑金接菌環(huán)將轉(zhuǎn)化子No.200接種在上述培養(yǎng)基上，并在37℃、130rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)。通過(guò)離心分離(5000G×15分鐘)將該轉(zhuǎn)化子從該最終培養(yǎng)液中分離出來(lái)，接著將分離的該轉(zhuǎn)化子重懸在50ml的生理鹽水中后，再次離心分離(5000G×15分鐘)而分離該轉(zhuǎn)化子。
將0.1g分離的該轉(zhuǎn)化子混懸在20ml、50mM的磷酸鉀水溶液(pH7.0)中，向其中加入0.5ml丙烯腈或甲基丙烯腈，并在30℃下邊緩慢地?cái)嚢柽吺蛊浞磻?yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC分析最終反應(yīng)液，結(jié)果確認(rèn)了在最終反應(yīng)液中僅存在與添加的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)相當(dāng)摩爾量的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)，而不存在腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)及對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。即，轉(zhuǎn)化率和選擇率為100％。
利用堿性SDS提取法從分離的該轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，加入30μgRNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。結(jié)果確認(rèn)了該質(zhì)粒的序列中含有序列表的序列號(hào)103記載的編碼腈水合酶激活蛋白質(zhì)的ORF和序列表的序列號(hào)104記載的編碼來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的ORF。該質(zhì)粒取名為pJ1H-DB1(圖2)。
從修飾前的腈水合酶中提取將要引入突變的目標(biāo)(1)作為修飾方法的對(duì)象，以來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶作為例子。以權(quán)利要求56～62記載的確定作為將要引入突變的目標(biāo)的氨基酸殘基的方法為例，進(jìn)行目標(biāo)的提取。權(quán)利要求56、57記載的確定方法中的氨基酸序列對(duì)比使用日立SOFT社制的DNASIS。權(quán)利要求58～62記載的確定方法中基于氨基酸序列對(duì)比的立體結(jié)構(gòu)模擬使用Accelrys社制的Modeler或Homology。
結(jié)果，采用任一方法提取的氨基酸殘基中均含有作為構(gòu)成該腈水合酶的兩種多肽之一的β亞單位的氨基酸序列中第48位的Trp。因此，用來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第48位的Trp為例來(lái)作為引入突變的目標(biāo)。
從修飾前的腈水合酶中提取將要引入突變的目標(biāo)(2)作為修飾方法的對(duì)象，以來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶作為例子。以權(quán)利要求56～62記載的確定作為將要引入突變的目標(biāo)的氨基酸殘基的方法為例，進(jìn)行目標(biāo)的提取。權(quán)利要求56、57記載的確定方法中的氨基酸序列對(duì)比使用日立SOFT社制的DNASIS。權(quán)利要求58～62記載的確定方法中基于氨基酸序列對(duì)比的立體結(jié)構(gòu)模擬使用Accelrys社制的Modeler或Homology。
結(jié)果，作為在形成下述孔穴的區(qū)域中存在而被提取的氨基酸殘基中，以如下氨基酸殘基作為各引入突變的目標(biāo)的代表例，即，作為構(gòu)成該腈水合酶的兩種多肽之一的α亞單位的氨基酸序列中第36位的Thr、第48位的Asn、以及作為另一種多肽的β亞單位的氨基酸序列中第32位的Val、第33位的Ala、第37位的Phe、第40位的Thr、第41位的Phe、第46位的Met、第48位的Leu、第51位的Phe、第61位的Ala、第72位的Trp、第112位的Lys、第118位的Phe、第127位的Leu；上述孔穴是底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴。
從修飾前的腈水合酶中提取將要引入突變的目標(biāo)(3)作為修飾方法的對(duì)象，以來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶作為例子。以權(quán)利要求56～62記載的確定作為引入突變的目標(biāo)的氨基酸殘基的方法為例，進(jìn)行目標(biāo)的提取。權(quán)利要求56、57記載的確定方法中的氨基酸序列對(duì)比使用日立SOFT社制的DNASIS。權(quán)利要求58～62記載的確定方法中基于氨基酸序列對(duì)比的立體結(jié)構(gòu)模擬使用Accelrys社制的Modeler或Homology。
結(jié)果，作為在形成下述界面的區(qū)域中存在的氨基酸殘基被提取的氨基酸殘基中，以下述氨基酸殘基作為各引入突變的目標(biāo)的代表例，即，作為構(gòu)成該腈水合酶的兩種多肽之一的α亞單位的氨基酸序列中第36位的Thr、第148位的Gly、第188位的Thr、第204位的Val、以及作為另一多肽的β亞單位的氨基酸序列中第10位的Thr、第32位的Val、第33位的Ala、第112位的Lys、第118位的Phe、第127位的Leu、第146位的Arg、第150位的Ala、第160位的Arg、第168位的Thr、第171位的Lys、第176位的Tyr、第186位的Leu、第217位的Asp、第218位的Cys；上述界面為參與2聚體形成的α亞單位和β亞單位之間的結(jié)合界面、或參與2聚體之間結(jié)合的界面。
用于獲得修飾酶的突變引入(1)為了將突變引入構(gòu)成腈水合酶的多肽的氨基酸序列中，使用寶酒造社制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變的引入。下文中“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”簡(jiǎn)稱為試劑盒。在以下實(shí)施例中基本按照試劑盒的原理和操作方法來(lái)進(jìn)行。
在實(shí)施例84中構(gòu)建的、含有編碼來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pJ1H-DB1中，實(shí)施下述突變引入處理，即，將實(shí)施例85中提取的、作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第48位的Trp轉(zhuǎn)換成其它氨基酸。
以10ng pJ1H-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)110記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的反應(yīng)。
以PCR反應(yīng)1及2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)均存在擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用Microcon 100(寶酒造社制)從各PCR最終反應(yīng)液中除去過(guò)剩的引物和dNTP后，加入TE分別配制成50μl的溶液。分別配制總計(jì)47.5μl的含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(組成遵照試劑盒中記載的條件)，實(shí)施10分鐘熱變性處理(98℃)后，用60分鐘以恒定的速度冷卻至37℃，接著在37℃下保持15分鐘進(jìn)行退火處理。
將0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火處理液中，并在72℃下加熱處理3分鐘，由此完成了異源雙鏈的形成。接著對(duì)其進(jìn)行PCR反應(yīng)3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)及M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol使總量達(dá)到50μl后，將下述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。
用5μl PCR反應(yīng)3的最終反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約1.9kbp的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。接著從瓊脂糖凝膠中僅切出約1.9kbp的DNA片段，將該瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml的TE溶液中后，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將所得熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割上述純化的約1.9kbp的擴(kuò)增DNA片段，然后對(duì)該限制性核酸內(nèi)切酶處理液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶解于10μlTE中。同樣用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割pJ1H-DB1后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.7％)，僅將約2.7kbp的DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml TE溶液中，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，從而純化該DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。
將由此得到的約1.9kbp及約2.7kbp的DNA片段進(jìn)行DNA連接反應(yīng)后，對(duì)大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pJ1H-DB1相比較，編碼來(lái)源于紫紅紅球菌J-1株的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第48位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，變化為編碼除Trp以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表121)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表121
用于獲得修飾酶的突變引入(2)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中作為引入突變的目標(biāo)提取的α亞單位的氨基酸序列中第36位的Thr轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)111記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
以PCR反應(yīng)1及2的最終反應(yīng)液各5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖的濃度為1.0重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)均存在擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。使用Microcon 100(寶酒造社制)從各PCR最終反應(yīng)液中除去過(guò)剩的引物和dNTP后，加入TE分別配制成50μl的溶液。配制總計(jì)47.5μl的分別含0.5μl上述TE溶液的退火溶液(組成遵照試劑盒中記載的條件)，實(shí)施10分鐘熱變性處理(98℃)后，用60分鐘以恒定的速度冷卻至37℃，接著在37℃下保持15分鐘進(jìn)行退火處理。
將0.5μl TaKaRa LA Taq加入至退火處理液中，并在72℃下加熱處理3分鐘，由此完成了異源雙鏈的形成。接著對(duì)其進(jìn)行PCR反應(yīng)3，即，向其中加入M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)及M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol使總量達(dá)到50μl后，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。
用5μl PCR反應(yīng)3的最終反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.8重量％)以分析DNA擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以確認(rèn)存在約1.9kbp的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。接著從瓊脂糖凝膠中僅切出約1.9kbp的DNA片段，將該瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml的TE溶液中后，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。
用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割上述純化的約1.9kbp的擴(kuò)增DNA片段，然后對(duì)該限制性核酸內(nèi)切酶處理液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以純化所述DNA片段。最后，將該片段溶解于10μlTE中。同樣用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI及HindIII切割pPT-DB1后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma社制VII型低熔點(diǎn)的瓊脂糖，瓊脂糖的濃度為0.7％)，僅將約2.7kbp的DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下。將切下的瓊脂糖凝膠(約0.1g)微細(xì)地粉碎并混懸在1ml TE溶液中，在55℃下保溫1小時(shí)使瓊脂糖完全熔化。將該熔化液進(jìn)行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀從而純化該DNA片段。最后，將該片段溶于10μl的TE中。
將由此得到的約1.9kbp及約2.7kbp的DNA片段進(jìn)行DNA連接反應(yīng)后，對(duì)大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡績(jī)社制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列中第36位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Thr以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表122)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表122
用于獲得修飾酶的突變引入(3)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的α亞單位的氨基酸序列中第48位的Asn轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)112記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列中第48位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Asn以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表123)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表123
用于獲得修飾酶的突變引入(4)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的α亞單位的氨基酸序列中第71位的Arg轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)113記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列中第71位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Arg以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表124)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表124
用于獲得修飾酶的突變引入(5)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的α亞單位的氨基酸序列中第148位的Gly轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)114記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列中第148位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Gly以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表125)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表125
用于獲得修飾酶的突變引入(6)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的α亞單位的氨基酸序列中第188位的Thr轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)115記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列中第188位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榕c編碼除Thr以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表126)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表126
用于獲得修飾酶的突變引入(7)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的α亞單位的氨基酸序列中第204位的Val轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)116記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列中第204位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Val以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表127)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表127
用于獲得修飾酶的突變引入(8)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第10位的Thr轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)117記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第10位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Thr以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表128)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表128
用于獲得修飾酶的突變引入(9)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述突變引入的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第32位的Val轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)118記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第32位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Val以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表129)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表129
用于獲得修飾酶的突變引入(10)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第33位的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)119記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第33位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Ala以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表130)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表130
用于獲得修飾酶的突變引入(11)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第37位的Phe轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)120記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第37位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Phe以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表131)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表131
用于獲得修飾酶的突變引入(12)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第40位的Thr轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)121記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第40位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Thr以外氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表132)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表132
用于獲得修飾酶的突變引入(13)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第41位的Phe轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)122記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第41位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Phe以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表133)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表133
用于獲得修飾酶的突變引入(14)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第46位的Met轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)123記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第46位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Met以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表134)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表134
用于獲得修飾酶的突變引入(15)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第48位的Leu轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)124記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第48位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Leu以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表135)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表135
用于獲得修飾酶的突變引入(16)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第51位的Phe轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)125記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第51位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Phe以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表136)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表136
用于獲得修飾酶的突變引入(17)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第61位的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)126記載的引物和M13引物M4(，序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第61位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Ala以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表137)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表137
用于獲得修飾酶的突變引入(18)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第72位的Trp轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)127記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第72位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Trp以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表138)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。

用于獲得修飾酶的突變引入(19)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第112位的Lys轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)128記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，與編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第112位氨基酸的密碼子對(duì)應(yīng)的堿基序列轉(zhuǎn)變?yōu)榕c編碼Lys以外氨基酸的密碼子對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表139)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。

用于獲得修飾酶的突變引入(20)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第118位的Phe轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)129記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第118位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Phe以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表140)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。

用于獲得修飾酶的突變引入(21)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第127位的Leu轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)130記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作而。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第127位氨基酸的密碼子對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Leu以外氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表141)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表141
用于獲得修飾酶的突變引入(22)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第146位的Arg轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)131記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第146位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Arg以外氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表142)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表142
用于獲得修飾酶的突變引入(23)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第150位的Ala轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)132記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第150位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Ala以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表143)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表143
用于獲得修飾酶的突變引入(24)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第160位的Arg轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)133記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第160位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Arg以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表144)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表144
用于獲得修飾酶的突變引入(25)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第168位的Thr轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)134記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第168位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Thr以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表145)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表145
用于獲得修飾酶的突變引入(26)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述突變的導(dǎo)入處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第171位的Lys轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)135記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第171位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Lys以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表146)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表146
用于獲得修飾酶的突變引入(27)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第176位的Tyr轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)136記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第176位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Tyr以外氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表147)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表147
用于獲得修飾酶的突變引入(28)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第186位的Leu轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)137記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第186位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Leu以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表148)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表148
用于獲得修飾酶的突變引入(29)在實(shí)施例83中以MT10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)?，將?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第217位的Asp轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)138記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第217位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Asp以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以述(表149)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表149
用于獲得修飾酶的突變引入(30)在實(shí)施例83中以MT 10822制備的含有編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的ORF的質(zhì)粒pPT-DB1中實(shí)施下述引入突變的處理，所述突變?yōu)椋瑢?shí)施例86或87中提取的作為引入突變的目標(biāo)的β亞單位的氨基酸序列中第218位的Cys轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被帷?br> 以10ng的pPT-DB1為模板進(jìn)行兩種類型的PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)1通過(guò)以下步驟完成在含有序列表中序列號(hào)139記載的引物和M13引物M4(序列表的序列號(hào)107中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，將下述反應(yīng)重復(fù)25次循環(huán)，所述反應(yīng)為，熱變性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、鏈延長(zhǎng)反應(yīng)(72℃)2分鐘。PCR反應(yīng)2通過(guò)以下步驟完成在含有MUT4引物(序列表的序列號(hào)108中記載有其序列)和M13引物RV(序列表的序列號(hào)109中記載有其序列)各50pmol的總計(jì)50μl的反應(yīng)系統(tǒng)(組成遵照試劑盒中記載的條件)中，進(jìn)行與PCR反應(yīng)1同樣的操作。
然后進(jìn)行與實(shí)施例89相同的操作而得到多個(gè)轉(zhuǎn)化子。從所述轉(zhuǎn)化子制備各質(zhì)粒，加入30μg的RNaseA并在37℃下保溫1小時(shí)后，利用苯酚萃取/氯仿萃取及乙醇沉淀將該DNA純化，溶解于TE溶液中使最終濃度為1.0μg/μl。接著利用使用ABI社制的測(cè)序試劑盒和核酸自動(dòng)測(cè)序儀373A的雙脫氧鏈終止法測(cè)定了堿基序列。
結(jié)果證明，得到的轉(zhuǎn)化子含有的質(zhì)粒與pPT-DB1相比較，編碼來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列中第218位氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列，轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a除Cys以外的氨基酸的密碼子所對(duì)應(yīng)的堿基序列。
以下(表150)示出得到的轉(zhuǎn)化子的編號(hào)與相應(yīng)的突變位點(diǎn)、氨基酸序列的變化、堿基序列的變化。
表150
修飾前的腈水合酶和修飾后的修飾酶的特性比較(1)在裝有擋板的500ml三角燒瓶中配制含有40μg/ml硫酸鐵·七水合物和10μg/ml氯化鈷·六水合物的100ml LB液體培養(yǎng)基，共配制5份，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向各培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使其最終濃度為100μg/ml。
使用鉑金接菌環(huán)，分別在5份培養(yǎng)基中接種實(shí)施例84得到的轉(zhuǎn)化子No.200、實(shí)施例88中得到的轉(zhuǎn)化子No.201～204共計(jì)5種轉(zhuǎn)化子中的一種，在37℃、130rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)后，通過(guò)離心分離(5000G×15分鐘)從各最終培養(yǎng)液中分離出各轉(zhuǎn)化子，接著將上述分離后的轉(zhuǎn)化子分別重懸在50ml的生理鹽水中后，再次離心分離(5000G×15分鐘)出各轉(zhuǎn)化子。
將0.1g各轉(zhuǎn)化子分別混懸在20ml、50mM的磷酸鉀水溶液(pH7.0)中之后，分成10ml×2份。從而準(zhǔn)備了每種轉(zhuǎn)化子各2份、共計(jì)10份懸濁液。在各轉(zhuǎn)化子的其中1份懸濁液中加入1ml丙烯腈、在另一份中加入甲基丙烯腈，在30℃下邊緩慢攪拌邊使其反應(yīng)10分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC分析各最終反應(yīng)液，結(jié)果表明各液中存在有未反應(yīng)完的作為底物的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)和反應(yīng)生成的作為產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)的酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)。需要說(shuō)明的是，確認(rèn)了并不存在對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。
對(duì)于每種轉(zhuǎn)化子，比較以丙烯腈為底物反應(yīng)生成的丙烯酰胺和以甲基丙烯腈為底物反應(yīng)生成的甲基丙烯酰胺的摩爾比，結(jié)果觀察出以下(表151)所示的差異。丙烯腈與甲基丙烯腈相比，甲基丙烯腈為空間體積較大的腈化合物，因此上述結(jié)果說(shuō)明得到的修飾酶更易于水合空間體積較大的底物。
表151
修飾前的腈水合酶和修飾后的修飾酶的特性比較(2)在裝有擋板的500ml三角燒瓶中配制含有40μg/ml硫酸鐵·七水合物和10μg/ml氯化鈷·六水合物的100ml LB液體培養(yǎng)基，共配制57份，并使用高壓滅菌鍋進(jìn)行121℃、20分鐘的高壓滅菌處理。向各培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素使其最終濃度為100μg/ml。
使用鉑金接菌環(huán)，分別在各培養(yǎng)基中按順序接種一種下述轉(zhuǎn)化子，即，以pPT-DB1轉(zhuǎn)化HB101而得到的No.0和實(shí)施例89～117中得到的轉(zhuǎn)化子中的共計(jì)下述56種轉(zhuǎn)化子No.40、No.40e、No.40f、No.42、No.42a、No.43、No.44、No.45、No.46、No.47、No.48、No.49、No.50、No.51、No.52、No.54、No.55、No.56、No.57、No.58、No.59、No.60、No.61、No.62、No.63、No.64、No.65、No.66、No.67、No.68、No.69、No.70、No.71、No.72、No.73、No.74、No.75、No.76、No.77、No.78、No.79、No.80、No.81、No.82、No.83、No.84、No.85、No.87、No.88、No.89、No.90、No.91、No.92、No.93、No.94、No.95。在37℃、130rpm下培養(yǎng)約20小時(shí)后，通過(guò)離心分離(5000G×15分鐘)從各最終培養(yǎng)液中分離出各轉(zhuǎn)化子，接著將上述分離的轉(zhuǎn)化子分別重懸在50ml的生理鹽水中后，再次離心分離(5000G×15分鐘)出各轉(zhuǎn)化子。
將0.1g各轉(zhuǎn)化子分別混懸在20ml、50mM的磷酸鉀水溶液(pH7.0)中之后，分成10ml×2份。由此準(zhǔn)備了每種轉(zhuǎn)化子各2份、共計(jì)10份懸濁液。在各轉(zhuǎn)化子懸濁液的其中1份中加入1ml丙烯腈、在另一份中加入甲基丙烯腈，在20℃下邊緩慢攪拌邊使其反應(yīng)10分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后，用HPLC分析各最終反應(yīng)液，結(jié)果表明各液中存在有未反應(yīng)完的作為底物的腈化合物(丙烯腈或甲基丙烯腈)和反應(yīng)生成的作為產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)酰胺化合物(丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺)。需要說(shuō)明的是，確認(rèn)了并不存在對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸(丙烯酸或甲基丙烯酸)。
對(duì)于每種轉(zhuǎn)化子，比較以丙烯腈為底物反應(yīng)生成的丙烯酰胺和以甲基丙烯腈為底物反應(yīng)生成的甲基丙烯酰胺的摩爾比，結(jié)果觀察出以下(表152)(表153)(表154)所示的多樣性。丙烯腈與甲基丙烯腈的空間體積相比，甲基丙烯腈為空間體積較大的腈化合物，上述結(jié)果示出，與修飾前的腈水合酶相比較，獲得了底物特異性改變了的修飾酶。
表152

表153

表154

產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可有效用于使用生物催化劑的物質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域中。例如，以稱為腈水合酶的酶或表達(dá)該酶活性的生物體作為催化劑，使腈化合物經(jīng)水合而轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)應(yīng)的酰胺化合物的物質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程。
序列表&lt;110&gt;三井化學(xué)株式會(huì)社.
&lt;120&gt;新型腈水合酶&lt;130&gt;F000286&lt;160&gt;139&lt;210&gt;1&lt;211&gt;205&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..205&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..205&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶α亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶α亞單位″&lt;400&gt;1Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu5 10 15
Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly20 25 30Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn35 40 45Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr50 55 60Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys65 70 75 80Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val85 90 95Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser100 105 110Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu115 120 125Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys130 135 140Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp145 150 155 160Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala165 170 175
Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg180 185 190Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala195 200 205&lt;210&gt;2&lt;211&gt;223&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..223&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..223&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶β亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶β亞單位″&lt;400&gt;2Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile5 10 15
Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val20 25 30Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu35 40 45Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu50 55 60Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly65 70 75 80Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys100 105 110Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro115 120 125Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val130 135 140Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg145 150 155 160Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr165 170 175
Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His180 185 190Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly195 200 205Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu210 215 220Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala225 230 233&lt;210&gt;3&lt;211&gt;618&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..618&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..618&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶α亞單位″
/產(chǎn)物＝″腈水合酶α亞單位″&lt;400&gt;3atgaccgaga acatcctgcg caagtcggac gaggagatcc agaaggagat cacggcgcgg 60gtcaaggccc tggagtcgat gctcatcgaa cagggcatcc tcaccacgtc gatgatcgac 120cggatggccg agatctacga gaacgaggtc ggcccgcacc tcggcgcgaa ggtcgtcgtg 180aaggcctgga ccgacccgga gttcaagaag cgtctgctcg ccgacggcac cgaggcctgc 240aaggagctcg gcatcggcgg cctgcagggc gaggacatga tgtgggtgga gaacaccgac 300gaggtccacc acgtcgtcgt gtgcacgctc tgctcctgct acccgtggcc ggtgctgggg 360ctgccgccga actggttcaa ggagccgcag taccgctccc gcgtggtgcg tgagccccgg 420cagctgctca aggaggagtt cggcttcgag gtcccgccga gcaaggagat caaggtctgg 480gactccagct ccgagatgcg cttcgtcgtc ctcccgcagc gccccgcggg caccgacggg 540tggagcgagg aggagctcgc caccctcgtc acccgcgagt cgatgatcgg cgtcgaaccg 600gcgaaggcgg tcgcgtga618&lt;210&gt;4&lt;211&gt;702&lt;212&gt;DNA
&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..702&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..702&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶β亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶β亞單位″&lt;400&gt;4atgaacggcg tgtacgacgt cggcggcacc gatgggctgg gcccgatcaa ccggcccgcg 60gacgaaccgg tcttccgcgc cgagtgggag aaggtcgcgt tcgcgatgtt cccggcgacg 120ttccgggccg gcttcatggg cctggacgag ttccggttcg gcatcgagca gatgaacccg 180gccgagtacc tcgagtcgcc gtactactgg cactggatcc gcacctacat ccaccacggc 240gtccgcaccg gcaagatcga tctcgaggag ctggagcgcc gcacgcagta ctaccgggag 300aaccccgacg ccccgctgcc cgagcacgag cagaagccgg agttgatcga gttcgtcaac 360caggccgtct acggcgggct gcccgcaagc cgggaggtcg accgaccgcc caagttcaag 420
gagggcgacg tggtgcggtt ctccaccgcg agcccgaagg gccacgcccg gcgcgcgcgg 480tacgtgcgcg gcaagaccgg gacggtggtc aagcaccacg gcgcgtacat ctacccggac 540accgccggca acggcctggg cgagtgcccc gagcacctct acaccgtccg cttcacggcc 600caggagctgt gggggccgga aggggacccg aactccagcg tctactacga ctgctgggag 660ccctacatcg agctcgtcga cacgaaggcg gccgcggcat ga 702&lt;210&gt;5&lt;211&gt;144&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..144&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..144&lt;223&gt;/基因＝″編碼參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)的基因″/產(chǎn)物＝″參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;已知序列以起始密碼子甲硫氨酸開始(INT#MET)&lt;222&gt;1&lt;400&gt;5Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu1 5 10 15Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp20 25 30Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe35 40 45Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln50 55 60Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His65 70 75 80Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala85 90 95Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu100 105 110Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His115 120 125His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser
130 135 140&lt;210&gt;6&lt;211&gt;435&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..435&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..435&lt;223&gt;/基因＝″編碼參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)的基因″/產(chǎn)物＝″參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;已知序列以密碼子開始(int#codon)&lt;222&gt;1..3&lt;400&gt;6gtgagcgccg aggcgaaggt ccgcctgaag cactgcccca cggccgagga ccgggcggcg 60gccgacgcgc tgctcgcgca gctgcccggc ggcgaccgcg cgctcgaccg cggcttcgac 120
gagccgtggc agctgcgggc gttcgcgctg gcggtcgcgg cgtgcagggc gggccggttc 180gagtggaagc agctgcagca ggcgctgatc tcctcgatcg gggagtggga gcgcacccac 240gatctcgacg atccgagctg gtcctactac gagcacttcg tcgccgcgct ggaatccgtg 300ctcggcgagg aagggatcgt cgagccggag gcgctggacg agcgcaccgc ggaggtcttg 360gccaacccgc cgaacaagga tcaccatgga ccgcatctgg agcccgtcgc ggtccacccg 420gccgtgcggt cctga 435&lt;210&gt;7&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;7aacatcatgc gcaagtcg 18&lt;210&gt;8&lt;211&gt;17&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;8gttttcccag tcacgac 17&lt;210&gt;9&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;9ggccagtgcc tagcttacat 20&lt;210&gt;10&lt;211&gt;17&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;10
caggaaacag ctatgac 17&lt;210&gt;11&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;11aacatcacgc gcaagtcg 18&lt;210&gt;12&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;12aacatcgcgc gcaagtcg 18&lt;210&gt;13&lt;211&gt;18
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;13aacatcgtgc gcaagtcg 18&lt;210&gt;14&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;14atcacggtgc gggtcaag 18&lt;210&gt;15&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;15acgtcgttga tcgaccgg 18&lt;210&gt;16&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;16gacggctccg aggcctgc 18&lt;210&gt;17&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;17ctgcaggccg aggacatg18
&lt;210&gt;18&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;18gacgaggccc accacgtc 18&lt;210&gt;19&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;19cacgtcatcg tgtgcacg 18&lt;210&gt;20&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;20aactggtaca aggagccg 18&lt;210&gt;21&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;21gagccggagt accgctcc 18&lt;210&gt;22&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;22cggcaggtgc tcaaggag 18
&lt;210&gt;23&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;23aaggaggact tcggcttc 18&lt;210&gt;24&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;24gagctcacca ccctcgtc 18&lt;210&gt;25&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA
&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;25cgcgagttga tgatcggc 18&lt;210&gt;26&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;26gcgaaggagg tcgcgtga 18&lt;210&gt;27&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;27cggcccgtgg acgaaccg 18&lt;210&gt;28&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;28cccgcgaacg aaccggtc 18&lt;210&gt;29&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;29ctgcccgatc acgagcag 18&lt;210&gt;30
&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;30ctgcccccgc acgagcag 18&lt;210&gt;31&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;31ctgccctcgc acgagcag 18&lt;210&gt;32&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;32ctgccccggc acgagcag 18&lt;210&gt;33&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;33ctgccctgcc acgagcag 18&lt;210&gt;34&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;34ctgcccctgc acgagcag 18
&lt;210&gt;35&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;35ctgcccacgc acgagcag 18&lt;210&gt;36&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;36ttcacggacc aggagctg 18&lt;210&gt;37&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;37ttcacgatcc aggagctg 18&lt;210&gt;38&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;38ttcacggtcc aggagctg 18&lt;210&gt;39&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;39
ttcacggagc aggagctg 18&lt;210&gt;40&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;40ccgaactaca gcgtctac 18&lt;210&gt;41&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;41ctcaccatgt cgatgatc 18&lt;210&gt;42&lt;211&gt;18
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;42aagaagcatc tgctcgcc 18&lt;210&gt;43&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;43gagttcgact tcgaggtc 18&lt;210&gt;44&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;44aaggcgcgcg cgtgagcg 18&lt;210&gt;45&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;45aaggcgaaag cgtgagcg 18&lt;210&gt;46&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;46aaggcgtggg cgtgagcg 18
&lt;210&gt;47&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;47aaggcgaccg cgtgagcg 18&lt;210&gt;48&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;48ggcggcgacg atgggctg 18&lt;210&gt;49&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;49ggcggcgaag atgggctg 18&lt;210&gt;50&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;50ggcggctggg atgggctg 18&lt;210&gt;51&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;51ggcggcggcg atgggctg 18
&lt;210&gt;52&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;52ggcggctacg atgggctg 18&lt;210&gt;53&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;53ggcggctgcg atgggctg 18&lt;210&gt;54&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA
&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;54gagaagggcg cgttcgcg 18&lt;210&gt;55&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;55gcgatgaccc cggcgacg 18&lt;210&gt;56&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;56gcgatggccc cggcgacg 18&lt;210&gt;57&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;57gcgatgctcc cggcgacg 18&lt;210&gt;58&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;58gcgatgatcc cggcgacg 18&lt;210&gt;59
&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;59gcgatggtcc cggcgacg 18&lt;210&gt;60&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;60gcgacggaac gggccggc 18&lt;210&gt;61&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;61gcgacgaccc gggccggc 18&lt;210&gt;62&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;62gcgacggccc gggccggc 18&lt;210&gt;63&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;63gcgacgctcc gggccggc 18
&lt;210&gt;64&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;64gcgacgatcc gggccggc 18&lt;210&gt;65&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;65gcgacggtcc gggccggc 18&lt;210&gt;66&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;66ggcttcgggg gcctggac 18&lt;210&gt;67&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;67ggcttctatg gcctggac 18&lt;210&gt;68&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;68
ggcttcctgg gcctggac 18&lt;210&gt;69&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;69ggcttcaagg gcctggac 18&lt;210&gt;70&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;70ggcttcgatg gcctggac 18&lt;210&gt;71&lt;211&gt;18
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;71atgggcgggg acgagttc 18&lt;210&gt;72&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;72atgggcgcgg acgagttc 18&lt;210&gt;73&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;73atgggcgtgg acgagttc 18&lt;210&gt;74&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;74atgggctcgg acgagttc 18&lt;210&gt;75&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;75atgggcacgg acgagttc 18
&lt;210&gt;76&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;76atgggccggg acgagttc 18&lt;210&gt;77&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;77gacgaggccc ggttcggc18&lt;210&gt;78&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;78gacgagtccc ggttcggc 18&lt;210&gt;79&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;79tggcacttta tccgcacc 18&lt;210&gt;80&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;80atcgaggccg tcaaccag 18
&lt;210&gt;81&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;81atcgagctcg tcaaccag18&lt;210&gt;82&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;82atcgagctcg tcaaccag 18&lt;210&gt;83&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA
&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;83atcgaggtcg tcaaccag 18&lt;210&gt;84&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;84ggcggggcgc ccgcaagc18&lt;210&gt;85&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;85ggcggggtgc ccgcaagc 18&lt;210&gt;86&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;86ggcgggtcgc ccgcaagc 18&lt;210&gt;87&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;87gtggtggggt tctccacc 18&lt;210&gt;88
&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;88cgcgcgctgt acgtgcgc 18&lt;210&gt;89&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;89cgcgcgtggt acgtgcgc 18&lt;210&gt;90&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;90aacggcgagg gcgagtgc 18&lt;210&gt;91&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;91aacggcgatg gcgagtgc 18&lt;210&gt;92&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;92aacggcaagg gcgagt gc18
&lt;210&gt;93&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;93aacggccggg gcgagtgc 18&lt;210&gt;94&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;94aacggcaacg gcgagtgc 18&lt;210&gt;95&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;95aacggctcgg gcgagtgc 18&lt;210&gt;96&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;96aacggcgggg gcgagtgc 18&lt;210&gt;97&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;97
tactacggct gctgggag18&lt;210&gt;98&lt;211&gt;205&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..205&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..205&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶α亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶α亞單位″&lt;400&gt;98Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu5 10 15Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly20 25 30Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn35 40 45
Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr50 55 60Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys65 70 75 80Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val85 90 95Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser100 105 110Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu115 120 125Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys130 135 140Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp145 150 155 160Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala165 170 175Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg180 185 190Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala
195 200 205&lt;210&gt;99&lt;211&gt;223&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..223&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..223&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶β亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶β亞單位″&lt;400&gt;99Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile5 10 15Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val20 25 30Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu35 40 45
Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu50 55 60Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly65 70 75 80Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln85 90 95Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys100 105 110Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro115 120 125Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val130 135 140Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg145 150 155 160Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr165 170 175Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His180 185 190Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly
195 200 205Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu210 215 220Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala225 230 233&lt;210&gt;100&lt;211&gt;618&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..618&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..618&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶α亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶α亞單位″&lt;400&gt;100atgaccgaga acatcctgcg caagtcggac gaggagatcc agaaggagat cacggcgcgg 60
gtcaaggccc tggagtcgat gctcatcgaa cagggcatcc tcaccacgtc gatgatcgac 120cggatggccg agatctacga gaacgaggtc ggcccgcacc tcggcgcgaa ggtcgtcgtg 180aaggcctgga ccgacccgga gttcaagaag cgtctgctcg ccgacggcac cgaggcctgc 240aaggagctcg gcatcggcgg cctgcagggc gaggacatga tgtgggtgga gaacaccgac 300gaggtccacc acgtcgtcgt gtgcacgctc tgctcctgct acccgtggcc ggtgctgggg 360ctgccgccga actggttcaa ggagccgcag taccgctccc gcgtggtgcg tgagccccgg 420cagctgctca aggaggagtt cggcttcgag gtcccgccga gcaaggagat caaggtctgg 480gactccagct ccgagatgcg cttcgtcgtc ctcccgcagc gccccgcggg caccgacggg 540tggagcgagg aggagctcgc caccctcgtc acccgcgagt cgatgatcgg cgtcgaaccg 600gcgaaggcgg tcgcgtga 618&lt;210&gt;101&lt;211&gt;702&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..702
&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..702&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶β亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶β亞單位″&lt;400&gt;101atgaacggcg tgtacgacgt cggcggcacc gatgggctgg gcccgatcaa ccggcccgcg 60gacgaaccgg tcttccgcgc cgagtgggag aaggtcgcgt tcgcgatgtt cccggcgacg 120ttccgggccg gcttcatggg cctggacgag ttccggttcg gcatcgagca gatgaacccg 180gccgagtacc tcgagtcgcc gtactactgg cactggatcc gcacctacat ccaccacggc 240gtccgcaccg gcaagatcga tctcgaggag ctggagcgcc gcacgcagta ctaccgggag 300aaccccgacg ccccgctgcc cgagcacgag cagaagccgg agttgatcga gttcgtcaac 360caggccgtct acggcgggct gcccgcaagc cgggaggtcg accgaccgcc caagttcaag 420gagggcgacg tggtgcggtt ctccaccgcg agcccgaagg gccacgcccg gcgcgcgcgg 480tacgtgcgcg gcaagaccgg gacggtggtc aagcaccacg gcgcgtacat ctacccggac 540accgccggca acggcctggg cgagtgcccc gagcacctct acaccgtccg cttcacggcc 600
caggagctgt gggggccgga aggggacccg aactccagcg tctactacga ctgctgggag 660ccctacatcg agctcgtcga cacgaaggcg gccgcggcat ga702&lt;210&gt;102&lt;211&gt;144&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..144&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..144&lt;223&gt;/基因＝″編碼參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)的基因″/產(chǎn)物＝″參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;已知序列以起始密碼子甲硫氨酸開始(INT#MET)&lt;222&gt;1&lt;400&gt;102
Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu1 5 10 15Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp20 25 30Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe35 40 45Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln50 55 60Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His65 70 75 80Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala85 90 95Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu100 105 110Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His115 120 125His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser130 135 140&lt;210&gt;103
&lt;211&gt;435&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;嗜熱假諾卡氏菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..435&lt;223&gt;/微生物＝″嗜熱假諾卡氏菌″/菌株＝″JCM3095″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..435&lt;223&gt;/基因＝″編碼參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)的基因″/產(chǎn)物＝″參與腈水合酶激活的蛋白質(zhì)″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;已知序列以密碼子開始(init_codon)&lt;222&gt;1..3&lt;220&gt;
&lt;221&gt;g or a&lt;222&gt;1..1&lt;400&gt;103rtgagcgccg aggcgaaggt ccgcctgaag cactgcccca cggccgagga ccgggcggcg 60gccgacgcgc tgctcgcgca gctgcccggc ggcgaccgcg cgctcgaccg cggcttcgac 120gagccgtggc agctgcgggc gttcgcgctg gcggtcgcgg cgtgcagggc gggccggttc 180
gagtggaagc agctgcagca ggcgctgatc tcctcgatcg gggagtggga gcgcacccac 240gatctcgacg atccgagctg gtcctactac gagcacttcg tcgccgcgct ggaatccgtg 300ctcggcgagg aagggatcgt cgagccggag gcgctggacg agcgcaccgc ggaggtcttg 360gccaacccgc cgaacaagga tcaccatgga ccgcatctgg agcccgtcgc ggtccacccg 420gccgtgcggt cctga435&lt;210&gt;104&lt;211&gt;1315&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;紫紅紅球菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;來(lái)源&lt;222&gt;1..1315&lt;223&gt;/微生物＝″紫紅紅球菌″/菌株＝″J1(FERM BP-1478)″&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;1..690&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶β亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶β亞單位″
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;704..1315&lt;223&gt;/基因＝″腈水合酶α亞單位″/產(chǎn)物＝″腈水合酶α亞單位″&lt;400&gt;104atg gat ggt atc cac gac aca ggc ggc atg acc gga tac gga ccg gtc 48Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val1 5 10 15ccc tat cag aag gac gag ccc ttc ttc cac tac gag tgg gag ggt cgg 96Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg20 25 30acc ctg tca att ctg act tgg atg cat ctc aag ggc ata tcg tgg tgg 144Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp35 40 45gac aag tcg cgg ttc ttc cgg gag tcg atg ggg aac gaa aac tac gtc 192Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val50 55 60aac gag att cgc aac tcg tac tac acc cac tgg ctg agt gcg gca gaa 240Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu65 70 75 80cgt atc ctc gtc gcc gac aag atc atc acc gaa gaa gag cga aag cac 288Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His
85 90 95cgt gtg caa gag atc ctt gag ggt cgg tac acg gac agg aag ccg tcg336Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Serl00 105 110cgg aag ttc gat ccg gcc cag atc gag aag gcg atc gaa cgg ctt cac384Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His115 120 125gag ccc cac tcc cta gcg ctt cca gga gcg gag ccg agt ttc tct ctc432Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu130 135 140ggt gac aag atc aaa gtg aag agt atg aac ccg ctg gga cac aca cgg480Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg145 150 155 160tgc ccg aaa tat gtg cgg aac aag atc ggg gaa atc gtc gcc tac cac528Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His165 170 175ggc tgc cag atc tat ccc gag agc agc tcc gcc ggc ctc ggc gac gat576Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp180 185 190cct cgc ccg ctc tac acg gtc gcg ttt tcc gcc cag gaa ctg tgg ggc624Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly195 200 205
gac gac gga aac ggg aaa gac gta gtg tgc gtc gat ctc tgg gaa ccg 672Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro210 215 220tac ctg atc tct gcg tga aaggaatacg ata gtg agc gag cac gtc aat720Tyr Leu Ile Ser Ala*** Met Ser Glu His Val Asn225 29 1 5aag tac acg gag tac gag gca cgt acc aag gcg atc gaa acc ttg ctg 768Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys Ala Ile Glu Thr Leu Leu10 15 20tac gag cga ggg ctc atc acg ccc gcc gcg gtc gac cga gtc gtt tcg 816Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala Val Asp Arg Val Val Ser25 30 35tac tac gag aac gag atc ggc ccg atg ggc ggt gcc aag gtc gtg gcc 864Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly Gly Ala Lys Val Val Ala40 45 50aag tcc tgg gtg gac cct gag tac cgc aag tgg ctc gaa gag gac gcg 912Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys Trp Leu Glu Glu Asp Ala55 60 65 70acg gcc gcg atg gcg tca ttg ggc tat gcc ggt gag cag gca cac caa 960Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala Gly Glu Gln Ala His Gln75 80 85
att tcg gcg gtc ttc aac gac tcc caa acg cat cac gtg gtg gtg tgc1008Ile Ser A1a Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr His His Val Val Val Cys90 95 100act ctg tgt tcg tgc tat ccg tgg ccg gtg ctt ggt ctc ccg ccc gcc1056Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ala105 110 115tgg tac aag agc atg gag tac cgg tcc cga gtg gta gcg gac cct cgt1104Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg Val Val Ala Asp Pro Arg120 125 130gga gtg ctc aag cgc gat ttc ggt ttc gac atc ccc gat gag gtg gag1152Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp Ile Pro Asp Glu Val Glu135 140 145 150gtc agg gtt tgg gac agc agc tcc gaa atc cgc tac atc gtc atc ccg1200Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile Arg Tyr Ile Val Ile Pro155 160 165gaa cgg ccg gcc ggc acc gac ggt tgg tcc gag gag gag ctg acg aag1248Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Thr Lys170 175 180ctg gtg agc cgg gac tcg atg atc ggt gtc agt aat gcg ctc aca ccg1296Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ser Asn Ala Leu Thr Pro185 190 195cag gaa gtg atc gta tga1315Gln Glu Val Ile Val***
200 203&lt;210&gt;105&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;105ccggaattcg aaaggaatga ggaaatgga 29&lt;210&gt;106&lt;211&gt;28&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;106aaaaagtact catacgatca cttcctgc 28&lt;210&gt;107&lt;211&gt;17
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;107gttttcccag tcacgac 17&lt;210&gt;108&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;108ggccagtgcc tagcttacat 20&lt;210&gt;109&lt;211&gt;17&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;109caggaaacag ctatgac 17&lt;210&gt;110&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;14..16&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;110gggcatatcg tggnnngaca agtcgcggt 29&lt;210&gt;111&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;111ctcaccnnnt cgatgatc 18&lt;210&gt;112&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;112tacgagnnng aggtcggc 18&lt;210&gt;113&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;113
aagaagnnnc tgctcgcc 18&lt;210&gt;114&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;114gagttcnnnt tcgaggtc 18&lt;210&gt;115&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;115ctcgccnnnc tcgtcact 18
&lt;210&gt;116&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;116aaggcgnnng cgtgagcg 18&lt;210&gt;117&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;117ggcggcnnng atgggctg 18
&lt;210&gt;118&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;118gagaagnnng cgttcgcg 18&lt;210&gt;119&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;119aaggtcnnnt tcgcgatg 18
&lt;210&gt;120&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;120gcgatgnnnc cggcgacg18&lt;210&gt;121&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;121ccggcgnnnt tccgggcc18&lt;210&gt;122
&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;122gcgacgnnnc gggccggc18&lt;210&gt;123&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;123ggcttcnnng gcctggac18&lt;210&gt;124&lt;211&gt;18
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;124atgggcnnng acgagttc18&lt;210&gt;125&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;125gacgagnnnc ggttcggc18&lt;210&gt;126&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA
&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;126aacccgnnng agtacctc18&lt;210&gt;127&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;127tggcacnnna tccgcacc18&lt;210&gt;128&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;128gagcagnnnc cggagttg18&lt;210&gt;129&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;129atcgagnnng tcaaccag18&lt;210&gt;130&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;130ggcgggnnnc ccgcaagc18&lt;210&gt;131&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;131gtggtgnnnt tctccacc18&lt;210&gt;132&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;132tccaccnnna gcccgaag18&lt;210&gt;133&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;133cgcgcgnnnt acgtgcgc18&lt;210&gt;134&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意
&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;134accgggnnng tggtcaag18&lt;210&gt;135&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;135gtggtcnnnc accacggc18&lt;210&gt;136&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9
&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;136ggcgcgnnna tctacccg18&lt;210&gt;137&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;137aacggcnnng gcgagtgc18&lt;210&gt;138&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物
&lt;400&gt;138tactacnnnt gctgggag18&lt;210&gt;139&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
&lt;221&gt;任意&lt;222&gt;7..9&lt;223&gt;低聚核苷酸作為PCR引物&lt;400&gt;139tacgacnnnt gggagccc18
權(quán)利要求
1.一種腈水合酶，是具有α亞單位及β亞單位的腈水合酶，其特征為，所述α亞單位具有下述氨基酸序列，該氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列中第36、71、148、及204位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、及203位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的腈水合酶，其特征為，所述β亞單位具有序列表的序列號(hào)2記載的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的腈水合酶，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
5.如權(quán)利要求4所述的腈水合酶，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列中第20、21、108、200、及212位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的腈水合酶，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述β亞單位及所述α亞單位中至少其一所具有的所述氨基酸序列中的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
7.一種腈水合酶，是具有α亞單位及β亞單位的腈水合酶，其特征為，所述β亞單位具有下述氨基酸序列，該氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)2記載的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的。
8.如權(quán)利要求7所述的腈水合酶，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列中第20、21、108、200、及212位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
9.如權(quán)利要求7或8所述的腈水合酶，其特征為，所述α亞單位具有序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的腈水合酶，其特征為，所述α亞單位的第36、71、148、及204位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被置換為其它氨基酸。
11.如權(quán)利要求10所述的腈水合酶，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、及203位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
12.如權(quán)利要求7～11中任一項(xiàng)所述的腈水合酶，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述α亞單位及所述β亞單位中的至少其一所具有的所述氨基酸序列中所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
13.一種基因，是編碼腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列的基因，其特征為，所述氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列中第36、71、148、及204位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求13所述的基因，其特征為，所述氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、及203位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
15.如權(quán)利要求13或14所述的基因，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述α亞單位的氨基酸序列所具有的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
16.如權(quán)利要求13所述的基因，其特征為，該基因具有下述堿基序列，該堿基序列是將序列表的序列號(hào)3記載的堿基序列中從第106到第108位、從第211到第213位、從第442到第444位、及從第610到第612位中的任一個(gè)或一個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到的。
17.如權(quán)利要求16所述的基因，其特征為，所述堿基序列中從第16到第18位、從第55到第57位、從第112到第114位、從第229到第231位、從第268到第270位、從第304到第306位、從第316到第318位、從第376到第378位、從第388到第390位、從第424到第426位、從第436到第438位、從第559到第561位、從第580到第582位、及從第607到第609位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列被進(jìn)一步置換為其它的堿基序列。
18.一種基因，是編碼腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列的基因，其特征為，所述氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)2記載的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的基因，其特征為，所述氨基酸序列中第20、21、108、200、及212位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
20.如權(quán)利要求18或19所述的基因，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述β亞單位的氨基酸序列所具有的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
21.如權(quán)利要求18所述的基因，其特征為，該基因具有下述堿基序列，該堿基序列是將序列表的序列號(hào)4記載的堿基序列中從第28到第30位、從第94到第96位、從第109到第111位、從第121到第123位、從第136到第138位、從第142到第144位、從第151到第153位、從第214到第216位、從第352到第354位、從第379到第381位、從第436到第438位、從第478到第480位、從第556到第558位、及從第649到第651位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列置換為其它堿基序列而得到的。
22.如權(quán)利要求21所述的基因，其特征為，所述堿基序列中從第58到第60位、從第61到第63位、從第322到第324位、從第598到第600位、及從第634到第636位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列被進(jìn)一步置換為其它堿基序列。
23.一種編碼腈水合酶的基因，所述基因具有編碼腈水合酶α亞單位的氨基酸序列的基因和編碼腈水合酶β亞單位的氨基酸序列的基因，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列的第36、71、148、及204位氨基酸中任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的。
24.如權(quán)利要求23所述的基因，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列的第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、及203位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
25.如權(quán)利要求23或24所述的基因，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述α亞單位的氨基酸序列所具有的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
26.如權(quán)利要求23所述的基因，其特征為，所述編碼α亞單位的氨基酸序列的基因具有下述堿基序列，該堿基序列是將序列表的序列號(hào)3記載的堿基序列中從第106到第108位、從第211到第213位、從第442到第444位、及從第610到第612位的任一個(gè)或一個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到的堿基序列。
27.如權(quán)利要求26所述的基因，其特征為，所述堿基序列中從第16到第18位、從第55到第57位、從第112到第114位、從第229到第231位、從第268到第270位、從第304到第306位、從第316到第318位、從第376到第378位、從第388到第390位、從第424到第426位、從第436到第438位、從第559到第561位、從第580到第582位、及從第607到第609位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列被進(jìn)一步置換為其它的堿基序列。
28.如權(quán)利要求23～27中任一項(xiàng)所述的基因，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列為序列表的序列號(hào)2記載的氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求23～27中任一項(xiàng)所述的基因，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列是將所述序列號(hào)2記載的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
30.如權(quán)利要求29所述的基因，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列中第20、21、108、200、及212位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
31.如權(quán)利要求29或30所述的基因，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述β亞單位的氨基酸序列所具有的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
32.如權(quán)利要求28所述的基因，其特征為，編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有序列表的序列號(hào)4記載的堿基序列。
33.如權(quán)利要求29所述的基因，其特征為，編碼所述β亞單位的氨基酸序列的基因具有下述堿基序列，該堿基序列是將序列表的序列號(hào)4記載的堿基序列中從第28到第30位、從第94到第96位、從第109到第111位、從第121到第123位、從第136到第138位、從第142到第144位、從第151到第153位、從第214到第216位、從第352到第354位、從第379到第381位、從第436到第438位、從第478到第480位、從第556到第558位、及從第649到第651位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列置換為其它堿基序列而得到的堿基序列。
34.如權(quán)利要求33所述的基因，其特征為，所述堿基序列中從第58到第60位、從第61到第63位、從第322到第324位、從第598到第600位、及從第634到第636位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列被進(jìn)一步置換為其它堿基序列。
35.一種編碼腈水合酶的基因，所述基因具有編碼腈水合酶α亞單位的氨基酸序列的基因和編碼腈水合酶β亞單位的氨基酸序列的基因，其特征為，所述β亞單位的氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)2記載的氨基酸序列中第10、32、37、41、46、48、51、72、118、127、146、160、186、及217位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
36.如權(quán)利要求35所述的基因，其特征為，所述氨基酸序列中第20、21、108、200、及212位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
37.如權(quán)利要求35或36所述的基因，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述β亞單位的氨基酸序列所具有的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
38.如權(quán)利要求35所述的基因，其特征為，編碼所述β亞單位的氨基酸序列的堿基序列是下述堿基序列，該堿基序列是將序列表的序列號(hào)4記載的堿基序列中從第28到第30位、從第94到第96位、從第109到第111位、從第121到第123位、從第136到第138位、從第142到第144位、從第151到第153位、從第214到第216位、從第352到第354位、從第379到第381位、從第436到第438位、從第478到第480位、從第556到第558位、及從第649到第651位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列置換為其它堿基序列而得到的堿基序列。
39.如權(quán)利要求38所述的基因，其特征為，所述堿基序列中從第58到第60位、從第61到第63位、從第322到第324位、從第598到第600位、及從第634到第636位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列被進(jìn)一步置換為其它堿基序列。
40.如權(quán)利要求35～39中任一項(xiàng)所述的基因，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列具有序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列。
41.如權(quán)利要求35～39中任一項(xiàng)所述的基因，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列是將序列表的序列號(hào)1記載的氨基酸序列的第36、71、148、及204位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
42.如權(quán)利要求41所述的基因，其特征為，所述α亞單位的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、及203位氨基酸中的任一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被進(jìn)一步置換為其它氨基酸。
43.如權(quán)利要求41或42所述的基因，其特征為，在不損害腈水合酶活性的范圍之內(nèi)，在所述α亞單位的氨基酸序列所具有的所述氨基酸置換位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上，有一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、插入或缺失。
44.如權(quán)利要求40所述的基因，其特征為，編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有序列表的序列號(hào)3記載的堿基序列。
45.如權(quán)利要求41所述的基因，其特征為，編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有下述堿基序列，該堿基序列是將序列表的序列號(hào)3記載的堿基序列中從第106到第108位、從第211到第213位、從第442到第444位、及從第610到第612位中的任一個(gè)或一個(gè)以上堿基序列置換為其它堿基序列而得到的堿基序列。
46.如權(quán)利要求45所述的基因，其特征為，所述堿基序列中從第16到第18位、從第55到第57位、從第112到第114位、從第229到第231位、從第268到第270位、從第304到第306位、從第316到第318位、從第376到第378位、從第388到第390位、從第424到第426位、從第436到第438位、從第559到第561位、從第580到第582位、及從第607到第609位中的任一個(gè)或一個(gè)以上的堿基序列被進(jìn)一步置換為其它的堿基序列。
47.一種質(zhì)粒，其特征為，該質(zhì)粒中含有編碼權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)所述的腈水合酶的基因。
48.如權(quán)利要求47所述的質(zhì)粒，其特征為，編碼所述腈水合酶的α亞單位的基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄刑?hào)3記載的堿基序列、或者為權(quán)利要求13～17中任一項(xiàng)所述的基因。
49.如權(quán)利要求47或48所述的質(zhì)粒，其特征為，編碼所述腈水合酶的β亞單位的基因?yàn)樾蛄斜淼男蛄刑?hào)4記載的堿基序列、或者為權(quán)利要求18～22中任一項(xiàng)所述的基因。
50.一種質(zhì)粒，其特征為，該質(zhì)粒中含有權(quán)利要求23～46中任一項(xiàng)所述的編碼腈水合酶的基因。
51.如權(quán)利要求47～50中任一項(xiàng)所述的質(zhì)粒，其特征為，該質(zhì)粒具有在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述腈水合酶所需的結(jié)構(gòu)。
52.一種轉(zhuǎn)化子，是利用權(quán)利要求51所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化子。
53.一種生產(chǎn)腈水合酶的方法，其特征為該方法含有下述步驟，即，將權(quán)利要求52所述的轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，基于所述轉(zhuǎn)化子中所述質(zhì)粒具有的腈水合酶基因生產(chǎn)腈水合酶的步驟。
54.如權(quán)利要求53所述的生產(chǎn)方法，其特征為，該方法進(jìn)一步含有從所述培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化子、培養(yǎng)液、及其處理物中回收腈水合酶的步驟。
55.一種制備腈化合物的方法，是通過(guò)在水性介質(zhì)中使腈化合物與腈水合酶接觸而得到對(duì)應(yīng)的腈化合物的制備方法，其特征為，所述腈水合酶為權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)所述的腈水合酶。
56.一種修飾方法，是在具有腈水合酶活性的酶中，經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中的任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述步驟為(a)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列及序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比；(b)根據(jù)對(duì)比的結(jié)果確定與下述區(qū)域?qū)?yīng)的氨基酸殘基，所述區(qū)域?yàn)樾蛄斜淼男蛄刑?hào)98記載的氨基酸序列中從第36位的蘇氨酸到第48位的天冬酰胺的區(qū)域、序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中從第31位的賴氨酸到第51位的苯丙氨酸的區(qū)域、以及從第112位的賴氨酸到第127位的亮氨酸的區(qū)域；(c)對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
57.一種修飾方法，是在具有腈水合酶活性的酶中，經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理，從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述步驟為(d)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列及序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比；(e)根據(jù)對(duì)比的結(jié)果確定與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中第36、48、71、148、188、204位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基、與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第10、32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127、146、150、160、168、171、176、186、217、218位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基；(f)對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
58.一種修飾方法，是在具有腈水合酶活性的酶中，經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述步驟為(g)基于PDB(Protein Data Bank)號(hào)1IRE中記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(h)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中的以下結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)區(qū)域的氨基酸殘基A鏈(Chain 1IREA)N末端算起第2個(gè)螺旋、B鏈(Chain 1IREB)N末端算起第1個(gè)螺旋、第2個(gè)螺旋、及夾在其間的環(huán)狀部分和C末端算起第3個(gè)螺旋；(i)對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
59.一種修飾方法，是在具有腈水合酶活性的酶中，經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理，從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述步驟為(j)基于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(k)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中以下位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的4個(gè)氨基酸殘基A鏈N末端算起第89位氨基酸殘基的谷氨酰胺、第165位氨基酸殘基的谷氨酸；以及B鏈N末端算起第37位氨基酸殘基的苯丙氨酸、第48位氨基酸的亮氨酸；(1)確定下述氨基酸殘基，所述氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子位于立體結(jié)構(gòu)中半徑為5_的范圍中，所述立體結(jié)構(gòu)以上述確定的4個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈前端重原子為各自的中心點(diǎn)；(m)對(duì)上述1中確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
60.一種修飾方法，是在具有腈水合酶活性的酶中，經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上的位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理，從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述步驟為(n)基于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(o)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定形成下述孔穴的區(qū)域，所述孔穴是底物從酶外部進(jìn)入活性中心時(shí)、或產(chǎn)物從活性中心移至酶外部時(shí)通過(guò)的孔穴；(p)在構(gòu)成確定的區(qū)域的氨基酸殘基中，確定因其變更而使孔穴尺寸發(fā)生變化、從而控制底物/產(chǎn)物通過(guò)的難易程度的氨基酸殘基；(q)對(duì)上述p中確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
61.一種修飾方法，是在具有腈水合酶活性的酶中，經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理，從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述步驟為(r)基于PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，推定修飾前的具有腈水合酶活性的酶的立體結(jié)構(gòu)；(s)根據(jù)推定的立體結(jié)構(gòu)確定與PDB號(hào)1IRE記載的腈水合酶立體結(jié)構(gòu)中以下位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的4個(gè)氨基酸殘基A鏈N末端算起第89位氨基酸的谷氨酰胺(A89Q)、第165位氨基酸的谷氨酸(A165E)；以及B鏈N末端算起第37位氨基酸的苯丙氨酸(B37F)、第48位氨基酸的亮氨酸(B48L)；(t)規(guī)定對(duì)應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d1、對(duì)應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d2、對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d3，確定使d1～d3中的1個(gè)或1個(gè)以上發(fā)生變化的氨基酸殘基；(u)對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
62.如權(quán)利要求61所述的修飾方法，其中，(t)的步驟為如下(t’)所述的步驟(t’)規(guī)定對(duì)應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d1、對(duì)應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d2、對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B48L的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d3、對(duì)應(yīng)于A165E的氨基酸殘基和對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d4、對(duì)應(yīng)于A89Q的氨基酸殘基與對(duì)應(yīng)于B37F的氨基酸殘基之間的最短重原子間距為d5，確定使d1～d5中的1個(gè)或1個(gè)以上發(fā)生變化的氨基酸殘基。
63.如權(quán)利要求56～62中任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征為，修飾前的具有腈水合酶活性的酶含有下述[A]和[B]所述的2種多肽[A]由與序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列有40％或40％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽；[B]由與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列有25％或25％以上同源性的氨基酸序列形成的多肽。
64.如權(quán)利要求63所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[C]所述的多肽，[B]所述的多肽為下述[D]所述的多肽，[C]由下述任一種氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列；對(duì)序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中的至少一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入、或缺失處理而得到的氨基酸序列；將序列表的序列號(hào)98記載的氨基酸序列中第6、19、38、77、90、102、106、126、130、142、146、187、194、203位氨基酸中的至少一個(gè)氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。[D]由下述任一種氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列；對(duì)序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中的至少一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入、或缺失處理而得到的氨基酸序列；將序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第20、21、108、200、212位氨基酸中的至少一個(gè)氨基酸置換為其它氨基酸而得到的氨基酸序列。
65.如權(quán)利要求63所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[E]中所述的多肽，[B]所述的多肽為下述[F]中所述的多肽，[E]由與下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為，序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第704位到第1315位堿基形成的開放讀碼框ORF所編碼的氨基酸序列；[F]由與下述氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的多肽，所述氨基酸序列為，序列表的序列號(hào)104記載的堿基序列中從第1位到第680位堿基形成的ORF所編碼的氨基酸序列。
66.一種修飾方法，是對(duì)修飾前的具有腈水合酶活性的酶經(jīng)以下步驟確定特定的氨基酸殘基，并對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理，從而改變所述酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性中的任1種或1種以上性質(zhì)的修飾方法，所述修飾前的具有腈水合酶活性的酶的特征為，作為其構(gòu)成要素含有的2種多肽中，一種多肽為權(quán)利要求65中[E]所述的多肽，另一種多肽為權(quán)利要求65中[F]所述的多肽，所述步驟為(d’)將修飾前的具有腈水合酶活性的酶的氨基酸序列與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，(e’)根據(jù)對(duì)比的結(jié)果確定與序列表的序列號(hào)99記載的氨基酸序列中第48、51位對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，(f’)對(duì)確定的氨基酸殘基中的一個(gè)或一個(gè)以上位點(diǎn)進(jìn)行置換、插入或缺失處理。
67.如權(quán)利要求63所述的修飾方法，其特征為，[A]所述的多肽為下述[G]中所述的多肽，[G]含有以氨基酸序列X1CXLC1SC2X2X3X4X5表示的區(qū)域的多肽，其中C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinic acid、3-sulfinoalanine)，S表示絲氨酸，C2表示半胱次磺酸(cysteine sulfenic acid、S-hydroxy-cysteine)，X1、X2、X3、X4、X5表示任意氨基酸。
68.如權(quán)利要求67所述的修飾方法，其特征為，所述序列中X1表示纈氨酸，X4表示色氨酸，X5表示脯氨酸。
69.如權(quán)利要求68所述的修飾方法，其特征為，所述序列中X2表示酪氨酸，X3表示脯氨酸。
70.如權(quán)利要求67～69中任一項(xiàng)所述的修飾方法，其特征為，通過(guò)X1CXLC1SC2X2X3X4X5表示的結(jié)構(gòu)區(qū)域與金屬原子結(jié)合。
71.如權(quán)利要求70所述的修飾方法，其特征為，所述金屬原子為鈷原子。
72.一種修飾酶，其特征為，所述修飾酶是采用權(quán)利要求56～71中任一項(xiàng)所述的修飾方法而得到的。
73.一種編碼權(quán)利要求72所述修飾酶的基因。
74.一種質(zhì)粒，其特征為，所述質(zhì)粒含有權(quán)利要求73所述的基因。
75.一種轉(zhuǎn)化子，其特征為，所述轉(zhuǎn)化子是利用權(quán)利要求73所述的基因或權(quán)利要求74所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物而得到的。
76.一種制備修飾酶的方法，其特征為，所述方法包含從權(quán)利要求75所述轉(zhuǎn)化子經(jīng)培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、或其處理物中回收修飾酶的步驟。
77.一種制備酰胺化合物的方法，其特征為，所述方法包含以下步驟使培養(yǎng)權(quán)利要求75所述轉(zhuǎn)化子而得到的培養(yǎng)液、細(xì)胞、或其處理物、或者由權(quán)利要求76所述的制備方法得到的修飾酶與腈化合物在溶劑中接觸，從而將該腈化合物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物。
全文摘要
本發(fā)明的目的為提供一種具有新型突變位點(diǎn)的腈水合酶的氨基酸序列及其基因的堿基序列，另外本發(fā)明的目的還在于提供一種對(duì)具有腈水合酶活性的酶進(jìn)行修飾的方法。作為解決目前問(wèn)題的方法，提供了在來(lái)源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095、由2種異源亞單位構(gòu)成的腈水合酶中引入新型突變而得到的突變體的氨基酸序列及其基因的堿基序列。而且，通過(guò)確定腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)/氨基酸序列中作為修飾對(duì)象的區(qū)域，并對(duì)與形成所述區(qū)域的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進(jìn)行置換、插入、缺失等改變從而修飾腈水合酶。通過(guò)本發(fā)明，能夠比現(xiàn)有技術(shù)更高效率地將腈化合物轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酰胺化合物。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1729288SQ20038010699
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者八卷俊文, 番場(chǎng)伸一, 的石香, 伊藤潔, 小林英樹, 田中英司, 及川利洋 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社