專(zhuān)利名稱(chēng)：石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害的診斷試劑盒及檢測(cè)方法，主要是針對(duì)石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)基因診斷的試劑盒及檢測(cè)方法。
早期快速診斷石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)是目前石斑魚(yú)養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少石斑魚(yú)損失的有效途徑，因此，簡(jiǎn)便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法是廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù))，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快被應(yīng)用于實(shí)踐中。
本發(fā)明的石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的基因診斷試劑盒包括下列部件1).RNA提取液A液，2管，內(nèi)裝Trizol液；2).B液，1管，內(nèi)裝氯仿；3).C液，1管，內(nèi)裝異戊醇；4).D液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝DEPC水；6).RT反應(yīng)液F液，1管，內(nèi)裝RT反應(yīng)液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑RNAsin RI、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT；7).RT-PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝RT-PCR反應(yīng)液，包括10×Buffer(含mg2+)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH2O和TaqE；8).陽(yáng)性對(duì)照H液，1管，內(nèi)裝VNNV陽(yáng)性模板；9).盒子；10).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于這些小孔中。
上述VNNV基因診斷試劑盒中所述的內(nèi)外兩對(duì)引物是根據(jù)VNNV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的，其DNA序列分別如下F15’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CTR15’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA用本發(fā)明上述試劑盒檢測(cè)石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的方法，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品加A液稀釋稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿，室溫靜置3～5min；2).在上述勻漿液中加入200μlB液，上下顛倒混勻，靜置5～10min；3).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；4).取400μl上清，加入到500μlC液中，輕輕晃動(dòng)，靜置10～15min；5).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；6).棄上清，用1ml預(yù)冷的D液洗滌2次，4℃，7500～10000r/min離心5～10min；7).空氣干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干，加50μlE液水溶解(若不能完全溶解可于55～60℃放置10～15min)，得到RNA提取液(可于-20℃保存)；8).RNA提取液在95℃預(yù)熱5～10min；9).取2μl預(yù)熱的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反應(yīng)模板；10).分別取模板和H液加入到G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR儀上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 10min預(yù)變性，→94℃40sec 35個(gè)循環(huán)→72℃7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在426bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽(yáng)性對(duì)照在同一位置)，則為VNNV陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品攜帶病毒性神經(jīng)壞死病毒，否則為陰性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法，是以根據(jù)VNNV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物為主體而設(shè)計(jì)的。利用該兩對(duì)引物，可以特異性地?cái)U(kuò)增攜帶VNNV病毒的待測(cè)樣品的有關(guān)基因片段，所建立優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系保證檢測(cè)結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此使用本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法，可以簡(jiǎn)便、快速、靈敏而特異地檢測(cè)感染VNNV的石斑魚(yú)，大大高于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)方法，可運(yùn)用于石斑魚(yú)各時(shí)期養(yǎng)殖過(guò)程中的病毒跟蹤檢測(cè)，也可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
實(shí)施例1石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的基因診斷試劑盒1.RNA提取液(A液)，2管，5ml/管，內(nèi)裝Trizol液。2.B液，自備，主要為氯仿，200μl/份×10份，共2ml。3.C液，自備，主要為異戊醇，500μl/份×10份，共5ml。4.D液，自備，主要為70％乙醇，1ml/份×10份，共10ml。5.E液，1管，0.5ml/管，內(nèi)裝DEPC水。6.RT反應(yīng)液(F液)，1管，0.1ml/管，內(nèi)裝RT反應(yīng)液(10μl體系)，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑RNAsin(RI)、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RT)。7.RT-PCR反應(yīng)液(G液)，1管，0.5ml/管，內(nèi)裝RT-PCR反應(yīng)液(50μl體系)，包括10×Buffer(含mg2+)、dNTP、正向引物、反向引物、ddH2O和TaqE。8.陽(yáng)性對(duì)照(H液)，1管，20ul/管，內(nèi)裝VNNV陽(yáng)性模板。9.長(zhǎng)方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。10.一塊泡沫板，其大小與長(zhǎng)方體盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個(gè)孔，孔徑1.3cm，第二排五個(gè)孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個(gè)孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于泡沫板的孔內(nèi)，裝于長(zhǎng)方體盒子中。
該試劑盒中的內(nèi)外一對(duì)引物的DNA序列如下F15’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CTR15’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GART反應(yīng)液體系(10μl體系)如下5×Buffer 19μldNTP 1μlDEPC-H2O 3.3μl隨機(jī)引物 1μlRNA酶抑制劑RNAsin(RI) 0.2μl反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RT) 0.5μlRT-PCR反應(yīng)液體系(50μl體系)如下10×Buffer(含mg2+) 10μldNTP 1μl正向引物F1 1μl反向引物R1 1μlddH2O 34.7μlTaqE 0.3μl實(shí)施例2石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的檢測(cè)方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1.取樣品0.1g加1mlA液稀釋?zhuān)趧驖{器中冰浴勻漿，室溫靜置3～5min。2.在上述勻漿液中加入200μlB液，上下顛倒混勻，靜置5min。3.4℃，12000r/min離心15min。4.取400μl上清，加入到500μlC液中，輕輕晃動(dòng)，靜置10min。5.4℃，12000r/min離心15min。6.棄上清，用1ml預(yù)冷的D液洗滌2次，4℃，7500r/min離心5min。7.空氣干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55-60℃放置10min)。得到的RNA提取液可于-20℃保存。8.將RNA提取液在95℃預(yù)熱5min。9.取2μl預(yù)熱的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5min使失活，得到RT-PCR反應(yīng)模板。10.分別取2μl模板和H液加入到G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR儀上。11.按下列條件擴(kuò)增95℃ 10min預(yù)變性，→94℃ 40sec 35個(gè)循環(huán)→72℃ 7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12.反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在426bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽(yáng)性對(duì)照在同一位置)，則為VNNV陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品攜帶病毒性神經(jīng)壞死病毒，否則為陰性(見(jiàn)

圖1)。
權(quán)利要求
1.一種石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的基因診斷試劑盒，其特征是該試劑盒包括下列部件1).RNA提取液A液，2管，內(nèi)裝Trizol液；2).B液，1管，內(nèi)裝氯仿；3).C液，1管，內(nèi)裝異戊醇；4).D液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝DEPC水；6).RT反應(yīng)液F液，1管，內(nèi)裝RT反應(yīng)液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑RNAsinRI、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT；7).RT-PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝RT-PCR反應(yīng)液，包括含mg2+的10×Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH2O和TaqE。F1為5’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT，R1為5’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA；8).陽(yáng)性對(duì)照H液，1管，內(nèi)裝VNNV陽(yáng)性模板；9).盒子；10).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對(duì)應(yīng)放置于這些小孔中。
2.一種檢測(cè)石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品加A液稀釋稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿，室溫靜置3～5min；2).在上述勻漿液中加入200μlB液，上下顛倒混勻，靜置5～10min；3).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；4).取400μl上清，加入到500μlC液中，輕輕晃動(dòng)，靜置10～15min；5).4℃，10000～12000r/min離心10～15min；6).棄上清，用1ml預(yù)冷的D液洗滌2次，4℃，7500～10000r/min離心5～10min；7).空氣干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干，加50μlE液水溶解，得到RNA提取液；8).RNA提取液在95℃預(yù)熱5～10min9).取2μl預(yù)熱的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反應(yīng)模板；10).分別取模板和H液加入到G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR儀上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃ 10min預(yù)變性，→94℃ 40sec 35個(gè)循環(huán)→72℃ 7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察；若在與陽(yáng)性對(duì)照同一位置的426bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為VNNV陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品攜帶病毒性神經(jīng)壞死病毒，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種石斑魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)的基因診斷試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒及檢測(cè)方法是以根據(jù)病毒性神經(jīng)壞死病毒保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物為主體而設(shè)計(jì)的。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對(duì)病毒性神經(jīng)壞死病毒的特異性DNA核酸片段進(jìn)行定性檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速，特異性好，靈敏度高；可用于石斑魚(yú)各時(shí)期養(yǎng)殖過(guò)程中的病毒跟蹤檢測(cè)，也可用于環(huán)境監(jiān)測(cè)，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1448520SQ03114369
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2003年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月6日
發(fā)明者何建國(guó), 黃劍南, 黃志堅(jiān), 鄧敏, 呂玲, 陳曉艷, 翁少萍 申請(qǐng)人:中山大學(xué)