專(zhuān)利名稱(chēng)：富含對(duì)映體的氨基酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及富含D-對(duì)映體的氨基酸的制備方法，在該方法中，使相應(yīng)N-氨甲?；被岬膶?duì)映體混合物與D-氨甲酰酶接觸，同時(shí)釋放出氨。
D-氨基酸是生物活性制劑例如β-內(nèi)酰胺抗體、肽激素和農(nóng)藥的重要結(jié)構(gòu)單元。這些“非天然”氨基酸的常用制備方法是，利用乙內(nèi)酰脲酶使相應(yīng)的DL-5-取代乙內(nèi)酰脲發(fā)生對(duì)映選擇性水解而形成相應(yīng)的N-氨甲酰氨基酸。該N-氨甲酰氨基酸可以酶催轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-氨基酸。
該已知方法的缺點(diǎn)是，為了獲得某一反應(yīng)時(shí)間，需要相當(dāng)大量的生物催化劑，因?yàn)楸娝苤氖牵拱奔柞０被岚l(fā)生水解的酶(氨甲酰酶，也稱(chēng)為N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶)能被反應(yīng)產(chǎn)物氨所強(qiáng)烈抑制。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)生抑制效果的氨濃度(Olivieria等人(1981)Biotechnology and Bioengineering，第23卷，2173-2183；Runser(1990)Applied Microbiology and Biotechnology，33，382-388；Louwrier(1996)Enzyme and Microbial Technology，19，562-571)非常低(～10mM)。就該已知的方法而言，這意味著當(dāng)氨的濃度為10mM時(shí)，氨甲酰酶的活性為最高速率的一半。而當(dāng)氨的濃度為20mM時(shí)，氨甲酰酶的速率僅為最高速率的1/3。很明顯，由于在工業(yè)生產(chǎn)條件下需要高的產(chǎn)物濃度，例如＞500mM，因此氨甲酰酶的速率就會(huì)遭到非常強(qiáng)烈的抑制。當(dāng)產(chǎn)物濃度較低(數(shù)量級(jí)10mM)時(shí)，雖然此時(shí)氨甲酰酶的活性近似達(dá)到最高，但這在經(jīng)濟(jì)上是不利的，因?yàn)檫@樣會(huì)降低生產(chǎn)能力。
文獻(xiàn)中公開(kāi)了各種方法，旨在使氨的濃度在酶催轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中保持低的水平。原位除氨法的實(shí)例參見(jiàn)Kim & Kim的(1995)，Enzymeand Microbial Technology，17，63-67，該方法在經(jīng)乙內(nèi)酰脲酶和氨甲酰酶制備D-p-羥基苯基甘氨酸的反應(yīng)過(guò)程中利用吸附劑(AD300NS，Tomita Pharmaceutical Co.(Japan)制造的硅酸鹽配合物)來(lái)除去氨。該方法的缺點(diǎn)是，吸附劑很昂貴，因此必須加以循環(huán)利用。
根據(jù)J61.285.996-A(1986)所述的另一個(gè)方法，所生成的氨是通過(guò)蒸餾除去的。但是，該除氨方法僅在反應(yīng)混合物pH值很高的情況下才有效。但是，氨甲酰酶在這么高的pH值下是沒(méi)有活性的。如果通過(guò)蒸餾法在pH值為7-7.5的中性pH值下除氨，所形成的氨會(huì)有60～90％殘留在反應(yīng)混合物中，即使除去90％以上的反應(yīng)混合物容量時(shí)也是如此。因此，在中性pH值下實(shí)現(xiàn)有效去除效果是不可能的。
本發(fā)明在此提供了簡(jiǎn)單而又經(jīng)濟(jì)的方法，該方法只需使用較少的生物催化劑或者花費(fèi)較短的反應(yīng)時(shí)間。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，除氨時(shí)采用的是磷酸根離子、磷酸一氫根離子或磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽；在下文中統(tǒng)簡(jiǎn)稱(chēng)為磷酸鹽。為此，例如酶催反應(yīng)可以在磷酸鹽存在下進(jìn)行(舉例而言)。令人驚奇的是，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)即使?jié){液濃度很高，反應(yīng)混合物也很容易攪拌。
另一個(gè)實(shí)施方案例如是這樣形成的，在分離出未溶解的反應(yīng)組分之后，將反應(yīng)混合物經(jīng)由例如回路引導(dǎo)通過(guò)例如存在有磷酸鹽的第二反應(yīng)器、塔或者濾器。反應(yīng)混合物中所含的氨由此與磷酸鹽結(jié)合，生成相應(yīng)的磷酸銨鹽，然后將仍含有例如酶的剩余液體輸送回酶催脫氨甲?；磻?yīng)容器。
已發(fā)現(xiàn)未發(fā)生酶抑制現(xiàn)象或者抑制程度很低。這就更令人驚奇了，因?yàn)橐阎词故堑蜐舛?1-10μmol)的二價(jià)金屬也會(huì)干擾氨甲酰酶催化反應(yīng)。
適宜的二價(jià)金屬離子的實(shí)例是鎂、鈷、鈣、錳、鋯或釕離子。從經(jīng)濟(jì)的角度而言，優(yōu)選采用磷酸一氫鎂(MgHPO4)，也稱(chēng)為磷酸氫鎂。就最終的pH值而言，磷酸氫鎂很適合優(yōu)化的工藝條件，而且很容易從廉價(jià)原材料進(jìn)行制備。磷酸鹽也可以原位生成。
制備磷酸鹽例如磷酸氫鎂的簡(jiǎn)便方法是，將磷酸加入到相應(yīng)的氧化物或氫氧化物中，例如氧化鎂或氫氧化鎂，由此生成磷酸鹽。在此之后，即可添加所獲得的磷酸鹽(任選經(jīng)過(guò)過(guò)濾和洗滌)了。
磷酸鹽的用量?jī)?yōu)選0.5～3磷酸鹽當(dāng)量，特別是0.8～1.2當(dāng)量，基于反應(yīng)過(guò)程中生成的氨量。
合適的酶的實(shí)例是乙內(nèi)酰脲酶-氨甲酰酶法中常用的那些酶，例如來(lái)自以下酶屬的酶假單胞菌屬，特別是熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或解韌帶假單胞菌，無(wú)色桿菌屬，棒桿菌屬，芽孢桿菌屬，特別是短芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌，短桿菌屬，微桿菌屬，節(jié)桿菌屬，土壤桿菌屬，特別是根癌土壤桿菌或放射形土壤桿菌，Acrobacter，克雷伯氏菌屬，疊球菌屬，精朊桿菌屬，鏈霉菌屬，放線菌屬，念珠菌屬，紅酵母屬，畢赤酵母屬或擬青霉菌屬。
酶催反應(yīng)可以在pH值5～9下進(jìn)行，優(yōu)選在pH值6-8下進(jìn)行。酶催反應(yīng)的溫度優(yōu)選0～50℃，特別是20～40℃。
酶催反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)混合物可以經(jīng)任何方式回收。
適宜的回收方法例如是，將反應(yīng)混合物酸化至pH值0～3，優(yōu)選0.5～1.5，然后除去生物量。將pH值提高到例如3～5，優(yōu)選3.5～4.5后，通過(guò)例如過(guò)濾法或離心分離法分離出D-氨基酸。將pH值提高到5～11，優(yōu)選7～10后，通過(guò)例如離心分離法或過(guò)濾法分離出由磷酸鹽形成的相應(yīng)的磷酸銨鹽。
另一種適宜的回收方法例如是，將pH值提高到9～11，優(yōu)選9.5～10.5，然后過(guò)濾出由磷酸鹽形成的相應(yīng)的固體磷酸銨鹽。然后通過(guò)例如微過(guò)濾法或超濾法從所得到的母液中除去生物量。在將pH值酸化到例如3～6，優(yōu)選4.5～5.5之后，通過(guò)例如過(guò)濾法分離出固體D-氨基酸。
所得到的磷酸銨鹽隨后可以簡(jiǎn)單地按照已知的方式轉(zhuǎn)化成磷酸鹽，方法是將磷酸銨鹽干燥加熱，同時(shí)釋放出氨。另一種方法是加熱pH值＞8.5的磷酸銨鹽漿液，特別是9～11，同時(shí)釋放出氨。還一種方法是以無(wú)機(jī)酸例如硫酸洗滌磷酸鎂銨鹽，使pH值維持4.5～6.5，優(yōu)選5.5～6。由此獲得氨與無(wú)機(jī)酸的鹽，且回收磷酸氫鎂。
在1984和1985年的US-A-4,460,555和US-A-4,650,857中，公開(kāi)了特定的磷酸氫鎂顆粒作為氨清除劑。這些專(zhuān)利文獻(xiàn)主要關(guān)注的是這些顆粒在酶催滲析系統(tǒng)中的用途，以便在經(jīng)由脲酶除脲的過(guò)程中清除由脲所釋放的氨。但是，此處所釋放的氨的總量是很低的。但是，自從那時(shí)起尚未有人提及這類(lèi)顆粒在乙內(nèi)酰脲酶/氨甲酰酶法中防止酶抑制作用的用途。
本發(fā)明特別適用于通過(guò)所謂的乙內(nèi)酰脲途徑來(lái)制備富含對(duì)映體的氨基酸，該途徑涉及借助乙內(nèi)酰脲酶由相應(yīng)的乙內(nèi)酰脲制備富含D-對(duì)映體的N-氨甲酰氨基酸，其中乙內(nèi)酰脲酶任選與外消旋酶共用，然后利用D-氨甲酰酶進(jìn)行脫氨甲?；磻?yīng)，其中脫氨甲?；磻?yīng)是總反應(yīng)速率的決定步驟。已發(fā)現(xiàn)磷酸鹽和/或磷酸銨鹽的存在對(duì)乙內(nèi)酰脲酶、氨甲酰酶和/或外消旋酶沒(méi)有抑制或變性作用。在這些已知的方法中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)pH值大多數(shù)處于7～8，因?yàn)樵诟叩膒H值下，由于NH3的存在，實(shí)際上會(huì)完全抑制酶的活性。在近似中性pH值條件下進(jìn)行這些反應(yīng)的缺點(diǎn)是，在制備幾乎所有的氨基酸時(shí)，特別是在制備脂肪族氨基酸時(shí)，遺后的乙內(nèi)酰脲對(duì)映體會(huì)發(fā)生緩慢的外消旋化反應(yīng)。
目前已發(fā)現(xiàn)，這些反應(yīng)可按照本發(fā)明方法在較高的pH值下進(jìn)行時(shí)，例如pH值為7.0～9.0，優(yōu)選7.5～8.5，而幾乎不會(huì)產(chǎn)生任何酶抑制現(xiàn)象，但會(huì)發(fā)生所不希望的對(duì)映體外消旋化。其結(jié)果是，所獲得的產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于50％，這是在不發(fā)生外消旋化反應(yīng)的情況下理論上最大可能的產(chǎn)率。
本發(fā)明方法也可用于許多拆分方法，在這些方法中，利用含有D-選擇性乙內(nèi)酰脲水解酶和N-氨甲酰氨基酸水解酶的微生物將DL-N-氨甲酰氨基酸轉(zhuǎn)化成富含D-對(duì)映體的相應(yīng)氨基酸和富含對(duì)映體的未轉(zhuǎn)化L-N-氨甲酰氨基酸。由于該反應(yīng)可以在高的pH值(例如7.5～9)下進(jìn)行，所以L-N-氨甲酰氨基酸的損失很小，因?yàn)樵诟遬H值的情況下是不會(huì)發(fā)生乙內(nèi)酰脲酶反應(yīng)的。
實(shí)施例實(shí)施例I向200ml水中添加34g DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲和34gMgHPO4·3H2O。借助于5N NaOH將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)到pH＝7.2，然后添加34ml放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始反應(yīng)。反應(yīng)在氮?dú)鈿夥障掠?0℃進(jìn)行。添加5N NaOH，使反應(yīng)混合物的pH值保持恒定為pH值7.2。HPLC分析證實(shí)，經(jīng)過(guò)10h水解反應(yīng)之后，轉(zhuǎn)化率已達(dá)到99％以上。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)1在與實(shí)施例I所述相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，使34g DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲進(jìn)行水解，但不加磷酸鹽。添加34ml相同的放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始反應(yīng)。反應(yīng)在氮?dú)鈿夥障掠?0℃進(jìn)行。利用1.3MH3PO4進(jìn)行自動(dòng)滴定，使反應(yīng)混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。通過(guò)HPLC分析定時(shí)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程。記錄表明，水解約10h之后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到約57％。30h之后測(cè)得的轉(zhuǎn)化率累計(jì)＞99％。
實(shí)施例II向575ml水中添加122g DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲和122gMgHPO4·3H2O，使該化合物發(fā)生水解。以5N NaOH將混合物的pH值調(diào)節(jié)到pH＝7.2，然后通氮?dú)?h。添加8ml放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始酶催轉(zhuǎn)化反應(yīng)。添加NaOH(25重量％)，將反應(yīng)混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。記錄NaOH的總消耗量為19g。經(jīng)過(guò)95h水解之后，測(cè)得其轉(zhuǎn)化率為99.3％。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)2在與實(shí)施例II所述相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，在40℃下向575ml水中添加p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲(122g)。以5N NaOH將pH值調(diào)節(jié)至7.2，然后通氮?dú)?h。添加30ml相同的放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始反應(yīng)。利用33重量％H3PO4溶液使pH值保持恒定pH＝7.2。經(jīng)過(guò)95h水解之后，測(cè)得其轉(zhuǎn)化率為98.7％。水解97.5h之后，測(cè)得的轉(zhuǎn)化率累計(jì)＞99.3％。
實(shí)施例III在40℃下向510ml水中添加176g DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲和176g MgHPO4·3H2O。向反應(yīng)混合物中充氮1h惰化。添加15ml放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始酶催轉(zhuǎn)化反應(yīng)。利用5N NaOH進(jìn)行自動(dòng)滴定，使反應(yīng)混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。HPLC分析證實(shí)，水解120h之后，其轉(zhuǎn)化率累計(jì)為99.8％。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)3在40℃下向557ml水中添加176g DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲，然后以5N NaOH將pH值調(diào)節(jié)到7.2。向反應(yīng)混合物中充氮1h惰化。然后添加56ml相同的放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液。通過(guò)自動(dòng)滴定33重量％磷酸使反應(yīng)混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。HPLC分析證實(shí)，水解146.5h之后的轉(zhuǎn)化率為96.5％，而180h之后的轉(zhuǎn)化率為99.8％。
實(shí)施例IV將按實(shí)施例II所述獲得的反應(yīng)混合物以約130g硫酸(98重量％)酸化至pH＝1，然后通過(guò)微過(guò)濾法除去細(xì)胞殘留物。以100g水滲濾(diafitered)余留物。將所收集的水相部分蒸發(fā)至體積約為600ml。向所得到的殘留物中添加約63g NaOH(50重量％)直至pH值為3.5，然后分離出形成的D-p-羥基苯基甘氨酸，并且洗滌數(shù)次。向該步驟所得到的濾液中添加約53g NaOH(50重量％)，使pH值達(dá)到8.5，然后分離出生成的MgNH4PO4。
以50ml水洗滌MgNH4PO4兩次，然后將其懸浮在水中。隨后在減壓下蒸發(fā)水和氨的混合物。
最后獲得101.7g D-p-羥基苯基甘氨酸和118g MgHPO4·3H2O。
實(shí)施例V將按實(shí)施例II所述獲得的反應(yīng)混合物以約70g NaOH(50重量％)調(diào)節(jié)至pH＝10。過(guò)濾反應(yīng)混合物，然后以100ml水洗滌殘留物兩次。將該步驟所得到的濾液輸送通過(guò)微過(guò)濾裝置以除去任何細(xì)胞殘留物。將余留物洗滌幾分鐘。然后以約40g硫酸將滲液酸化至pH為3.5，D-p-羥基苯基甘氨酸在此過(guò)程中發(fā)生結(jié)晶。分離之后，經(jīng)洗滌并干燥得到產(chǎn)率為102g的D-p-羥基苯基甘氨酸。
實(shí)施例VI在各種pH值下進(jìn)行DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲向D-(-)-p-羥基苯基甘氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
向200ml水中添加34g(177mmol)DL-p-羥基苯基甘氨酸乙內(nèi)酰脲和34g MgHPO4·3H2O。以5N NaOH將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)到所需水平，然后添加3.0ml放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始反應(yīng)。該反應(yīng)在氮?dú)鈿夥罩杏?0℃進(jìn)行。以5N NaOH進(jìn)行自動(dòng)滴定，使反應(yīng)混合物的pH值保持所需的pH值水平。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表1。該表給出了轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％以上時(shí)所需的反應(yīng)時(shí)間。
表1
實(shí)施例VII在40℃下向200ml水中添加30g DL-N-氨甲酰-p-羥基苯基甘氨酸和34g MgHPO4·3H2O。以約15g的42％ KOH將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)節(jié)到pH為8.0。然后在氮?dú)鈿夥障绿砑?3ml放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液。使反應(yīng)混合物的pH值保持恒定在pH＝8.0。通過(guò)HPLC分析監(jiān)控反應(yīng)混合物的組成。反應(yīng)27h之后，測(cè)得D-p-羥基苯基甘氨酸的濃度為4.3重量％，而L-N-氨甲酰-p-羥基苯基甘氨酸的濃度為5.4重量％。反應(yīng)混合物的組成此后就保持不變了。
實(shí)施例VIII向200ml水中添加15g DL-纈氨酸乙內(nèi)酰脲和20g MgHPO4·3H2O。添加5N NaOH，將混合物的pH值調(diào)節(jié)到8，然后添加15ml放射形土壤桿菌細(xì)胞懸液開(kāi)始反應(yīng)。該反應(yīng)在氮?dú)鈿夥障掠?0℃進(jìn)行。添加5NNaOH，使反應(yīng)混合物的pH值保持恒定在pH＝8。水解16h之后，測(cè)得D-纈氨酸的濃度為52g/l，如果以DL-纈氨酸乙內(nèi)酰脲為計(jì)的話(huà)，這相當(dāng)于轉(zhuǎn)化率＞99％。
權(quán)利要求
1.富含D-對(duì)映體的手性氨基酸的制備方法，其中，使相應(yīng)N-氨甲酰氨基酸的對(duì)映體混合物與D-氨甲酰酶接觸，同時(shí)釋放出氨，其特征在于氨是經(jīng)由磷酸根離子、磷酸一氫根離子或磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽除去的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中酶催脫氨甲?；磻?yīng)是在磷酸根離子、磷酸一氫根離子或磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽的存在下進(jìn)行的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在分離出存在的固體之后，使反應(yīng)混合物與磷酸根離子、磷酸一氫根離子或磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽經(jīng)由外部回路進(jìn)行接觸。
4.富含D-對(duì)映體的手性氨基酸的制備方法，其中，利用乙內(nèi)酰脲酶將相應(yīng)的乙內(nèi)酰脲經(jīng)酶催轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的N-氨甲酰氨基酸，然后利用權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法將后者轉(zhuǎn)化成富含D-對(duì)映體的氨基酸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中兩個(gè)步驟都是在容器中在乙內(nèi)酰脲酶和D-氨甲酰酶的存在下進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中反應(yīng)混合物的pH值為7.0～9.0。
7.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)的方法，其中以磷酸一氫鎂作為磷酸根離子二價(jià)金屬鹽。
8.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)的方法，其中隨后將所獲得的反應(yīng)混合物的pH值提高至9.5～10.5，分離出所形成的固體磷酸銨鹽，將母液的pH值降低到3.5～4.5，然后分離出固體D-氨基酸。
9.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)的方法，其中隨后將所獲得的反應(yīng)混合物的pH值降低至0.5～1.5，分離出生物量，然后將pH值提高到3.5～4.5，分離出固體D-氨基酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中隨后將所獲得的母液的pH值提高到7～10，然后分離出所形成的固體磷酸銨鹽。
11.回收磷酸一氫鎂的方法，其中使磷酸銨與pH值為4.5～6.5的無(wú)機(jī)酸接觸，然后使磷酸一氫鎂與氨和無(wú)機(jī)酸的鹽實(shí)現(xiàn)分離。
12.權(quán)利要求11的方法，其中pH值保持在5.5～6。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中無(wú)機(jī)酸是硫酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備富含D－對(duì)映體的手性氨基酸的方法，在該方法中，使相應(yīng)N－氨甲酰氨基酸的對(duì)映體混合物與D－氨甲酰酶接觸，同時(shí)釋放出氨，然后以磷酸根、磷酸氫根或磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽除去氨。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶催脫氨甲?；磻?yīng)在磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽的存在下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在分離出存在的固體之后，使反應(yīng)混合物經(jīng)由外部回路與磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子的二價(jià)金屬鹽實(shí)現(xiàn)接觸。富含D－對(duì)映體的手性氨基酸的制備方法也可以是，利用乙內(nèi)酰脲酶將相應(yīng)的乙內(nèi)酰脲酶催轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的N－氨甲酰氨基酸，然后按照本發(fā)明方法將其轉(zhuǎn)化成富含D－對(duì)映體的氨基酸。
文檔編號(hào)C12P41/00GK1520460SQ02804428
公開(kāi)日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2002年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月31日
發(fā)明者W·H·J·貝斯藤, J·G·T·基爾克爾斯, T 基爾克爾斯, W H J 貝斯藤 申請(qǐng)人:Dsm Ip 財(cái)產(chǎn)有限公司