專利名稱：非侵入的出生前監(jiān)測的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及利用非侵入技術(shù)的出生前檢測方法，尤其是懷孕個(gè)體的血液樣品中胎兒或母親的RNA的檢測，包括通過分析血液樣品對未出生胎兒的基因表達(dá)模式進(jìn)行評價(jià)。
我們以前描述了對母體血漿和血清中循環(huán)胎兒DNA的檢測，如Y.M.Dennis Lo等人在Lancet 1997，350485-7，雜志上的文章“母體血漿和血清中存在胎兒DNA”，我們已經(jīng)證明了這種技術(shù)在非侵入出生前診斷中的用途。Y.M.Dennis Lo等人在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New England Journalof Medicine 1998，3391734-8)上的“通過母體血漿的分子分析進(jìn)行胎兒的RhD狀態(tài)的出生前診斷”一文。胎兒DNA在母體血漿中的發(fā)現(xiàn)為出生前分子診斷打開了新的視野。自從那時(shí)以來，許多研究小組證明可以通過母體血漿中的胎兒DNA來測定胎兒遺傳性狀，如RhD狀態(tài)和遺傳疾病。
現(xiàn)有技術(shù)的主要限制是胎兒DNA測定只能使人知道母體循環(huán)中存在胎兒來源的遺傳物質(zhì)和數(shù)量，并不能給出關(guān)于嬰兒基因表達(dá)概況的信息，預(yù)期基因表達(dá)模式可能受影響母體和嬰兒的生理和病理過程的影響，常規(guī)的非侵入技術(shù)不能做到直接監(jiān)測胎兒基因表達(dá)。
發(fā)明概要本發(fā)明的實(shí)施方案涉及懷孕個(gè)體血液樣品中母體或胎兒的RNA的檢測，也包括將樣品進(jìn)行顯示胎兒或母體狀況或特性的胎兒或母體分析指標(biāo)的測試。比如RNA分析包括通過分析母體血液樣品，評價(jià)未出生胎兒的基因表達(dá)模式。本發(fā)明的用處在懷孕的第二個(gè)三月和第三個(gè)三月開始顯示，可以廣泛的用于疾病的診斷和監(jiān)測，包括驚闕前期和提前分娩。
本發(fā)明實(shí)施方案中的新的出生前監(jiān)測技術(shù)第一次實(shí)現(xiàn)了僅通過分析母體血液樣品測定胎兒基因的表達(dá)。本發(fā)明將成為非侵入方法進(jìn)行出生前測定的新的一代平臺(tái)技術(shù)。
出生前監(jiān)測技術(shù)基于在懷孕婦女血漿中發(fā)現(xiàn)循環(huán)的胎兒RNA，此前，人們并不知道胎兒RNA也存在于母體血漿中，應(yīng)用兩步的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，我們證明胎兒來源的、男性特有的mRNA存在于懷男孩的婦女血漿中。正如在此描述的，胎兒RNA可以被RT-PCR技術(shù)測定，但原則上，可以使用任何RNA測定方法。
預(yù)期該技術(shù)可以在所有懷孕的情況中測定胎兒的生理或病理狀況。在特定情況下，在懷孕期間令人滿意的或者必要的是進(jìn)行一次以上的這樣的監(jiān)測，因此潛在客戶的數(shù)量和多次使用的可能性是巨大的。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，出生前監(jiān)測或測定懷孕的人的血樣的方法，包括從血樣中除去所有的或基本上所有的有核和無核的細(xì)胞群以獲得剩余的材料，剩余的材料用于測試胎兒或母體的RNA分析指標(biāo)，以顯示母體或胎兒的狀況或特征，剩余的材料包括血漿或血清。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，測定懷孕婦女母體血清或血漿樣品的檢測方法包括測定樣品中存在的胎兒RNA。擴(kuò)增胎兒RNA以促進(jìn)檢測樣品中存在的胎兒來源的RNA。例如胎兒RNA可能被反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)來測定。
在一些具體實(shí)施方案中，用序列特異性的探針來測定胎兒RNA。RNA的測定包括測定從Y染色體轉(zhuǎn)錄來的胎兒的RNA的存在，或者測定從母親或父親遺傳來的基因或其他DNA序列轉(zhuǎn)錄而來的胎兒RNA?？捎萌魏我环N物理方法、免疫方法和生化方法測定RNA。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，測定懷孕婦女血清或血漿樣品的檢測方法包括檢測樣品中胎兒或母體來源的RNA的存在。RNA檢測可能包括檢測從染色體6中的基因轉(zhuǎn)錄來的RNA的存在，此RNA可能從HLA-G基因轉(zhuǎn)錄而來。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及進(jìn)行出生前監(jiān)測或測試的方法。該方法包括提供母體血液樣品、將樣品分離為細(xì)胞占優(yōu)勢的組分(組分1)和非細(xì)胞占優(yōu)勢的組分(組分2)。在組分2中可以檢測到胎兒來源的RNA的存在。該方法進(jìn)一步包括了基于所測定RNA的存在、數(shù)量、濃度、序列、和生化成分中至少一種作出診斷。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，對母體血液樣品進(jìn)行出生前監(jiān)測或測試的方法包括獲得母體血液樣品的非細(xì)胞組分和對此組分中人類基因表達(dá)的RNA分析。
附圖簡述附

圖1是本發(fā)明的實(shí)施方案中描述的非侵入出生前監(jiān)測方法的流程圖。
附圖2按照本發(fā)明的實(shí)施方案中描述的母體血漿中胎兒來源的Y染色體特異性的鋅指蛋白(ZFY)mRNA的檢測，和針對HLA-G mRNA的RT-PCR測試。
特定的實(shí)施方案的描述如附圖1所示，按照本發(fā)明的實(shí)施方案，對由懷孕母體獲得的血液樣品進(jìn)行出生前監(jiān)測或測試的方法首先是提供血液樣品(步驟10)，在步驟14中，所有的或基本上所有的有核細(xì)胞和無核細(xì)胞群被從血液樣品中除去，步驟18中將剩下的材料用于胎兒或母體RNA分析指標(biāo)的測試，以顯示胎兒或母親的狀況或特征。用于RNA分析的剩下的材料可能是細(xì)胞物質(zhì)或非細(xì)胞物質(zhì)。在特定的實(shí)施方式中，剩余的材料可能包括血漿或血清。血清可能由母體血液樣品凝塊而獲得。
對母體的血清或血漿樣品進(jìn)行測試以檢測樣品中胎兒或母體來源的RNA的存在。為了促進(jìn)樣品中的RNA檢測，可以將RNA擴(kuò)增。在一個(gè)例子中，胎兒或母體RNA由反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增后測定。擴(kuò)增胎兒或母體RNA可能包括使用胎兒或母體的至少一個(gè)序列特異性寡核苷酸。
用一個(gè)序列特異性探針可能測定胎兒或母體的RNA。在一個(gè)實(shí)施例中，存在的胎兒RNA的測定包括測定從Y染色體轉(zhuǎn)錄來的胎兒RNA，更具體地說，胎兒RNA可能被從ZFY基因轉(zhuǎn)錄。樣品中的胎兒來源的RNA可以測定胎兒的性別。在另一個(gè)實(shí)施例中，測定樣品中胎兒來源的RNA的存在包括測定從父親遺傳來的基因或其他DNA序列而來的胎兒RNA。在另一個(gè)例子中，測定樣品中母親或胎兒來源的RNA的存在包括測定從染色體6中的基因轉(zhuǎn)錄來的RNA的存在，此RNA可能從HLA-G基因中轉(zhuǎn)錄而來。用一個(gè)或多個(gè)物理的、免疫和生化的方法可以測定RNA。
在另外的例子中，母親的或胎兒的RNA的測定和分析用母親的血液樣品的非細(xì)胞組分進(jìn)行。非細(xì)胞組分完全是非細(xì)胞或非細(xì)胞占優(yōu)勢的，通過分離血液樣品中所有的或占優(yōu)勢的細(xì)胞組分而獲得。RNA分析包括基于測定RNA的存在、數(shù)量、濃度、序列、生化組成中的一種或多種給出的診斷。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，對在樣品中非細(xì)胞組分中表達(dá)的人類基因進(jìn)行RNA分析。
應(yīng)該說明的是過濾血液樣品、除去所有細(xì)胞材料、得到血漿或血清(即血液中無細(xì)胞組分占優(yōu)勢)，對此樣品仍能進(jìn)行胎兒或母親的RNA測定和分析。
如下的例子描述本發(fā)明的各種特征，并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
在該例子中，在知情同意的情況下，懷孕婦女在產(chǎn)科和婦科醫(yī)學(xué)系、威爾士王子醫(yī)院、香港等參加出生前診斷試驗(yàn)。臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此項(xiàng)研究，21個(gè)懷孕早期和37個(gè)懷孕晚期的婦女參加了試驗(yàn)，懷孕早期的平均的懷孕時(shí)間為16周(范圍從11-19周)，晚期的平均為33周(范圍為26-40周)。所有的早期懷孕樣品都是在侵入過程之前獲得，另一方面，懷孕晚期的樣品或者是從在懷孕早期(n＝21)做過侵入過程的婦女獲得的，或者是從沒有進(jìn)行任何出生前侵入步驟(n＝16)的婦女獲得的。所有的血漿樣品都是30分鐘內(nèi)從EDTA血液樣品獲得的，參照Y.M.Dennis Lo等人在《手術(shù)刀》(1997，350485-7)中的文章“胎兒DNA在母體血漿和血清中出現(xiàn)”，按照生產(chǎn)者的說明，血漿中的所有的RNA用Trizol LS試劑(Gibco BRL)分離，一般來說，1mL血漿中分離得RNA被溶解在50uL不含RNA酶的水中。
在本研究中，我們選擇測定母親血漿中的胎兒來源的、Y染色體特異性的鋅指蛋白mRNA，參照D.C.page等人“人類Y染色體上性別決定區(qū)編碼鋅指蛋白”(《細(xì)胞》雜志1987，511091-104)，M.S.Palmer等人“人類ZFY和ZFX轉(zhuǎn)錄物的比較”(美國科學(xué)院年報(bào)1990，871681-5)，如圖2，只有當(dāng)懷男孩的婦女胎盤總RNA用于RT-PCR測定時(shí)，可以觀察到對應(yīng)于ZFY mRNA的RT-PCR產(chǎn)物(圖2，1泳道)。相反，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄(RT)被省略，沒有出現(xiàn)陽性信號(圖2，2泳道)，當(dāng)女性的胎盤總RNA用于RT-PCR檢測時(shí)，也沒有陽性信號(圖2，3泳道)。在懷孕晚期的懷男孩的20個(gè)婦女中，13個(gè)婦女的血漿樣品中檢測到了ZFY陽性信號(圖2，中間泳道，6-10泳道)。在懷孕早期的懷男孩的婦女中，9個(gè)當(dāng)中的2個(gè)檢測到了陽性信號。陽性反應(yīng)中的ZFY mRNA特異性的RF-PCR產(chǎn)物在DNA測序中也得到了證實(shí)(數(shù)據(jù)沒有示出)。通過比較，20個(gè)懷女孩的婦女，無論是12個(gè)懷孕早期的，還是8個(gè)懷孕晚期的，除一個(gè)之外，所有測試都是陰性反應(yīng)(圖2，中間泳道，11-14泳道)唯一一個(gè)假陽性的反應(yīng)推測是由于RNA加工過程的污染，作為提取的RNA質(zhì)量的對照，我們將所有樣品進(jìn)行RT-PCR測定以檢測HLA-GmRNA，參照T.V.F.Hviid等人，“人類前三個(gè)月胚胎滋養(yǎng)層HLA-G基因共顯性表達(dá)和各種剪切形式的HLA-G mRNA”(Hum.Immunol，1998，5987-98)。HLA-G基因在胎兒(比如滋養(yǎng)層，參照id.)和母體組織中(比如淋巴細(xì)胞，參照M.Kirszenbaum等人)都有表達(dá).“人類滋養(yǎng)層的作為選擇的HLA-GmRNA的剪切形式和HLA-G轉(zhuǎn)錄物在成人淋巴細(xì)胞中存在的證據(jù)”(美國科學(xué)院年報(bào)，1994，914209-13)。如圖2底下的泳道，HLA-G mRNA的RT-PCR產(chǎn)物在所有的血漿樣品中都檢測到了，表明這些樣品中存在可擴(kuò)增RNA的。
最近證明，一定比例的母體血漿中的胎兒DNA以完整的胎兒細(xì)胞的形式在血液中循環(huán)，參照I.J.vzn Wijk等人的“懷孕婦女血漿中的編程性死亡的胎兒細(xì)胞的測定[技術(shù)簡介]”(Clin.Chem.2000，46729-31).所以我們測定到的胎兒RNA是從血漿中的細(xì)胞而來的，這在理論上很可能。為了最終驗(yàn)證是否胎兒RNA以無細(xì)胞的形式參與母體的循環(huán)，母體血漿樣品通過0.2um的膜(Nalgene)過濾，從過濾血漿中的提取的RNA用于ZFY RT-PCR測定。在9個(gè)懷孕晚期的懷男孩的婦女的過濾過的血漿樣品中，6個(gè)樣品中檢測到了陽性的ZFY mRNA信號(數(shù)據(jù)沒有示出)，這個(gè)結(jié)果顯示，至少一部分胎兒RNA在母體血漿中是非細(xì)胞形式出現(xiàn)的。
我們的數(shù)據(jù)顯示胎兒RNA可以在母體血漿中測定到，在早期和晚期懷孕的婦女的血漿中測定到胎兒RNA的比率分別為22％和63％。在懷孕早期婦女的血漿中檢測到RNA的比率比懷孕晚期的要低，說明血漿中胎兒RNA的濃度在懷孕早期比較低。這一發(fā)現(xiàn)和我們以前的發(fā)現(xiàn)相似，即母體血漿中的胎兒DNA濃度隨著懷孕時(shí)間增加而增加。參照Y.M.Dennis Lo等人“母體血漿和血清中胎兒DNA的分析非侵入的出生前診斷”(Am.J.Hum.Genet 1998，62768-75)。我們意識(shí)到，血漿中所測定到的胎兒RNA的比率低于DNA的比率，很可能是胎兒RNA在母體血液中更容易降解，所以血漿中的胎兒RNA的數(shù)量要少于DNA的數(shù)量。在懷男孩的婦女血漿樣品中測定到了Y染色體的DNA(數(shù)據(jù)沒有示出)，這一點(diǎn)也可以支持上述觀點(diǎn)。高靈敏度的實(shí)時(shí)數(shù)量RT-PCR測定可以用于改進(jìn)母體血漿胎兒RNA的測定的靈敏度。
總之，我們的試驗(yàn)第一次表明母體血漿中可以測定到胎兒RNA，我們的數(shù)據(jù)為非侵入出生前診斷提供了新的方法。血漿胎兒DNA分析為在母體循環(huán)中存在的胎兒遺傳物質(zhì)的和濃度提供了數(shù)據(jù)。此外，血漿中的胎兒RNA分析可以為胎兒組織的基因表達(dá)模式提供有價(jià)值的信息。不正常的懷孕，比如驚闕前期就和胎兒組織中不正常的基因表達(dá)模式相關(guān)。B.K.Rinehart等人“胎盤細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α，白介素1β和白介素10在驚闕前期表達(dá)量增加”(Am.J.Obstet.Gynecol 1999，181915-20)。所以隨著進(jìn)一步的RNA標(biāo)記的研制，母體血漿RNA分析使得在許多生理和病理狀況下的非侵入的胎兒基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。很明白的是，在這里用的術(shù)語“血漿胎兒RNA分析”包括母體血漿或血清中胎兒RNA分析。
以上描述的儀器和方法的安排僅僅描述了本發(fā)明原理的應(yīng)用，正像權(quán)利要求所述的，在不改變本發(fā)明的主旨和范圍的情況下，可以有許多其他具體實(shí)施方案和改變。比如當(dāng)我們展示了概念的可行性，進(jìn)一步的研究可能闡明本技術(shù)應(yīng)用的條件范圍。此外，可以對此技術(shù)進(jìn)一步的改善，比如在遵循本發(fā)明范圍的情況下提高本方法的可靠性。本發(fā)明的范圍不應(yīng)按照以上描述確定，而應(yīng)該按照附帶的權(quán)利要求和等同物的全部的范圍來確定。
權(quán)利要求
1.對懷孕個(gè)體的血液樣品進(jìn)行胎兒出生前監(jiān)測或測試的方法，該方法包括從血液樣品中除去所有或基本上所有的有核細(xì)胞和無核細(xì)胞群，得到剩余的材料，并且將剩余的材料進(jìn)行測試，以顯示胎兒或母體的狀況或特征的胎兒或母體RNA分析指標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中從血液樣品中除去所有的有核細(xì)胞和無核細(xì)胞群以得到剩余的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中剩余的材料包括非細(xì)胞物質(zhì)，并且RNA分析是對剩余材料中的非細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中剩余材料包括細(xì)胞物質(zhì)，并且RNA分析是針對剩余材料中的細(xì)胞物質(zhì)而進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，剩余材料包括血漿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，剩余材料包括血清。
7.對懷孕母體血清或血漿樣品進(jìn)行檢測的方法，該方法包括測定樣品中胎兒來源的RNA的存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，進(jìn)一步包括了擴(kuò)增胎兒RNA，以有助于測定樣品中胎兒RNA的存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其中胎兒RNA被反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行測定。
10.根據(jù)權(quán)利要求8(8或9)所述方法，其中至少一個(gè)胎兒序列特異性寡聚核苷酸用于擴(kuò)增胎兒RNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求7(權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng))所述方法，其中用序列特異性的探針檢測胎兒RNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求7(權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng))所述方法，其中測定樣品中胎兒來源的RNA的存在包括測定從Y染色體上轉(zhuǎn)錄來的胎兒RNA的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，其中胎兒RNA是從ZFY基因轉(zhuǎn)錄而來。
14.根據(jù)權(quán)利要求12(權(quán)利要求12或13)所述方法，進(jìn)一步包括通過測定樣品中胎兒來源的RNA來判定胎兒性別。
15.根據(jù)權(quán)利要求7(權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng))所述方法，其中測定樣品中胎兒來源的RNA的存在包括測定由父親或母親遺傳來的基因或其他DNA序列而來的胎兒RNA的存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求7(權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng))所述方法，其中RNA是用任何一種物理方法、免疫方法、和生化方法進(jìn)行測定的。
17.對懷孕母體的血清或血漿樣品進(jìn)行檢測的方法，該方法包括測定樣品中胎兒或母體來源的RNA的存在。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，進(jìn)一步包括了擴(kuò)增胎兒或母體RNA，以有利于檢測樣品中胎兒或母體來源的RNA的存在。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述方法，其中胎兒或母體RNA由反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，然后通過PCR反應(yīng)測定。
20.根據(jù)權(quán)利要求18(權(quán)利要求18或19)所述方法，至少一個(gè)胎兒或母體序列特異性寡聚核苷酸可用于擴(kuò)增胎兒或母體RNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求17(權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng))所述方法，用序列特異性探針測定胎兒或母體RNA。
22.根據(jù)權(quán)利要求17(權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng))所述方法，測定樣品中胎兒或母體來源的RNA的存在包括測定從染色體6上基因轉(zhuǎn)錄的RNA的存在。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述方法，RNA是從HLA-G基因轉(zhuǎn)錄而來。
24.出生前監(jiān)測或測試的方法，包括以下步驟(i)提供懷孕母親血液樣品；(ii)將樣品分離為細(xì)胞占優(yōu)勢的組分(組分1)和非細(xì)胞占優(yōu)勢的的組分(組分2)；(iii)測定組分2中胎兒來源的RNA的存在；(iv)基于所測定RNA的存在、數(shù)量、濃度、序列、和生化成分中至少一種，提供一種診斷結(jié)果。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述方法，進(jìn)一步包括了母體血液樣品結(jié)塊后獲得血清，此血清用于步驟(iii)和(iv)。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述方法，其中步驟(iii)進(jìn)一步包括了測定組分2中母親或胎兒來源的RNA的存在。
27.對母親血液樣品進(jìn)行出生前監(jiān)測或測試的方法，包括獲得母親血液樣品的非細(xì)胞組分和對此組分表達(dá)的基因進(jìn)行RNA分析。
全文摘要
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
涉及懷孕母體血液樣品中胎兒或母體RNA的檢測，并且涉及將樣品進(jìn)行測試，尋找其中指示胎兒或母親的狀況或特征的胎兒或母親的分析指標(biāo)。例如RNA分析可以包括通過分析母親血液樣品而對未出生的胎兒的基因表達(dá)模式進(jìn)行評價(jià)。首先利用出生前監(jiān)測技術(shù)僅通過分析母親血液樣品就可檢測胎兒表達(dá)的基因。在特定的實(shí)施方案中，出生前監(jiān)測技術(shù)是基于發(fā)現(xiàn)了在懷孕婦女血漿中胎兒來源的RNA的循環(huán)。總之，對懷孕婦女的血清或血漿樣品的檢測方法包括測定樣品中胎兒或母親來源的RNA的存在。
文檔編號C12Q1/68GK1469932SQ01817445
公開日2004年1月21日 申請日期2001年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月17日
發(fā)明者盧煜明, 潘烈文 申請人:香港中文大學(xué)