專利名稱：一種酵母基因工程菌及內(nèi)切菊粉酶制劑和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是基因工程菌，特別是一種高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌及菊粉酶制劑和內(nèi)切菊粉酶水解菊粉制備低聚果糖的方法。
背景技術(shù)：
低聚糖是指二至十個(gè)單糖單位通過(guò)糖苷鍵連接起來(lái)形成直鏈或分支鏈的一類糖，它具有低熱、穩(wěn)定、安全無(wú)毒等良好生理特性，還具有使腸內(nèi)有益菌增加，有害菌減少的生理功能。在食品生產(chǎn)和藥品生產(chǎn)中有著廣泛的前景。
目前，工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖有兩種方法。一種是蔗糖轉(zhuǎn)化，另一種是以菊粉(或稱菊糖，一種從菊芋中制取的產(chǎn)品)為原料通過(guò)酸解法或酶解法獲得的。酶解法有很多優(yōu)點(diǎn)，無(wú)污染、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)效益好，是世界各國(guó)推崇的方法。酶解法生產(chǎn)中如何獲得高活性的菊粉酶是生產(chǎn)中的關(guān)鍵。目前通常從黑曲霉中培養(yǎng)分離純化提取菊粉酶。(見(jiàn)微生物學(xué)通報(bào)1998年25(4)期第195頁(yè)，名稱為“黑曲霉菊粉酶的分離純化及其活性測(cè)定”的報(bào)導(dǎo)，所用菌種為曲霉P319)。也有從酵母中培養(yǎng)分離純化提取菊粉酶(見(jiàn)天津微生物雜志94年第13頁(yè)----26頁(yè)，天津工業(yè)微生物研究所的名為“菊粉分解酶及其應(yīng)用技術(shù)的研究”的報(bào)導(dǎo)，所用菌種為脆壁克維酵母菌KF 9031)，上述菌種只是用常規(guī)篩選，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行基因工程改造，所以產(chǎn)生的菊粉酶活性小于100u/ml，一般只有50u/ml左右。效果并不十分理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程的手段構(gòu)建能高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌，并從其中培養(yǎng)分離純化制取內(nèi)切菊粉酶，從而能高效、經(jīng)濟(jì)地轉(zhuǎn)化制備低聚果糖。
使用的微生物本發(fā)明涉及的酵母基因工程菌Pichia pastoris GS115/HY005，它具有高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的特性，該菌株于2001年8月31日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NoM201032(以下簡(jiǎn)稱HY005)。
HY005菌株的菌學(xué)特性a、形態(tài)特征畢赤酵母的的無(wú)性生殖為芽殖，有時(shí)有假菌絲。有性生殖產(chǎn)生子囊內(nèi)含有1----4枚光滑圓形、禮帽形或土星子囊孢子。
b、生理生化特性畢赤酵母能利用特殊的物質(zhì)為原料生長(zhǎng)，如石油、甲醇、氨態(tài)氮、有機(jī)酸等。HY005菌株具有畢赤酵母的生理生化特性，同時(shí)因插入了內(nèi)切菊粉酶基因，具有高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶基因的特性。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。酵母基因工程菌HY005(Pichia pastoris)是通過(guò)PCR方法或者DNA文庫(kù)雜交方法，從曲霉屬菌株篩選獲得內(nèi)切菊粉酶基因，將用上述PCR方法或者DNA文庫(kù)雜交方法克隆到的內(nèi)切菊粉酶基因插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體中，然后將得到的含內(nèi)切菊粉酶基因表達(dá)載體導(dǎo)入到畢赤酵母中，再?gòu)闹泻Y選出一種高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌HY005菌株。
具體做法是，根據(jù)黑曲霉內(nèi)切菊粉酶基因序列，應(yīng)用PCR方法用曲霉NRRL3135的DNA為模板，擴(kuò)增出0.5----2Kb的DNA片段，克隆到T----載體pMD18--T上，經(jīng)測(cè)序證實(shí)后，將克隆到NRRL3135的內(nèi)切菊粉酶基因插入到畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)載體PIC3.5k的表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)中，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母宿主GS115中，再?gòu)闹泻Y選出高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌。
將高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌HY005，在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中，溫度28℃----30℃，經(jīng)24----148小時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)(每隔一定時(shí)間測(cè)酶活，酶活性達(dá)250----450u/ml時(shí)停止誘導(dǎo)培養(yǎng))，將完成誘導(dǎo)培養(yǎng)的酵母基因工程菌經(jīng)高速離心除去菌體，收集上清液，即粗酶液，經(jīng)過(guò)濾濃縮即得內(nèi)切菊粉酶產(chǎn)品。
應(yīng)用上述的內(nèi)切菊粉酶粗酶液水解制備低聚果糖的方法，其步驟為；1)、將菊粉用10----50mM、pH5.0----7.0的醋酸納緩沖液配制成濃度為10----20％的菊粉溶液2)、按每50----100g菊粉對(duì)應(yīng)1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃----60℃、時(shí)間4----12小時(shí)進(jìn)行水解反應(yīng)；4)將水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)?，取上清液，再?jīng)微濾、超濾、真空干燥、即為低聚果糖成品。
用高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌制備的內(nèi)切菊粉酶，其酶活性可達(dá)300u/ml以上，(一般方法為100u/ml以下)，所以水解反應(yīng)時(shí)間短(一般方法為24----48小時(shí))，轉(zhuǎn)化效率高。將水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)?，取上清液，再?jīng)微濾、超濾、真空干燥后稱重，計(jì)算收率為65----85％，進(jìn)行薄層層析或質(zhì)譜鑒定表明2----10糖的低聚果糖含量占85％----95％。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)已發(fā)表的黑曲霉的內(nèi)切菊粉酶基因序列，應(yīng)用PCR方法，用無(wú)花果曲霉NRRL3135的DNA為模板，增出大約1.5kb的DNA片段，克隆到T--載體pMD18--T上，經(jīng)DNA序列分析證實(shí)克隆的片段包含有NRRL3135的一個(gè)內(nèi)切菊粉酶基因，與已發(fā)表的黑曲霉內(nèi)切菊粉酶基因InB有約98％同源性。
通過(guò)亞克隆將克隆到的NRRL3135的內(nèi)切菊粉酶基因插入到畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)載體PIC3.5k的表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)中，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母宿主GS115中，并對(duì)得到的若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。
實(shí)施例1鑒定確證導(dǎo)入了內(nèi)切菊粉酶基因GS115轉(zhuǎn)化子若干(如8----10個(gè))，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的OD600達(dá)到2.0----6.0；轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于28℃----30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)，每隔10小時(shí)取樣，對(duì)所取樣進(jìn)行SDS--PAGE電泳分析。
選擇、誘導(dǎo)、培養(yǎng)高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶效果的菌株HY005(GS115+內(nèi)切菌粉酶基因)，重復(fù)上述過(guò)程進(jìn)行較大規(guī)模(100----1000ml的裝瓶量)的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其間取樣進(jìn)行SDS--PAGE分析，當(dāng)產(chǎn)酶水平達(dá)250u/ml以上時(shí)，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含內(nèi)切菊粉酶的上清液，即為粗酶液，粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，酶活性為250u/ml。
實(shí)施例2鑒定確證導(dǎo)入了內(nèi)切菊粉酶基因GS115轉(zhuǎn)化子若干(如8----10個(gè))，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的OD600達(dá)到2.0----6.0；轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于28℃----30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)，其間前48小時(shí)，每隔10小時(shí)取樣，48小時(shí)后，每間隔24小時(shí)取樣，對(duì)所取樣進(jìn)行SDS--PAGE電泳分析。
選擇、誘導(dǎo)、培養(yǎng)高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶效果的菌株HY005(GS115+內(nèi)切菌粉酶基因)，重復(fù)上述過(guò)程進(jìn)行較大規(guī)模(100----1000ml的裝瓶量)的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其間取樣進(jìn)行SDS--PAGE分析，當(dāng)產(chǎn)酶水平達(dá)350u/ml以上時(shí)，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含內(nèi)切菊粉酶的上清液，即為粗酶液，粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，酶活性為350u/ml。
實(shí)施例3鑒定確證導(dǎo)入了內(nèi)切菊粉酶基因GS115轉(zhuǎn)化子若干(如8----10個(gè))，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的OD600達(dá)到2.0----6.0；轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于28℃----30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)168小時(shí)，其間前48小時(shí)，每隔10小時(shí)取樣，48小時(shí)后，每間隔24小時(shí)取樣，對(duì)所取樣進(jìn)行SDS--PAGE電泳分析。
選擇、誘導(dǎo)、培養(yǎng)高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶效果的菌株HY005(GS115+內(nèi)切菌粉酶基因)，重復(fù)上述過(guò)程進(jìn)行較大規(guī)模(100----1000ml的裝瓶量)的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其間取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，當(dāng)產(chǎn)酶水平達(dá)450u/ml以上時(shí)，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含內(nèi)切菊粉酶的上清液，即為粗酶液，粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，酶活性為450u/ml。
粗酶液水解時(shí)間將100----1000g抽提于菊芋的菊粉用10---50mM的pH5.0----7.0的醋酸納緩沖液配制成10----20％的菊粉溶液，再按50----100g菊粉對(duì)應(yīng)1ml粗液的比例加酶，于45℃----60℃進(jìn)行4----12小時(shí)的水解反應(yīng)。
將上述水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)瑢⑸锨逡阂来挝V、超濾、真空干燥后稱重，計(jì)算收率為65----85％，取部分干燥物重新按一定比例溶于蒸餾水中，進(jìn)行薄層層析或質(zhì)譜鑒定表明2----10糖的低聚果糖含量占85％----95％。
權(quán)利要求
1.一種酵母基因工程菌(Pichia pastoris GS115/HY005)是通過(guò)PCR方法或者DNA文庫(kù)雜交方法，從曲霉屬菌株篩選獲得內(nèi)切菊粉酶基因，將用上述PCR方法或者DNA文庫(kù)雜交方法克隆到的內(nèi)切菊粉酶基因插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體中，然后將得到的含內(nèi)切菊粉酶基因表達(dá)載體導(dǎo)入到畢赤酵母中，再?gòu)闹泻Y選出一種高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌，其特征在于根據(jù)黑曲霉內(nèi)切菊粉酶基因序列，應(yīng)用PCR方法用曲霉NRRL3135的DNA為模板，擴(kuò)增出0.5----2Kb的DNA片段，克隆到下一載體pMD18-T上，測(cè)序證實(shí)后，再將克隆到NRRL3135的內(nèi)切菊粉酶基因插入到畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)載體PIC3.5k的表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)中，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母宿主GS115中，再?gòu)闹泻Y選出高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌。
3.按權(quán)利要求1的酵母基因工程菌制備的內(nèi)切菊粉酶，其特征在于將高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌，在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中，溫度28℃-30℃，經(jīng)24----148小時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)(每隔一定時(shí)間測(cè)酶活，酶活性達(dá)250----450u/ml時(shí)停止誘導(dǎo)培養(yǎng))，將完成誘導(dǎo)培養(yǎng)的酵母基因工程菌經(jīng)高速離心出除菌體，收集上清液，即粗酶液，經(jīng)過(guò)濾濃縮即得內(nèi)切菊粉酶產(chǎn)品。
4.按權(quán)利要求3所述的內(nèi)切菊粉酶水解制備低聚果糖的方法，其特征在于；1)、將菊粉用10----50mM、pH5.0----7.0的醋酸納緩沖液配制成濃度為10----20％的菊粉溶液；2)、按每50----100g菊粉對(duì)應(yīng)1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃----60℃、時(shí)間4----12小時(shí)進(jìn)行水解反應(yīng)；4)將水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)∩锨逡?，再?jīng)微濾、超濾、真空干燥、即為低聚果糖成品。
全文摘要
本發(fā)明提出一種酵母基因工程菌Pichia pastorisGS115/HY005是通過(guò)PCR方法或者DNA文庫(kù)雜交方法,從曲霉屬菌株篩選獲得內(nèi)切菊粉酶基因,將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體中,然后將得到的含內(nèi)切菊粉酶基因表達(dá)載體導(dǎo)入到畢赤酵母中,再?gòu)闹泻Y選出一種高效表達(dá)內(nèi)切菊粉酶的酵母基因工程菌。用該酵母基因工程菌制備的內(nèi)切菊粉酶,其酶活性可達(dá)300u/ml以上,用其水解菊粉反應(yīng)時(shí)間短,轉(zhuǎn)化效率高,從而能高效、經(jīng)濟(jì)地轉(zhuǎn)化制備低聚果糖。
文檔編號(hào)C12N9/24GK1341709SQ01128440
公開(kāi)日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2001年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月11日
發(fā)明者馬立新, 蔣思婧 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)