專利名稱：新的乙內(nèi)酰脲水解酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工程、發(fā)酵和藥物中間體合成領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的海因酶(又稱為乙內(nèi)酰脲水解酶或乙內(nèi)酰脲酶)、編碼該海因酶的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種海因酶的方法。本發(fā)明還涉及含該海因酶的載體和宿主細(xì)胞及其在生產(chǎn)藥物中間體D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-pHPG)方面的用途。本發(fā)明還涉及了可用于生產(chǎn)D-pHPG的氨甲酰水解酶。
由于羥氨芐青霉素(Amoxyeillin)、頭孢羥氨芐(cefadroxil)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢羅奇(cefaprozil)等半合成β-內(nèi)酰胺抗生素，具有抗菌活力強(qiáng)，廣譜低毒等特性，已成為臨床控制細(xì)菌感染的首選藥物。作為該類藥物合成中間體之一的D-對(duì)羥基苯甘氨酸，也因此受到制藥和化工產(chǎn)業(yè)的重視。
D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-pHPG)的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是指通過化學(xué)合成和拆分的方法，但該工藝存在收率低，環(huán)境污染嚴(yán)重等弊端。
自八十年代以來，酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的研究和應(yīng)用得到重視。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲縮合得到D，L-對(duì)羥基苯乙內(nèi)酰脲(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2，DHase)立體專一性水解開環(huán)生成D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在堿性或存在消旋酶條件下，未被開環(huán)的L-型對(duì)映體消旋化為D-型而被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。因此，通過這種酶促不對(duì)稱水解混消旋底物，pHPH可被完全轉(zhuǎn)化，而不象化學(xué)拆分法，收率不到50％。在工業(yè)上已有采用固定化的D-海因酶或固定化細(xì)胞進(jìn)行該步反應(yīng)的報(bào)道。由D-海因酶催化生成的D-CpHPG，可通過以下二種方法而脫去氨甲?；?，得到終產(chǎn)物D-pHPG(1)HNO2重氮化的化學(xué)法，和(2)氨甲酰水解酶(D-Carbamylase，DCase)的生物轉(zhuǎn)化法(


圖1)。
S.Takahashi等曾采用將乙內(nèi)酰脲化學(xué)合成、酶促不對(duì)稱水解和亞硝酸重氮化脫氨甲酰基三者相結(jié)合的酶化學(xué)工藝，由D，L-5-乙內(nèi)酰脲生產(chǎn)D-氨基酸，但存在亞硝酸的化學(xué)誘變作用而導(dǎo)致的三廢污染和勞動(dòng)防護(hù)等問題。
以氨甲?；拿复偎馊〈瘜W(xué)重氮化法進(jìn)行第二步反應(yīng)的雙酶法，不論從可行性和環(huán)境保護(hù)考慮，都是極有意義的。Kanegafuchi公司和我國山西太原生物研究所曾分別采用同時(shí)產(chǎn)生海因酶和氨甲酰水解酶的Agrobacteriumradiobacter或Pseudomonas sp2262的休止細(xì)胞將pHPH轉(zhuǎn)化為D-pHPG。該技術(shù)的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率低，需要誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)物產(chǎn)生的異味損害人體健康并污染環(huán)境。
近年來，在分離產(chǎn)酶菌株的同時(shí)，已對(duì)(1)產(chǎn)DHase的Pseudomonasfluorescens DSM84，Bacillus stearothermophilis NS1122A，Pseudomonasputida CCRC12857，(2)產(chǎn)DCase的Agrobacterium sp KNK003，以及(3)同時(shí)產(chǎn)DHase和DCase的Agrobacterium radiobacter B11921的相關(guān)酶基因進(jìn)行克隆，得到了其中的相關(guān)酶基因，并對(duì)克隆后的基因進(jìn)行分子生物學(xué)操作，以改進(jìn)相關(guān)酶的酶學(xué)性質(zhì)。然而，迄今為止還沒有克隆出Burholderiapickettii(皮氏伯克霍爾德氏菌)的海因酶和氨甲酰水解酶的基因。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)不同來源的海因酶和氨甲酰水解酶，以及新的生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝。
本發(fā)明的目的就是提供一種新的海因酶以及其片段、類似物和衍生物，及其編碼序列。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)海因酶的方法以及其用途。
本發(fā)明的另一目的是提供新的高效、無害的生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝。
在本發(fā)明的第一方面，提供了新穎的分離出的海因酶，它包含具有SEQ IDNO4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的海因酶的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述海因酶的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種具有SEQ ID NO3中1758-3128位的序列；具有SEQ ID NO3中1-3439位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有海因酶活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)海因酶的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有海因酶活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明海因酶、其編碼序列、載體或宿主細(xì)胞的用途。它們可用于生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種新的生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝以及用于該工藝的氨甲酰水解酶和工程菌。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
圖1是D-對(duì)羥基苯甘氨酸的合成圖。
圖2A是DCase表達(dá)載體pXZpC2的構(gòu)建示意圖。
圖2B是DHase表達(dá)載體pXZpH2的構(gòu)建示意圖。
圖3是海因酶和氨甲酰水解酶表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖。其中各泳道是1.誘導(dǎo)前的pXZpH2/BL21；2.誘導(dǎo)后的pXZpH2/BL21；3，7.蛋白Maker；4.空載體；5.誘導(dǎo)前的pXZpC2/BL21；6.誘導(dǎo)后的pXZpC2/BL21。
圖4是DCase的DNA和氨基酸序列。
圖5是DHase的DNA和氨基酸序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“海因酶”、“乙內(nèi)酰脲酶”、“乙內(nèi)酰脲水解酶”或“DHase”可互換使用，都指具有海因酶氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的海因酶。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的海因酶蛋白或多肽”是指海因酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化海因酶?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶本發(fā)明的海因酶可以是重組的、天然的、合成的，優(yōu)選是重組的。本發(fā)明的海因酶可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括海因酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然海因酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“海因酶”指具有海因酶活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與海因酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括海因酶的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與海因酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗海因酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含海因酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了海因酶的可溶性片段。通常，該片段具有海因酶序列的至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供海因酶或多肽的類似物。這些類似物與天然海因酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“海因酶保守性變異多肽”指與SEQ ID NO4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表A進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表A
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO4的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼海因酶成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)+非編碼序列。
術(shù)語“編碼海因酶的多核苷酸”可以是包括僅編碼海因酶的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO4所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼海因酶的多聚核苷酸。
本發(fā)明的海因酶核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或海因酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的海因酶。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼海因酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，海因酶多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含海因酶編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、以及新霉素抗性，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞。較佳地是大腸桿菌。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的酶還包括固定在載體上的固定化酶。本領(lǐng)域熟知的各種固定化酶技術(shù)都可用于制備本發(fā)明的固定化的海因酶和或氨甲酰水解酶。
此外，本發(fā)明提供了海因酶、其編碼序列、載體或宿主細(xì)胞的用途，它們被用于生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的雙酶法工藝。該工藝包括步驟(a)在pH8-9條件下，通過海因酶的催化作用使D-對(duì)羥基苯乙內(nèi)酰脲發(fā)生不對(duì)稱水解，形成N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸；(b)N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸通過氨甲酰水解酶或表達(dá)該氨甲酰水解酶的重組工程菌，被轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸。
此外，L-對(duì)羥基苯乙內(nèi)酰脲被消旋化再形成D-對(duì)羥基苯乙內(nèi)酰脲，作為步驟(a)的原料(
圖1)。
因此，本發(fā)明還提供了一種新的生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝以及用于該工藝的氨甲酰水解酶和工程菌。一種從皮氏伯克霍爾德氏菌中新分離出的氨甲酰水解酶具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其核酸序列示于SEQ ID NO1，其中閱讀框位于第2065-2976位。
與上面關(guān)于海因酶的描述相同，本發(fā)明提供了編碼氨甲酰水解酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
鑒于海因酶和氨甲酰水解酶都用于D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝，因此一種優(yōu)選的工程菌是同時(shí)攜帶海因酶和氨甲酰水解酶基因，并表達(dá)海因酶和氨甲酰水解酶的工程菌，例如大腸桿菌。
本發(fā)明的工藝優(yōu)點(diǎn)在于克服了原生產(chǎn)工藝中的轉(zhuǎn)化效率低，生產(chǎn)周期長，特別是嚴(yán)重的環(huán)境污染，以及工人的勞動(dòng)保護(hù)問題。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1皮氏伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pickettii)的培養(yǎng)和總DNA的分離50ml的LB液體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含有10g酵母粉，5g蛋白胨，10g氯化納，pH值7.0)中接種一個(gè)單菌落，28℃培養(yǎng)36小時(shí)。將收獲的培養(yǎng)液4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，懸浮細(xì)菌沉淀于15ml TE緩沖液中，加入蛋白酶K和SDS至終濃度分別為100ug/ml和0.5％?；靹颍⒂?7℃溫育過夜至溶液清亮。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，緩慢混勻后于8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，用大口移液管移出上層水相。反復(fù)抽提，直至沒有白色中間層。最后一次將上層轉(zhuǎn)入新管(注意不要帶入有機(jī)相)，加入1/10體積的3M的醋酸納，再加入2倍體積的無水乙醇，混勻。用封口的玻璃滴管繞出DNA，將其轉(zhuǎn)入新瓶中，用70％乙醇洗去鹽份，干燥DNA，溶解于TE緩沖液。在其中加入RNAase至終濃度100ug/ml，于37℃溫育1.5小時(shí)。然后在其中加入0.2體積的10M的醋酸銨，再加入2倍體積的無水乙醇，用封口的玻璃滴管繞出DNA，將其轉(zhuǎn)入新瓶中，用70％乙醇洗去鹽份，干燥DNA，溶解于TE緩沖液至終濃度250ng/ul。于4℃保存。
實(shí)施例2目的片段的檢測(cè)分別取40ul總DNA，在200ul的反應(yīng)體系中用8ul ClaI，EcoRI，EcoRV，XhoI和20ul相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)。反應(yīng)兩小時(shí)后，從反應(yīng)體系中取出5ul，加入0.5ul加樣緩沖液，用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳以觀察是否酶切完全。待總DNA酶切完全后，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻后與12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)入新管，加入1/10體積的3M的醋酸鈉，再加入2倍體積的無水乙醇，混勻后于-70℃放置5分鐘，然后于12000轉(zhuǎn)離心5分鐘。倒去液體，用70％乙醇洗去鹽份，室溫晾干，溶于40ul雙蒸水。用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，1V/cm電泳過夜。將電泳后的瓊脂糖凝膠室溫下浸泡在20倍體積的0.25M鹽酸溶液中5-15分鐘，直至凝膠中的溴酚藍(lán)恰好變?yōu)辄S色為止。將膠轉(zhuǎn)移至盛有20倍體積的1.5MNaCl，0.5M NaOH溶液中，室溫下浸泡20分鐘，更換新液，再浸泡20分鐘。將膠轉(zhuǎn)移至盛有20倍體積的1.0M Tris-Cl，1.5MNacl溶液(pH7.5)中，室溫下浸泡20分鐘，更換新液，再浸泡20分鐘。將膠底朝上放在水平玻璃板的板面上，趕走兩層之間的氣泡。裁一張與凝膠一樣大小的尼龍膜做好標(biāo)記，使用前用蒸餾水浸濕，再用10×SSC浸沒至少5分鐘，放在凝膠上，趕走兩層之間的氣泡。裁兩張與凝膠一樣大小的新華二號(hào)濾紙，和尼龍膜進(jìn)行相同的處理后，放在尼龍膜上，趕走氣泡，再在濾紙上放一疊紙巾，在紙巾上方放一塊玻板和500克的重物，轉(zhuǎn)移約兩小時(shí)或更長。取下轉(zhuǎn)移好的尼龍膜，在4×SSC中浸泡5分鐘，室溫干燥30分鐘，80℃烘干30分鐘，供雜交用。
按照Roche公司提供的DIG High Primer DNA Labeling and DetectionStarter Kit II使用手冊(cè)進(jìn)行雜交。加1ug模板DNA用雙蒸水稀釋到16ul，煮沸10分鐘后迅速冰浴，加入4ul DIG-High Primer 37℃放置過夜，再用65℃水浴10分鐘滅活酶。檢測(cè)標(biāo)記效率為100ng/ul。用DIG Easy Hyb 10ml 42℃預(yù)雜交30分鐘，換用新的DIG Easy Hyb在其中加入250ng已變性的DIG-標(biāo)記的DNA探針，42℃放置過夜。68℃用0.5×SSC，0.1％SDS洗膜兩次，每次15分鐘。用洗滌緩沖液洗1-5分鐘，用封閉緩沖液室溫處理30分鐘，再用抗體溶液處理30分鐘，洗滌緩沖液作用2×15分鐘，檢測(cè)緩沖液處理2-5分鐘后，將適量CSPD加到膜上，在膜上封口，室溫放15-25分鐘，37℃放10分鐘，用X-光片曝光檢測(cè)有雜交的條帶。其中片段大小合適的是EcoR V的雜交條帶。
實(shí)施例3目的片段的分離取40ul總DNA，在200ul的反應(yīng)體系中用8ul EcoRV和20ul相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)。反應(yīng)兩小時(shí)后，從反應(yīng)體系中取出5ul，加入0.5ul加樣緩沖液，用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳以觀察是否酶切完全。待總DNA酶切完全后，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻后與12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)入新管，加入1/10體積的3M的醋酸鈉，再加入2倍體積的無水乙醇，混勻后于-70℃放置5分鐘，然后于12000轉(zhuǎn)離心5分鐘。倒去液體，用70％乙醇洗去鹽份，室溫晾干，溶于40 ul雙蒸水。用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，1V/cm電泳過夜。割下電泳后與檢測(cè)到有雜交的位置相同的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收目的片段(50ng/ul)。
按照《分子克隆》中小量抽提質(zhì)粒的方法，抽提pBluKS，將17ul抽提好的質(zhì)粒(100ng/ul)在20ul的反應(yīng)體系中用1ul EcoRI和2ul相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。割下3kb附近的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收到40ul的體系中。
取17ul回收物加入2ul去磷酸化酶緩沖液和0.1單位的去磷酸化酶(Promega公司)于37℃反應(yīng)30分鐘，用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。割下3kb附近的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收(60ng/ul)。
按照MBI公司提供的連接酶最適反應(yīng)體系20ul中加入外源片段2ul和載體1ul以及緩沖液2ul和酶0.5ul在22℃連接過夜，65℃滅活10分鐘。取2ul加入100ul氯化鈣法制備的轉(zhuǎn)化效率達(dá)107的大腸桿菌DH5α，冰上放置30分鐘，42℃熱激70秒，加700ulLB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)45分鐘復(fù)壯，取200ul涂在含有規(guī)定濃度的X-gal和IPTG的氨芐青霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜。
挑取白斑先接種到氨芐青霉素平板上，再接種到鋪有尼龍膜的氨芐青霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜，相對(duì)應(yīng)于每一張濾膜，在一片Saran包裝膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml)，使菌落面朝上，將濾膜放到小洼上，展平Saran包裝膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘，用干的紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，重復(fù)以上過程。再次吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris-Cl(pH7.4)的Saran包裝膜小洼上，5分鐘后，吸干濾膜，重復(fù)這一步。吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1.5mol/L NaCl、0.5mol/LTris-Cl(pH7.4)的Saran包裝膜小洼上，5分鐘后，吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到一張干的3MM濾紙上，于室溫晾至少30分鐘，使濾膜干燥。將濾膜夾在兩張干的3MM濾紙之間，在真空爐中于80℃干烤2小時(shí)，以固定DNA。
按實(shí)施例2中所述的方法，將膜進(jìn)行雜交。雜交斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的克隆即為帶有目的片段的克隆。結(jié)果得到一個(gè)陽性克隆-質(zhì)粒pXZ-total。
實(shí)施例4目的片段的分析將帶有目的片段的克隆用ClaI，EcoRV，HincII，NotI，SacI，SmaI，SpeI在20ul的反應(yīng)體系中用1ul酶和2ul相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。然后，與實(shí)施例2進(jìn)行相同的轉(zhuǎn)膜操作。同樣按照Roche公司提供的DIG High PrimerDNA Labeling and Detection Starter Kit II使用手冊(cè)進(jìn)行雜交。
結(jié)果表明NotI所切出的片段適合測(cè)序。割下NotI切出的三條瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收。按照《分子克隆》中小量抽提質(zhì)粒的方法抽提pBluKS。將17ul抽提好的質(zhì)粒(100ng/ul)在20ul的反應(yīng)體系中用1ul NotI和2ul相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。割下3kb附近的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收到40ul的體系中。
取17ul回收物加入2ul去磷酸化酶緩沖液和0.1單位的去磷酸化酶(Promega公司)于37℃反應(yīng)30分鐘，用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。割下3kb附近的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收(60ng/ul)。
按照MBI公司提供的連接酶最適反應(yīng)體系20ul中加入外源片段2ul和載體1ul以及緩沖液2ul和酶0.5ul在22℃連接過夜，65℃滅活10分鐘。取2ul加入100ul轉(zhuǎn)化效率達(dá)107的大腸桿菌DH5 α，冰上放置30分鐘，42℃熱激70秒，加700ul LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)45分鐘復(fù)壯，取200ul涂在含有規(guī)定濃度的X-gal和IPTG的氨芐青霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜。挑取白斑用于測(cè)序。測(cè)序由上?；倒镜臏y(cè)序儀完成。
將分開測(cè)序的兩目的基因用BioEdit分析，拼接為兩個(gè)完整的讀框(見SEQID NO1-4)，SEQ ID NO1和2為氨甲酰水解酶的DNA序列和氨基酸序列，閱讀框位于SEQ ID NO1中第2065-2976位，編碼一個(gè)347個(gè)氨基酸的氨甲酰水解酶。SEQ ID NO3和4為海因酶的DNA序列和氨基酸序列，閱讀框位于SEQ ID NO3中第1758-3128位，編碼一個(gè)457個(gè)氨基酸的氨甲酰水解酶。有趣的是，這兩個(gè)酶分別位于同-3439bp雙鏈DNA的兩條鏈上。
用GCG進(jìn)行同源分析，結(jié)果表明皮氏伯克霍爾德氏菌海因酶與Agrobacterim.radiobacter海因酶在氨基酸水平有85％的同源性，與Bacillus.sterothermophilus海因酶有47％的同源性，與Pseudomonas.putida的海因酶有35％的同源性。氨甲酰水解酶的基因與其他物種的氨甲酰水解酶基因高度同源與Agrobacterim.sp KNK712有98％的同源性Agrobacterim.radiobacter有92％的同源性。
實(shí)施例5含氨甲酰氨基酸水解酶目的基因表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建參見圖2A。用Primer程序設(shè)計(jì)引物，氨甲酰氨基酸水解酶用5′cgagctagcatgacacgtcagatgatac和5′aagctttcagagttccgcga兩條引物，以帶有目的片段的克隆為模板，94℃變性5分鐘后，94℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃放10分鐘用于加A，得到大量目的基因片段。電泳后利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收(50ng/ul)目的基因片段(外源片段)。
按照Promega公司pGEMT-EASY vector system提供的最適反應(yīng)體系10ul中加入外源片段1ul和載體pGEMT-EASY 1ul以及緩沖液5ul和酶0.5ul在22℃連接1小時(shí)，65℃滅活10分鐘。取5ul加入100ul轉(zhuǎn)化效率達(dá)107的大腸桿菌DH5α，冰上放置30分鐘，42℃熱激70秒，加500ulLB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)45分鐘復(fù)壯，取200ul涂在含有規(guī)定濃度的X-gal和IPTG的氨芐青霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜，挑取白斑接入試管。按照《分子克隆》中所述的方法小量抽提質(zhì)粒pXZpCl，用0.5ul NheI和0.5ul HindIII在20ul含有相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。割下0.9kb附近的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收到20ul的體系中。
在連接反應(yīng)體系10ul中加入外源片段4ul和經(jīng)過NheI和HindIII酶切的載體pET28b 4ul以及緩沖液1ul和酶0.5ul在16℃連接過夜，65℃滅活10分鐘。取5ul加入100ul轉(zhuǎn)化效率達(dá)107的大腸桿菌DH5α，冰上放置30分鐘，42℃熱激70秒，加500ulLB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)45分鐘復(fù)壯，取200ul涂在含有規(guī)定濃度的卡那霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接入試管。按照《分子克隆》中所述方法小量抽提質(zhì)粒pXZpC2，用0.5ul NheI和0.5ul HindIII在20ul含有相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘，以驗(yàn)證所挑取的克隆是否正確。
將構(gòu)建好的表達(dá)載體pXZpC2用氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，得到大腸桿菌BL21(DE3)-pXZpC2工程菌。將獲得的攜帶質(zhì)粒pXZpC2的大腸桿菌于2000年12月6日并于2000年11月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0520.2。
實(shí)施例6含海因酶目的基因表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建參見圖2B。用5′gctagcatggacatcattatcaaa和5′aagcttaatgccggtttactg兩條引物，以帶有目的片段的克隆為模板，94℃變性5分鐘后，94℃變性1分鐘，51℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃放10分鐘用于加A，得到大量含乙內(nèi)酰脲水解酶目的基因片段。電泳后利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收(100ng/ul)。
按照Promega公司pGEMT-EASY vector system提供的最適反應(yīng)體系10ul中加入外源片段1ul和載體1ul以及緩沖液5ul和酶0.5ul在22℃連接1小時(shí)，65℃滅活10分鐘。取5ul加入100ul轉(zhuǎn)化效率達(dá)107的大腸桿菌DH5α，冰上放置30分鐘，42℃熱激70秒，加500ulLB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)45分鐘復(fù)壯，取200ul涂在含有規(guī)定濃度的X-gal和IPTG的氨芐青霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜，挑取白斑接入試管。按照《分子克隆》所述的方法小量抽提質(zhì)粒pXZpH1，用0.5ul NheI和0.5ul HindIII在20ul含有相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘。割下1.4kb附近的瓊脂糖條帶，利用華舜公司生產(chǎn)的膠回收柱回收到20ul的體系中。在連接反應(yīng)體系10ul中加入外源片段5.5ul和經(jīng)過NheI和HindIII酶切的載體pET28b 3ul以及緩沖液1ul和酶0.5ul在16℃連接過夜，65℃滅活10分鐘。取5ul加入100ul轉(zhuǎn)化效率達(dá)107的大腸桿菌DH5α，冰上放置30分鐘，42℃熱激70秒，加500ulLB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)45分鐘復(fù)壯，取200ul涂在含有規(guī)定濃度的卡那霉素平板。37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接入試管。按照《分子克隆》中所述的方法小量抽提質(zhì)粒pXZpH2，用0.5ul NheI和0.5ulHindIII在20ul含有相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)體系中進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，反應(yīng)兩小時(shí)后用0.8％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，5V/cm電泳30分鐘，以驗(yàn)證所挑取的克隆是否正確。
將構(gòu)建好的表達(dá)載體pXZpH2用氯化鈣法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，得到大腸桿菌BL21(DE3)-pXZpH2工程菌。將獲得的攜帶質(zhì)粒pXZpH2的大腸桿菌于2000年12月6日并于2000年11月6日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0520.1。
實(shí)施例7目的基因的表達(dá)挑取單菌落接入含有50ug/ml卡那霉素的LB試管，培養(yǎng)過夜，再按1％的接種量接入一管新的含有50ug/ml卡那霉素的LB試管中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.6時(shí)，加入終濃度1mM的IPTG，再培養(yǎng)2小時(shí)，分別收集誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體。將菌體全細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE，分析蛋白表達(dá)量(見圖3)，其中海因酶的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的30..8％，氨甲酰水解酶的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的42.2％。
實(shí)施例8帶有目的片斷的菌體活力測(cè)定A.氨甲酰氨基酸水解酶酶活測(cè)定方法將過夜培養(yǎng)的pXZpC2/BL21(DE3)菌液，按1％接種量接種48mlLB液體搖瓶，培養(yǎng)至OD600＝0.6時(shí)，再加入IPTG，終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)2小時(shí)，離心收集菌體用20ml生理鹽水洗滌，最后懸浮在3ml pH8.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，稀釋50倍測(cè)OD600。在冰箱中凍存過夜，取經(jīng)40℃預(yù)熱的菌液0.2ml和0.2ml 1％底物濃度的pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液混勻在40℃反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，立刻離心沉淀菌體，取100ul上清加入100ul pH5.5的NaAc-HAc緩沖液，再加入3ml 0.5％ninhydrin和0.5％hydrindantin的乙二醇甲醚溶液，60℃反應(yīng)30分鐘，然后振蕩于室溫穩(wěn)定1小時(shí)，測(cè)定OD570。用已知濃度溶液100ul加入100ul pH5.5的NaAc-HAc緩沖液，再加入3ml 0.5％ninhydrin和0.5％hydrindantin的乙二醇甲醚溶液，60℃反應(yīng)30分鐘，然后振蕩于室溫穩(wěn)定1小時(shí)，測(cè)定OD570，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出K值，根據(jù)公式，計(jì)算酶活。
結(jié)果如表1所示表1pXZpC2氨甲酰氨基酸水解酶活力測(cè)定
測(cè)試菌是大腸桿菌-pXZpC2酶活力(U/ml)＝K×OD570×4×15/0.5×48×M1U酶活定義為每小時(shí)產(chǎn)生1um相應(yīng)產(chǎn)物所需酶量。
B.乙內(nèi)酰脲水解酶酶活測(cè)定方法將過夜培養(yǎng)的pXZpH2/BL21(DE3)菌液，按1％接種量接種48mlLB液體搖瓶，培養(yǎng)至OD600＝0.6時(shí)，再加入IPTG，終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)2小時(shí)，離心收集菌體用20ml生理鹽水洗滌，最后懸浮在3ml pH8.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，稀釋50倍測(cè)OD600。將菌液分裝為每管1ml，離心，菌體懸浮在1.2ml合適底物溶液(1％的對(duì)羥基苯海因，海因，0.5％的二氫尿嘧啶)的pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，每管0.3ml，40℃反應(yīng)1小時(shí)，立刻離心取上清250ul加入550ul 5％對(duì)二甲胺基苯甲醛的6N鹽酸溶液，測(cè)定OD438。用已知濃度溶液250ul加入550ul 5％對(duì)二甲胺基苯甲醛的6N鹽酸溶液，測(cè)定OD438，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出K值，根據(jù)公式，計(jì)算酶活。
結(jié)果如表2所示表2pXZpH2乙內(nèi)酰脲酶活力測(cè)定結(jié)果
測(cè)試菌是大腸桿菌-pXZpH2酶活力(U/ml)＝K×OD438×300×12/250×48×M1U酶活定義為每小時(shí)產(chǎn)生1um相應(yīng)產(chǎn)物所需酶量。
實(shí)施例9雙酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-pHPG)取按實(shí)施例8，改用28℃誘導(dǎo)得到的的0.5克帶有pXZpC2的大腸桿菌的濕菌體細(xì)胞，用0.035％的0.1M pH8.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)分別進(jìn)行1、2、3、5小時(shí)后，測(cè)定體系中有0.45mg、0.81mg、1.18mg、1.26mg的D-對(duì)羥基苯甘氨酸生成。5小時(shí)后轉(zhuǎn)化率為90.8％。
取按實(shí)施例8，改用28℃誘導(dǎo)得到的0.4克帶有pXZpH2的大腸桿菌的濕菌體細(xì)胞，用0.45％的0.1M pH8.0的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)分別進(jìn)行1、2、3、5小時(shí)后，測(cè)定體系中有14.64mg、20.89mg、23.23mg、23.75mg的N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸生成。5小時(shí)后轉(zhuǎn)化率達(dá)96.7％。
所以當(dāng)采用雙酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸時(shí)，5小時(shí)后轉(zhuǎn)化率達(dá)87.5％。
修改在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱新的乙內(nèi)酰脲水解酶及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)目4(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度3439bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1tctcggggtc cgtcaccacg atgaccgaac acggtctgca tgttggagga tgtcgcagcc 60gactgacccg ccgccatcag catttccagc gtgcctgggg ggagaggttc ccccgtgtag 120cgtctgacgg aacggtgctt cagcatcagc gcgatgcagt ccgacaccag ccgttcgccc 180gatggtatct gattgaatgt cggtgcgccg taacgcctgt cgaaggcgct tgcaacgctt 240gtcgccgtca ggcgcgacga cacttgtcga agtgtgtatt gtcatcatcg ttctcgtaga 300atgccggttt actgcttgta tttgcgacgt ttcaggaatt tcccgtccgt cggttcgccg 360acataggaac cttcgtcgac gataaccttg ccacgcagga gcaccgtctt cggcacgccc 420ttgaccttgt gtccctcgta ggaggagtaa tccatggcgt tgtgcatggc ggtctgttcg 480atcaccattt cggcctcggg gtcccaaagg acgatgtcgg cgtccgaacc gaccgcgatc 540gtcccctttt gcggaaacat tccgaagacc ttggccgggc gcgtggcgac cagttccacg 600aactgggtaa gggaaatccg gccttcgttg acgccctgat agaccatcat caaccgttcc 660tcgacgcccg gcgcgccgtt cgggatggcg cgaaagtcgt tccggccccg gtccttgtgc 720cccttgaaga gccaggagca atggtcggag gaaaccgttt cgaacacacc gtttctgagt 780gcgttccaga gaacgtcatg gtctttcttc gcgcgggccg gcggtgtgaa aacgtatttc 840gcaccttcga aatccggccg ctccaggtct tccttggtga ggtaaaggta atgcgtgcag 900gtttccgcca gagcgcggac gcctcgcgat tttgcgcgca tcacctcctc aagggactcc 960tcgcaggtca catggactat gtagatcggg gcgttgacga tttcggccag ggcgagggcc1020cgcgcggttg cctcggcttc gacccggggc gggcggctga gcgcgtggta gatcggcgcg1080gttttgccct cggccacgaa cttgtcgcgc agatagtcgg cggcgtcgcc gttttccgcg1140tgcaccatga cgagcgatcc ggtcttgacc gccttgtcga gcgtcttcag cagcgtcacg1200tcgtcgatca tgttcatgcc gcgataggcc atgaagacct tgaaggaggt aatgccaaga1260tcgggaagca cctccagctc ctcaatcacg ctgtcggtcg ggtcgagcac gatgatgtgg1320tagccgtaat cgatcgccga cttgccgccg gccataccgt cccacttggc gacggcttcc1380gccaggctgt ggccgcgatc ctgctgacag aaatcgacga tggttgtcgt tccgccacag1440gcggccgcga ccgtcgctgt tgcgaacgtg tcggccgact gcgtgttgaa gctgaccgtt1500tcgacatgcg tgtgaacgtc tatgccgccc ggaaagacgt agcggccggc cgcgtcgatc1560gtccgctccg ctgggccgag cgcgccgccg atctgggtga tcttgccatc cttgatcccg1620agatcggcgc gagaaatgcc atccgcggtc acgatggttc cgtttttgat aatgatgtcc1680atgatgtcgc tctcaggatt gaagagtttg ttccgtatat ggaatgtaat tctttataca1740agtttgcatg gtgttttgaa gctgtcaagc ggaacggcgg cctagcgaag acgattctgt1800gcagagcgct ctcgttcgag gcggaacgag ttgaagtcga cggcgggctc gcgcgagagc1860ttgtcaagca gcgcaaattc cggttccgct ccggttgaca gatcaaaaat tttacgcctg1920ttattgtcgt gctgcatgta atatttcgta ctttatgtag aatttgcatt gcgccgcgag1980tcacaaagcc ggttttcggc gatgtgtttc acaacgtttt cccggccgct gggccggaca2040tcacctagga aggagcagag gttcatgaca cgtcagatga tacttgcagt gggacaacaa2100ggtccgatcg cgcgcgcgga gacacgcgaa caggtcgtcg ttcgtcttct ctacatgctg2160acgaaagccg cgagccgggg cgcgaatttc attgtcttcc ccgaactcgc gcttacgacc2220ttcttcccgc gctggcattt caccgacgag gccgagctcg atagcttcta tgagaccgaa2280atgcccggcc cggtggtccg tccactcttt gagaaggccg cggaactcgg gatcggcttc2340aatctgggct acgctgaact cgtcgtcgaa ggcggcgtca agcgtcgctt caacacgtcc2400attttggtgg ataagtcagg caagatcgtc ggcaagtatc gtaagatcca tttgccgggt2460cacaaggagt acgaggccta ccggccgttc cagcatcttg aaaagcgtta tttcgagccg2520ggcgatctcg gcttcccggt ctatgacgtc gacgccgcga aaatggggat gttcatctgc2580aacgatcgcc gctggcctga agcctggcgg gtgatgggcc tcaggggcgc cgagatcatc2640tgcggcggct acaacacgcc gacccacaat ccccctgttc cccagcacga ccacctgacg2700tccttccacc atctcctatc gatgcaggcc gggtcttatc agaacggggc ctggtccgcg2760gccgcgggca aggtgggcat ggaggagaac tgcatgctgc tcggccactc ctgcatcgtg2820gcgccgaccg gggaaatcgt cgctctcact acgacgctgg aagacgaggt gatcaccgcc2880gccgtcgatc tcgatcgctg ccgggaactg cgtgaacaca tcttcaactt caagcagcat2940cgtcagcccc agcactatgg tctgatcgcg gaactctgag gttgccgaaa agcatgtgtg3000tcgttgttct cggcgcctgg gtcacatcca ggcgcgccag ggtgacgctg gtggaatagt3060accacgaccg cttcagggcg atccgcaagg agatgcgggt cgccggagcg gcaaagcccg3120acattcgttt cgcaccgacg gccgtcgtga actcgacagt ccgcgagaag ggcgtattgc3180gcggcctgga cctgtacgtg gaactgtagc ccatatatag atttccaaag agtttcggcg3240aggcgcggcg cgcctagccc catgtgagcg agaaccgtgc ccagatcaaa gaatgagacc3300gacgcgccgg ccgcggcaaa ggatgatcct cagggtcgga tctatcgctc cgccctgaag3360caggagggcg cacgctggct gcttgacggc ggaggaaggg gttgctggca aagcccaagc3420cgcccggcct tgttccggc 3439(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度304個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO2MTRQMILAVG QQGPIARAET REQVVVRLLY MLTKAASRGA NFIVFPELAL 50TTFFPRWHFT DEAELDSFYE TEMPGPVVRP LFEKAAELGI GFNLGYAELV 100VEGGVKRRFN TSILVDKSGK IVGKYRKIHL PGHKEYEAYR PFQHLEKRYF 150EPGDLGFPVY DVDAAKMGMF ICNDRRWPEA WRVMGLRGAE IICGGYNTPT 200HNPPVPQHDH LTSFHHLLSM QAGSYQNGAW SAAAGKVGME ENCMLLGHSC 250IVAPTGEIVA LTTTLEDEVI TAAVDLDRCR ELREHIFNFK QHRQPQHYGL 300IAEL304(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度3439堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3gccggaacaa ggccgggcgg cttgggcttt gccagcaacc ccttcctccg ccgtcaagca60gccagcgtgc gccctcctgc ttcagggcgg agcgatagat ccgaccctga ggatcatcct 120ttgccgcggc cggcgcgtcg gtctcattct ttgatctggg cacggttctc gctcacatgg 180ggctaggcgc gccgcgcctc gccgaaactc tttggaaatc tatatatggg ctacagttcc 240acgtacaggt ccaggccgcg caatacgccc ttctcgcgga ctgtcgagtt cacgacggcc 300gtcggtgcga aacgaatgtc gggctttgcc gctccggcga cccgcatctc cttgcggatc 360gccctgaagc ggtcgtggta ctattccacc agcgtcaccc tggcgcgcct ggatgtgacc 420caggcgccga gaacaacgac acacatgctt ttcggcaacc tcagagttcc gcgatcagac 480catagtgctg gggctgacga tgctgcttga agttgaagat gtgttcacgc agttcccggc 540agcgatcgag atcgacggcg gcggtgatca cctcgtcttc cagcgtcgta gtgagagcga 600cgatttcccc ggtcggcgcc acgatgcagg agtggccgag cagcatgcag ttctcctcca 660tgcccacctt gcccgcggcc gcggaccagg ccccgttctg ataagacccg gcctgcatcg 720ataggagatg gtggaaggac gtcaggtggt cgtgctgggg aacaggggga ttgtgggtcg 780gcgtgttgta gccgccgcag atgatctcgg cgcccctgag gcccatcacc cgccaggctt 840caggccagcg gcgatcgttg cagatgaaca tccccatttt cgcggcgtcg acgtcataga 900ccgggaagcc gagatcgccc ggctcgaaat aacgcttttc aagatgctgg aacggccggt 960aggcctcgta ctccttgtga cccggcaaat ggatcttacg atacttgccg acgatcttgc 1020ctgacttatc caccaaaatg gacgtgttga agcgacgctt gacgccgcct tcgacgacga 1080gttcagcgta gcccagattg aagccgatcc cgagttccgc ggccttctca aagagtggac 1140ggaccaccgg gccgggcatt tcggtctcat agaagctatc gagctcggcc tcgtcggtga 1200aatgccagcg cgggaagaag gtcgtaagcg cgagttcggg gaagacaatg aaattcgcgc 1260cccggctcgc ggctttcgtc agcatgtaga gaagacgaac gacgacctgt tcgcgtgtct 1320ccgcgcgcgc gatcggacct tgttgtccca ctgcaagtat catctgacgt gtcatgaacc 1380tctgctcctt cctaggtgat gtccggccca gcggccggga aaacgttgtg aaacacatcg 1440ccgaaaaccg gctttgtgac tcgcggcgca atgcaaattc tacataaagt acgaaatatt 1500acatgcagca cgacaataac aggcgtaaaa tttttgatct gtcaaccgga gcggaaccgg 1560aatttgcgct gcttgacaag ctctcgcgcg agcccgccgt cgacttcaac tcgttccgcc 1620tcgaacgaga gcgctctgca cagaatcgtc ttcgctaggc cgccgttccg cttgacagct 1680tcaaaacacc atgcaaactt gtataaagaa ttacattcca tatacggaac aaactcttca 1740atcctgagag cgacatcatg gacatcatta tcaaaaacgg aaccatcgtg accgcggatg 1800gcatttctcg cgccgatctc gggatcaagg atggcaagat cacccagatc ggcggcgcgc 1860tcggcccagc ggagcggacg atcgacgcgg ccggccgcta cgtctttccg ggcggcatag 1920acgttcacac gcatgtcgaa acggtcagct tcaacacgca gtcggccgac acgttcgcaa 1980cagcgacggt cgcggccgcc tgtggcggaa cgacaaccat cgtcgatttc tgtcagcagg 2040atcgcggcca cagcctggcg gaagccgtcg ccaagtggga cggtatggcc ggcggcaagt 2100cggcgatcga ttacggctac cacatcatcg tgctcgaccc gaccgacagc gtgattgagg 2160agctggaggt gcttcccgat cttggcatta cctccttcaa ggtcttcatg gcctatcgcg 2220gcatgaacat gatcgacgac gtgacgctgc tgaagacgct cgacaaggcg gtcaagaccg 2280gatcgctcgt catggtgcac gcggaaaacg gcgacgccgc cgactatctg cgcgacaagt 2340tcgtggccga gggcaaaacc gcgccgatct accacgcgct cagccgcccg ccccgggtcg 2400aagccgaggc aaccgcgcgg gccctcgccc tggccgaaat cgtcaacgcc ccgatctaca 2460tagtccatgt gacctgcgag gagtcccttg aggaggtgat gcgcgcaaaa tcgcgaggcg 2520tccgcgctct ggcggaaacc tgcacgcatt acctttacct caccaaggaa gacctggagc 2580ggccggattt cgaaggtgcg aaatacgttt tcacaccgcc ggcccgcgcg aagaaagacc 2640atgacgttct ctggaacgca ctcagaaacg gtgtgttcga aacggtttcc tccgaccatt 2700gctcctggct cttcaagggg cacaaggacc ggggccggaa cgactttcgc gccatcccga 2760acggcgcgcc gggcgtcgag gaacggttga tgatggtcta tcagggcgtc aacgaaggcc 2820ggatttccct tacccagttc gtggaactgg tcgccacgcg cccggccaag gtcttcggaa 2880tgtttccgca aaaggggacg atcgcggtcg gttcggacgc cgacatcgtc ctttgggacc 2940ccgaggccga aatggtgatc gaacagaccg ccatgcacaa cgccatggat tactcctcct 3000acgagggaca caaggtcaag ggcgtgccga agacggtgct cctgcgtggc aaggttatcg 3060tcgacgaagg ttcctatgtc ggcgaaccga cggacgggaa attcctgaaa cgtcgcaaat 3120acaagcagta aaccggcatt ctacgagaac gatgatgaca atacacactt cgacaagtgt 3180cgtcgcgcct gacggcgaca agcgttgcaa gcgccttcga caggcgttac ggcgcaccga 3240cattcaatca gataccatcg ggcgaacggc tggtgtcgga ctgcatcgcg ctgatgctga 3300agcaccgttc cgtcagacgc tacacggggg aacctctccc cccaggcacg ctggaaatgc 3360tgatggcggc gggtcagtcg gctgcgacat cctccaacat gcagaccgtg ttcggtcatc 3420gtggtgacgg accccgaga 3439(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度457個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO4MDIIIKNGTI VTADGISRAD LGIKDGKITQ IGGALGPAER TIDAAGRYVF 50PGGIDVHTHV ETVSFNTQSA DTFATATVAA ACGGTTTIVD FCQQDRGHSL 100AEAVAKWDGM AGGKSAIDYG YHIIVLDPTD SVIEELEVLP DLGITSFKVF 150MAYRGMNMID DVTLLKTLDK AVKTGSLVMV HAENGDAADY LRDKFVAEGK 200TAPIYHALSR PPRVEAEATA RALALAEIVN APIYIVHVTC EESLEEVMRA 250KSRGVRALAE TCTHYLYLTK EDLERPDFEG AKYVFTPPAR AKKDHDVLWN 300ALRNGVFETV SSDHCSWLFK GHKDRGRNDF RAIPNGAPGV EERLMMVYQG 350VNEGRISLTQ FVELVATRPA KVFGMFPQKG TIAVGSDADI VLWDPEAEMV 400IEQTAMHNAM DYSSYEGHKV KGVPKTVLLR GKVIVDEGSY VGEPTDGKFL 450KRRKYKQ 45權(quán)利要求
1.一種分離的海因酶，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的海因酶，其特征在于，該酶具有SEQ ID NO4氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(a)編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多核苷酸；(b)具有SEQ ID NO3中1758-3128位的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-3439位的核苷酸序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
7.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌BL21(DE3)-pXZpH2，保藏號(hào)為CGMCC No.0520.1。
8.一種海因酶的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)海因酶的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出海因酶。
9.如權(quán)利要求1所述的海因酶或權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞的用途，其特征在于，用于生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，該生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的工藝還包括使用具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨甲酰水解酶或表達(dá)該氨甲酰水解酶的重組工程菌，將N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的海因酶、編碼該海因酶的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種海因酶的方法。本發(fā)明還公開了含該海因酶的載體和宿主細(xì)胞,及其在生產(chǎn)藥物中間體D－對(duì)羥基苯甘氨酸(D－pHPG)方面的用途。本發(fā)明還公開了可用于生產(chǎn)D－pHPG的氨甲酰水解酶及工程菌。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1369559SQ0110534
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月15日
發(fā)明者楊蘊(yùn)劉, 許禎, 白驊, 姜衛(wèi)紅, 陶正利, 陳軍, 焦瑞身 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海植物生理研究所