植物生長素極性運(yùn)輸?shù)拇龠M(jìn)劑及其應(yīng)用
【專利摘要】植物生長素極性運(yùn)輸?shù)拇龠M(jìn)劑，其含有兩種黃酮類化合物黃芩素(scutellarin)或野黃芩素(scutellarein)。它們具有促進(jìn)植物生長素極性運(yùn)輸(PAT)并拮抗PAT抑制劑TIBA對根伸長的抑制作用。并黃芩素和野黃芩素在制備PAT促進(jìn)劑、野黃芩素在制備根伸長促進(jìn)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)黃芩素和野黃芩素是對PAT具有促進(jìn)作用的次生代謝產(chǎn)物，是植物源的PAT促進(jìn)劑，是在植物領(lǐng)域的首次應(yīng)用，開拓了植物次生代謝產(chǎn)物在植物生理上發(fā)揮效應(yīng)的新前景，實(shí)現(xiàn)黃芩素和野黃芩素更廣泛的價(jià)值實(shí)現(xiàn)。
【專利說明】
植物生長素極性運(yùn)輸?shù)拇龠M(jìn)劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001 ]本發(fā)明屬于植物生長激素領(lǐng)域，具體地，涉及兩種促進(jìn)植物生長素極性運(yùn)輸并緩 解抑制劑對植物生長素極性運(yùn)輸抑制作用的類黃酮黃芩素和野黃芩素，及其在制備植物生 長素極性運(yùn)輸促進(jìn)劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 植物根發(fā)育過程中激素調(diào)控發(fā)揮了非常重要的作用(Petricka et al. 2012)，尤 其生長素極性運(yùn)輸(polar auxin transport,PAT)對植物根形態(tài)建成十分關(guān)鍵。生長素是 調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)外界環(huán)境的重要激素，包括生根、開花、分蘗、應(yīng)對低溫、應(yīng)對鹽堿 等，而PAT則是生長素響應(yīng)內(nèi)源和外源信號并形成極性分布所依賴的重要途徑(Vanneste and Friml 2009)，已有研究證實(shí)PAT對植物根形態(tài)建成至關(guān)重要（Ubeda-Tomas et al. 2012)。近年來研究和應(yīng)用植物次生代謝產(chǎn)物對植物自身的效應(yīng)已經(jīng)吸引了越來越多的 科研工作者關(guān)注，因?yàn)檗r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中如果能使用植物源的生長調(diào)節(jié)劑，將更易被生態(tài)系統(tǒng)接 納，施用后易降解不會造成殘留，能一定程度上改善農(nóng)產(chǎn)品安全問題。其中最重要的發(fā)現(xiàn)就 是獨(dú)腳金內(nèi)酯作為一種新型植物激素對植物分枝的影響(Gomez-Roldan et al. 2008)，進(jìn) 而開拓了其在水稻、小麥等禾本科作物株型發(fā)育中的應(yīng)用。而獨(dú)腳金內(nèi)酯正是通過調(diào)控PAT 發(fā)揮其作用的（Domagalska and Leyser 2011)，因而篩選PAT調(diào)控劑將在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有 廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見有黃芩素以及黃芩素的苷元野黃芩素作為PAT調(diào)控劑的報(bào) 道，也沒有其具有拮抗PAT抑制劑TIBA對PAT抑制效應(yīng)的作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供兩種具有植物生長素極性運(yùn)輸促進(jìn)作用的類黃酮黃芩素 和野黃芩素，以及提供黃芩素或野黃芩素在制備PAT促進(jìn)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的 是提供兩種類黃酮黃芩素和野黃芩素，具有拮抗PAT抑制劑TIBA對PAT抑制效應(yīng)的作用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0006]植物生長素極性運(yùn)輸?shù)拇龠M(jìn)劑，其含有黃芩素或野黃芩素。
[0007] 根據(jù)所述的促進(jìn)劑，其以黃芩素或野黃芩素為唯一活性成分。
[0008] 根據(jù)所述的促進(jìn)劑，其中所述的促進(jìn)劑中黃芩素或野黃芩素的濃度為100μΜ。
[0009] 根據(jù)所述的促進(jìn)劑，其中所述的黃芩素或野黃芩素促進(jìn)生長素極性運(yùn)輸?shù)鞍譖INl 和ΡΙΝ2表達(dá)。
[0010] 根據(jù)所述的促進(jìn)劑，其中所述的黃芩素或野黃芩素促進(jìn)生長素響應(yīng)啟動子DR5在 根尖表達(dá)，增強(qiáng)生長素在根尖部積累。
[0011] 根據(jù)所述的促進(jìn)劑，其中所述的黃芩素或野黃芩素拮抗PAT抑制劑三碘苯甲酸對 根伸長的抑制。
[0012] 黃芩素和野黃芩素在制備生長素極性運(yùn)輸促進(jìn)劑中的應(yīng)用，所述的促進(jìn)劑以黃芩 素或野黃芩素為活性成分。
[0013] 黃芩素和野黃芩素在制備生長素極性運(yùn)輸促進(jìn)劑中的應(yīng)用，所述的促進(jìn)劑以黃芩 素或野黃芩素為唯一活性成分，濃度分別為?〇〇μΜ。
[0014] 野黃芩素在制備根伸長促進(jìn)劑中的應(yīng)用，其中野黃芩素有根伸長促進(jìn)效應(yīng)。
[0015] 野黃芩素在制備根伸長促進(jìn)劑中的應(yīng)用，其中野黃芩的濃度為50μΜ時(shí)促進(jìn)根伸 長。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下的優(yōu)益性：
[0017] 黃芩素又名燈盞乙素，是短葶飛蓬中的主要活性成分，野黃芩素是其苷元。在本申 請人前期已授權(quán)的發(fā)明專利"促進(jìn)植物根伸長的類激素及其應(yīng)用（ZL201210012269.2)"中 說明黃芩素具有顯著的根伸長促進(jìn)效應(yīng)，而且能拮抗2,4-D和茉莉酸甲酯兩種激素高濃度 時(shí)對根伸長的抑制作用。黃芩素能顯著促進(jìn)根伸長，而且能拮抗其他激素對根伸長的抑制， 本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)黃芩素的苷元野黃芩素也具有和黃芩素相似的根伸長促進(jìn)效應(yīng)。
[0018] 關(guān)于PAT已有的研究已經(jīng)證實(shí)多種天然黃酮類物質(zhì)如柚皮素、山奈酚等都能調(diào)控 PAT(Jacobs and Rubery 1988)，所以極有可能黃芩素和野黃芩素也是通過調(diào)控PAT發(fā)揮其 根伸長促進(jìn)效應(yīng)?；谏鲜龌A(chǔ)，加之篩選PAT調(diào)控劑無論對植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)研究還是 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)精準(zhǔn)調(diào)控的應(yīng)用都具有重要意義，所以探索黃芩素和野黃芩素對PAT的調(diào)控作用 是一項(xiàng)富有創(chuàng)新性和發(fā)展前景的工作。
[0019] 本發(fā)明中兩種植物次生代謝產(chǎn)物黃芩素和野黃芩素的新功效，即促進(jìn)PAT，是首次 發(fā)現(xiàn)的具有對PAT具有促進(jìn)作用的次生代謝產(chǎn)物，因而是次生代謝產(chǎn)物調(diào)控PAT研究和應(yīng)用 領(lǐng)域的一次重大突破。并且黃芩素和野黃芩素能拮抗抑制劑TIBA對PAT的抑制作用，說明對 PAT的調(diào)控可通過黃芩素或野黃芩素與TIBA結(jié)合使用實(shí)現(xiàn)不同預(yù)期效果的最適調(diào)控。本發(fā) 明對黃芩素和野黃芩素促進(jìn)PAT效應(yīng)的揭示，首次提供了植物源的PAT促進(jìn)劑，不僅為調(diào)控 植物生長發(fā)育提供了新的選擇，而且為黃芩素和野黃芩素的應(yīng)用開拓了一片全新的前景， 促進(jìn)了植物次生代謝產(chǎn)物在植物生理方面發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，具有重大意義。
【附圖說明】：
[0020] 圖Ia 100μΜ黃芩素或野黃芩素促進(jìn)生長素極性運(yùn)輸?shù)鞍譖INl表達(dá)(ΡΙΝΙ偶聯(lián)報(bào)告 基因 GFP，所以綠色熒光蛋白增強(qiáng)指示PINl表達(dá)增強(qiáng)）；
[0021] 圖Ib 100μΜ黃芩素或野黃芩素促進(jìn)生長素極性運(yùn)輸?shù)鞍爪宝│?表達(dá)(ΡΙΝ2偶聯(lián)報(bào)告 基因 GFP，所以綠色熒光蛋白增強(qiáng)指示ΡΙΝ2表達(dá)增強(qiáng)）；
[0022]圖2 100μΜ黃芩素或野黃芩素增強(qiáng)生長素響應(yīng)啟動子DR5在根尖響應(yīng)(DR5啟動子 偶聯(lián)報(bào)告基因⑶S，所以⑶S染藍(lán)色增強(qiáng)指示DR5響應(yīng)增強(qiáng)，即生長素積累增加）；
[0023]圖3 100μΜ黃芩素或野黃芩素拮抗PAT抑制劑TIBA對根伸長的抑制(TIBA抑制根伸 長，但培養(yǎng)基中分別加入黃芩素或野黃芩素 TIBA抑制根伸長的效應(yīng)顯著削弱）；
[0024]圖4 50μΜ野黃芩素促進(jìn)擬南芥根伸長且促進(jìn)效應(yīng)和50μΜ黃芩素類似。
【具體實(shí)施方式】：
[0025]下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例子來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不 以此來限制本發(fā)明。
[0026]下述實(shí)施例中的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材 料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化分子試劑公司購買得到的。
[0027] 實(shí)施例1:
[0028]黃芩素的制備：
[0029]名稱:黃芩素/燈盞乙素/4-羥基黃芩素-7-0-葡萄糖醛酸苷 [0030] (scutellarin/Scutellarein 4'-methyl ether 7-glucuronide)
[0031 ]分子式：C2lHl8〇12
[0032] 結(jié)構(gòu)式：
[0033]
[0034] 制備：短亭飛蓬（Erigeron breviscapus(vant)Hand Mass)藥材粉碎-70%乙醇 滲漉-濃縮提取液-濃縮液過大孔樹脂-50 %乙醇洗脫-濃縮洗脫液-濃縮液用鹽酸調(diào) PH值至1-2-靜置24小時(shí)結(jié)晶-濾晶-甲醇回流重結(jié)晶（多次)-得燈盞乙素純品。（Ikg短 亭飛蓬藥材制得燈盞乙素純品3g)
[0035] 野黃芩素的制備：
[0036]名稱:野黃芩素/4'，5,6,7_四羥基黃酮
[0037] (scuteIIare in/4',5,6,7-Tetrahydroxyflavone)
[0038] 分子式:Ci5Hio〇6
[0039] 結(jié)構(gòu)式：
[0040]
[0041 ] 制備：稱取黃苳素50mg于圓底燒瓶中4加入IOOmL含80%乙醇（v/v)、20%濃硫酸 (m/v)溶液-氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱攪拌反應(yīng)3.5小時(shí)-反應(yīng)液傾入200mL去離子水，析出淺黃色 沉淀-靜置1小時(shí)后濾取沉淀，去離子水洗至中性-真空干燥24小時(shí)，得野黃芩素粗品 28. lmg-粗品溶于少量乙醇中，與50mg硅膠混勻，揮去溶劑，上硅膠柱-石油醚/乙酸乙酯/ 乙酸溶劑體系（5/3/0.4,體積比）快速淋洗-合并相同組分，減壓蒸干-乙醇一水重結(jié)晶- 得野黃芩素純品27.8mg。
[0042] 實(shí)施例2:
[0043] 黃芩素和野黃芩素促進(jìn)生長素極性運(yùn)輸?shù)鞍譖INl和PIN2的表達(dá)：
[0044] PINl和ΡΙΝ2是負(fù)責(zé)生長素極性運(yùn)輸?shù)牡鞍准易鍍蓚€(gè)主要成員，PINl=GFP和ΡΙΝ2: GFP是以模式植物擬南芥野生型(Arabidopsis thalianaecotype Columbia，Col)為背景分 別轉(zhuǎn)基因 PINl融合報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP和PIN2融合報(bào)告基因 GFP的突變株。以PINl: GFP和PIN2:GFP突變株為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用濾紙培養(yǎng)的方法培養(yǎng)和處理。將黃芩素和野黃芩素 粉末分別溶解于DMSO至終濃度為O.lmol/L，然后用去離子水稀釋得到100μΜ黃芩素和野黃 芩素工作液，對照溶液則按同樣比例用去離子水稀釋DMSO。將100μΜ黃芩素和野黃芩素以及 對照溶液分別加入9cm培養(yǎng)皿，每皿5mL，培養(yǎng)皿中鋪三層濾紙，將種子均勻播種在濾紙上， 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于4°C冰箱黑暗春化2天，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光周期14h day/10h night，日溫22°C，夜溫 19°C，光強(qiáng) 120μπιο1 · m-2 · s-1，濕度50%-60%。培養(yǎng)一周 后，從不同處理的培養(yǎng)皿中隨機(jī)取小苗于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察PINl和PIN2蛋白在 根部的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比對照100μΜ黃芩素和野黃芩素能顯著增強(qiáng)PINl :GFP和 PIN2: GFP突變株根尖部綠色熒光的強(qiáng)度，說明100μΜ黃芩素和野黃芩素促進(jìn)生長素極性運(yùn) 輸?shù)鞍譖INl和ΡΙΝ2蛋白表達(dá)(圖la，b)。
[0045] 實(shí)施例3:
[0046] 黃芩素和野黃芩素增強(qiáng)生長素在根尖部積累：
[0047] DR5是一個(gè)人工改造的包含生長素響應(yīng)元件的啟動子，在生長素存在時(shí)通過驅(qū)動 下游報(bào)告基因的表達(dá)可以反應(yīng)生長素在植物體內(nèi)的分布和積累，DR5::GUS是以擬南芥野生 型Col為背景轉(zhuǎn)基因 DR5融合報(bào)告基因⑶S的突變株。以DR5: :GUS突變株為材料，將100μΜ黃 芩素和野黃芩素以及對照溶液分別加入9cm培養(yǎng)皿，每皿5mL，培養(yǎng)皿中鋪三層濾紙，將種子 均勻播種在濾紙上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于4°C冰箱黑暗春化2天，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室培養(yǎng)。培 養(yǎng)條件為光周期14h day/10h night，日溫22°C，夜溫19°C，光強(qiáng)120μπιο1 ·ι?-2 · s-1，濕度 50%-60%。配制GUS染色液：取40mL IOOmM磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.0)依次加入0.01861g EDTA，0.01211195g六氰合鐵（II)酸鉀，0.016462g六氰合鐵（III)酸鉀，用I?S定容至50mL， 加入l%Triton-X100,避光保存。一周后，從不同處理的培養(yǎng)皿中隨機(jī)取小苗，浸沒于ImL含 lmg/mL X-gluc的GUS染色液中，37°C避光染色3-5h直至根部可見藍(lán)色。倒掉染色液，加入 95%乙醇漂洗3次使背景脫色。于顯微鏡下觀察根尖染色情況，并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比 對照100μΜ黃芩素和野黃芩素顯著增大DR5: :GUS突變株根尖部⑶S染藍(lán)色區(qū)域，說明100μΜ 黃芩素和野黃芩素增強(qiáng)生長素在根尖部積累（圖2)。
[0048] 實(shí)施例4:
[0049] 黃芩素和野黃芩素拮抗PAT抑制劑TIBA對根伸長的抑制：
[0050] 以擬南芥野生型Col為材料，以缺氮MS加1 %瓊脂為培養(yǎng)基，種子滅菌后于無菌條 件下均勻播種于培養(yǎng)基上，于4°C冰箱黑暗春化2天，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室豎直培養(yǎng)。培養(yǎng)條件 為光周期 14h day/10h night，日溫22°C，夜溫 19°C，光強(qiáng) 120μπιο1 ·ι?-2· s-1，濕度50%-60 %。以缺氮MS加 I %瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加 I %DMSO(對照）、20μΜ ΤΙΒΑ、20μΜ TIBA+ 100μΜ黃芩素、20μΜ ΤΙΒΑ+100μΜ野黃芩素制備轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。5天后將小苗于無菌條件下轉(zhuǎn)移 到各種處理培養(yǎng)基上以根尖為準(zhǔn)整齊排列小苗并標(biāo)記根尖位置，繼續(xù)豎直培養(yǎng)9天后，觀察 根伸長，并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20μΜ TIBA嚴(yán)重抑制了根伸長，而同時(shí)加入20μΜ TIBA和100 μΜ黃芩素或野黃芩素后，雖然相比對照根伸長仍然受到輕微抑制，但其根伸長顯著快于單 獨(dú)加入20μΜ TIBA的處理，說明黃芩素和野黃芩素拮抗PAT抑制劑TIBA對根伸長的抑制（圖 3)〇
[0051 ] 實(shí)施例5:
[0052]野黃芩素促進(jìn)根伸長：
[0053]以擬南芥野生型Col為材料，應(yīng)用濾紙培養(yǎng)的方法培養(yǎng)和處理。將黃芩素和野黃芩 素粉末分別溶解于DMSO至終濃度為O.lmol/L，然后用去離子水稀釋得到50μΜ黃芩素和野黃 芩素工作液，對照溶液則按同樣比例用去離子水稀釋DMSO。將50μΜ黃芩素和野黃芩素以及 對照溶液分別加入9cm培養(yǎng)皿，每皿5mL，培養(yǎng)皿中鋪三層濾紙，將種子均勻播種在濾紙上， 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于4°C冰箱黑暗春化2天，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光周期14h day/10h night，日溫22°C，夜溫 19°C，光強(qiáng) 120μηιο1 · m_2 · s-1，濕度50%_60%。7天后，每 個(gè)處理隨機(jī)取小苗觀察根長，并各取10棵苗舒展根，排列整齊拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50μΜ野 黃芩素處理擬南芥根明顯增長，而且根增長的程度與50μΜ黃芩素處理相似，說明野黃芩素 和黃芩素一樣具有根伸長促進(jìn)效應(yīng)(圖4)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 植物生長素極性運(yùn)輸?shù)拇龠M(jìn)劑，其特征在于其含有黃芩素或野黃芩素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)劑，其特征在于其以黃芩素或野黃芩素為唯一活性成分。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的促進(jìn)劑，其特征在于所述的促進(jìn)劑中黃芩素或野黃芩素的 濃度為?〇〇μΜ。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的促進(jìn)劑，其特征在于所述的黃芩素或野黃芩素促進(jìn)生 長素極性運(yùn)輸?shù)鞍爪宝│┖挺宝│?表達(dá)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的促進(jìn)劑，其特征在于所述的黃芩素或野黃芩素促進(jìn)生 長素響應(yīng)啟動子DR5在根尖表達(dá)，增強(qiáng)生長素在根尖部積累。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的促進(jìn)劑，其特征在于所述的黃芩素或野黃芩素拮抗PAT 抑制劑三碘苯甲酸對根伸長的抑制。7. 黃芩素和野黃芩素在制備生長素極性運(yùn)輸促進(jìn)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述的促進(jìn) 劑以黃芩素或野黃芩素為活性成分。8. 黃芩素和野黃芩素在制備生長素極性運(yùn)輸促進(jìn)劑中的應(yīng)用，其特征在于所述的促進(jìn) 劑以黃芩素或野黃芩素為唯一活性成分，濃度分別為1〇〇μΜ。9. 野黃芩素在制備根伸長促進(jìn)劑中的應(yīng)用。10. 野黃芩素在制備根伸長促進(jìn)劑中的應(yīng)用，其特征在于野黃芩素的濃度為50μΜ。
【文檔編號】A01P21/00GK105981720SQ201610074225
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年2月3日
【發(fā)明人】李唯奇, 張旭東
【申請人】中國科學(xué)院昆明植物研究所