一種馬精液冷凍保存液及其配制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種馬精液冷凍保存液及其配制方法，屬于動(dòng)物精液冷凍保存技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 精液冷凍保存是馬人工輔助繁殖技術(shù)手段之一。1950年，Smith和Polge最早將甘 油作為抗凍劑應(yīng)用到馬精液冷凍保存。1957年，Barker和Gandi er最早利用馬附睪冷凍精液 進(jìn)行配種受孕。中國早在20世紀(jì)50年代末就開始進(jìn)行有關(guān)馬精液冷凍保存的研究，并取得 了較好的成績。20世紀(jì)80年代，隨著阿拉伯馬、夸特馬、美國花馬等品種登記組織允許使用 冷凍精液配種出生的幼駒登記，使得馬精液冷凍保存技術(shù)得到快速發(fā)展。馬精液冷凍可擴(kuò) 大種公馬配種范圍，減少馬生殖道疾病的傳播，保護(hù)優(yōu)良遺傳資源，能夠跨越種族間進(jìn)行交 配，對完善馬的精液冷凍和人工授精配套技術(shù)，對于馬業(yè)的發(fā)展、地方優(yōu)良馬品種保存、加 快馬品種改良等方面都具有重要的意義。
[0003] 冷凍保存液是精子的保護(hù)劑，對精液冷凍的效果有決定性的影響。目前，國內(nèi)馬精 液的冷凍技術(shù)還處于試驗(yàn)階段，主要原因在于：（1)馬精液冷凍過程中冷凍一解凍機(jī)理、精 子損傷機(jī)理、外部環(huán)境變化對精子的影響、精子內(nèi)部組成物質(zhì)的變化規(guī)律及分子機(jī)制等諸 多方面尚不完全清楚；（2)實(shí)際操作中的冷凍一解凍程序、稀釋液和解凍液的組成不一致， 配制成分、方法復(fù)雜，不便于生產(chǎn)中現(xiàn)場配制使用；（3)冷凍精液的活力也難以達(dá)到人工授 精要求。以上問題嚴(yán)重制約了馬冷凍精液在馬育種及商品化生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，研究一種 馬精液冷凍保存液，能夠有效提高馬精子凍存過程中的存活率和活力，便于冷凍一解凍程 序操作使用，顯得尤為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種馬精液冷凍保存液，能夠有 效提高馬精液在凍存過程中的存活率和精子活力，該馬精液冷凍保存液的制備方法簡單易 實(shí)現(xiàn)。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0006] 一種馬精液冷凍保存液，是由葡萄糖2. OOg~2.40g、乳糖3.40g~4. OOg、海藻糖 0 · 60g~1 · 00g、谷胱甘肽0 · 061~0 · 092g、檸檬酸鈉0 · 50g~0 · 70g、脫脂奶30mL~50mL、卵黃 液2.5~4.5mL、青霉素5萬~10萬IU、鏈霉素5萬~10萬IU、甘油3.5~5.5mL和雙蒸水配制成 1 OOmL馬精液冷凍保存液。
[0007] 進(jìn)一步地，前述馬精液冷凍保存液，是由葡萄糖2.20g、乳糖3.70g、海藻糖0.80g、 谷胱甘肽〇.〇77g、檸檬酸鈉0.60g、脫脂奶40mL、卵黃液3.5mL、青霉素10萬IU、鏈霉素10萬 IU、甘油4.5mL和雙蒸水配制成IOOmL馬精液冷凍保存液。
[0008] -種馬精液冷凍保存液的配制方法，包括以下步驟：（1)配制脫脂奶；（2)配制基礎(chǔ) 液I; (3)配制冷凍保存液。
[0009] 前述馬精液冷凍保存液的配制方法，具體包括以下步驟：
[0010] (1)配制脫脂奶:取新鮮馬奶過濾后，100°c水浴滅菌IOmin，緩慢降溫至室溫后，置 于4°C冷藏（能夠充分冷卻，使脂質(zhì)漂浮于上層即可），隨后離心去除上層脂質(zhì)和下層沉淀， 得到脫脂奶，其保存時(shí)間一般不超過三天；
[0011] (2)配制基礎(chǔ)液I:按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、檸檬酸鈉、脫脂奶、卵黃 液、青霉素和鏈霉素，先將葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和檸檬酸鈉放入無菌容器中，加 入雙蒸水溶解，，定容至IOOmU隨后加入脫脂奶、卵黃液、青霉素和鏈霉素，室溫?cái)嚢杓吹没?礎(chǔ)液I;
[0012] (3)配制冷凍保存液:取基礎(chǔ)液I 96 · 5mL~94 · 5mL和甘油3 · 5~5 · 5mL，在基礎(chǔ)液I 中加入甘油攪拌20min~40min，即得冷凍保存液。
[0013]前述馬精液冷凍保存液的配制方法，步驟（1)中，離心為：以2000~3000r/min轉(zhuǎn)速 離心20~30min。
[0014] 前述馬精液冷凍保存液的配制方法，具體包括以下步驟：
[0015] (1)配制脫脂奶:取脫脂奶粉加入雙蒸水中，攪拌，配制成濃度為O.lg/mL溶液，得 到脫脂奶；
[0016] (2)配制基礎(chǔ)液I:按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、檸檬酸鈉、脫脂奶、卵黃 液、青霉素和鏈霉素，先將葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和檸檬酸鈉放入無菌容器中，加 入雙蒸水溶解，定容至l〇〇mL，隨后加入脫脂奶、卵黃液、青霉素和鏈霉素，室溫?cái)嚢杓吹没?礎(chǔ)液I;
[0017] (3)配制冷凍保存液:取基礎(chǔ)液I 96.5mL~94.5mL和甘油3.5~5.5mL，在基礎(chǔ)液I 中加入甘油攪拌20min~40min，即得冷凍保存液。
[0018] 前述馬精液冷凍保存液的配制方法，步驟(2)中，卵黃液通過以下步驟獲取:取新 鮮雞蛋，去除蛋清后，將蛋黃轉(zhuǎn)移到濾紙片上滾動(dòng)以便除去剩余蛋清和白色的黏著在蛋黃 膜上的卵帶，接著把蛋黃膜刺透，卵黃液收集到用冰冷卻的容器中。
[0019] 前述馬精液冷凍保存液的配制方法，步驟(2)中，室溫?cái)嚢?0min~45min得到基礎(chǔ) 液I。
[0020] 一種馬精液冷凍保存液在馬精液冷凍保存中的應(yīng)用。
[0021 ]前述馬精液冷凍保存液在馬精液冷凍保存中的應(yīng)用中，馬精液冷凍保存方法包括 以下步驟:取待保存的馬精液，加入基礎(chǔ)液I進(jìn)行稀釋，馬精液與基礎(chǔ)液I的體積比為1:1~ 2，其中，基礎(chǔ)液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、檸檬酸鈉、脫脂奶、卵黃液、青霉素、 鏈霉素和雙蒸水配制而成，隨后在室溫條件下，以600 Xg離心力離心8~12min，棄去上清 液，再用冷凍保存液稀釋至精子密度為5 X IO7~I X IO8個(gè)/mL，混合均勻后，裝入0.5mL細(xì)管 中，緩慢降溫至4°C平衡90~120min，可以使甘油滲入精子體內(nèi)，產(chǎn)生抗凍保護(hù)作用;再在距 離液氮面上4~6cm處熏蒸8~IOmin后(優(yōu)選距離液氮層面4cm高處），投入液氮中保存。本發(fā) 明中通過調(diào)整熏蒸高度和時(shí)間來控制細(xì)管精液的降溫速率，熏蒸距離過高或過低、時(shí)間過 長或過短，都會使精子受冷打擊，造成不可逆轉(zhuǎn)的精子死亡后果。
[0022]本發(fā)明中，精液采用假陰道法采精后，用4層滅菌紗布過濾附性腺等膠狀物，采精 后進(jìn)行常規(guī)檢查，最后取精子活力在0.60以上，密度"中"的精液用于冷凍保存。解凍過程 為:從液氮中取出精液細(xì)管，迅速浸入水浴解凍，輕輕搖動(dòng)至融化。解凍溫度為:37°C、30s。
[0023] 精子在冷凍過程中易發(fā)生氧化損傷，氧化損傷是活性氧族（Reactive Oxygen SpeCies，R0S)產(chǎn)生和清除活動(dòng)不平衡的結(jié)果:正常情況下，射出精液精漿(SP)中的抗氧化 物質(zhì)具有清除ROS的潛力，但精液在冷凍保存過程中，精液離心去除了精漿，使精子失去了 精漿抗氧化劑的保護(hù)作用，導(dǎo)致精子易受氧化攻擊;另外冷凍過程又能誘導(dǎo)精子產(chǎn)生R0S。 其中有缺陷精子和死精子是冷凍期間ROS的主要來源。ROS能通過氧化不飽和脂肪酸，破壞 質(zhì)膜脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)，引起精子細(xì)胞膜功能障礙及內(nèi)部結(jié)構(gòu)損傷。
[0024] 糖類是精液冷凍保存液的基本組成部分，既可以為精子代謝提供能量，又是重要 的冷凍保護(hù)劑。海藻糖，是由兩個(gè)葡萄糖分子構(gòu)成的非還原性糖，性質(zhì)非常穩(wěn)定。海藻糖能 夠有效地遏制Ca 2+的流動(dòng)，減緩細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的瞬間變化，保護(hù)細(xì)胞膜不被破壞。它還可 以與精子膜上的氫結(jié)合，形成一種保護(hù)層，在精子膜破裂的情況下能有效地阻止精子內(nèi)部 有效成分的外流。另外，海藻糖可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)和溶液之間水分的變化，在冷凍-解凍過程中 保護(hù)細(xì)胞免受損傷。海藻糖的保護(hù)機(jī)制與其晶體結(jié)構(gòu)、溶液的物理構(gòu)象和化學(xué)特性密切相 關(guān)。在精子冷凍時(shí)，海藻糖可以強(qiáng)有力的束縛水分子，與膜脂質(zhì)共同擁有結(jié)合水或者本身起 到代替膜結(jié)合水的功用，保持細(xì)胞內(nèi)濕潤，防止細(xì)胞因失水而造成養(yǎng)分的損失和細(xì)胞的損 傷，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性。
[0025] 甘油通透精子膜的能力很強(qiáng)，可濃縮或結(jié)合胞內(nèi)水分，降低溶液中鹽濃度和冷凍 液的滲透壓。但甘油對精子有一定的毒害作用。為達(dá)到保護(hù)作用同時(shí)將危害降為最低，本發(fā) 明的冷凍保存液配方中降低了甘油濃度。IOOmL冷凍保存液中含有甘油3.5~5.5mL時(shí)，經(jīng)過 冷凍一解凍過程后精子活力最高。
[0026] 海藻糖在哺乳動(dòng)物精子深低溫保存時(shí)，只有與甘油聯(lián)合使用才能有效保護(hù)精子。 因此，冷凍保存液中的海藻糖與甘油共同作用時(shí)，更適合于保護(hù)馬精子的細(xì)胞形態(tài)與細(xì)