一種縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈和水質(zhì)污染，很多生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的野生魚(yú)類(lèi)棲息地環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，資源量急劇下降，能達(dá)到性成熟的野生魚(yú)親本越來(lái)越少。
[0003]斑鑊(Mystus guttatus Lacdpdde)屬鲇形目，鰉科，鑊屬，是一種廣泛分布的大型肉食性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其肉質(zhì)鮮嫩，享有“淡水之王”的美譽(yù)，一般收購(gòu)價(jià)每千克70-130元。斑鑊第一次性成熟為6?8齡。
[0004]長(zhǎng)臀鮑(Cranoglanis bouderius(Richardson))屬鲇形目，長(zhǎng)臀鮑科，長(zhǎng)臀鮑屬，又稱(chēng)白骨魚(yú)、牛毛魚(yú)、盔鲇，屬中國(guó)特有魚(yú)類(lèi)，僅分布于珠江流域西江水系，屬易危魚(yú)類(lèi)，需3?4年達(dá)性成熟。
[0005]對(duì)于性成熟時(shí)間長(zhǎng)的魚(yú)類(lèi)，養(yǎng)殖的困難在于無(wú)法獲得數(shù)量足夠多的親本，魚(yú)苗量小。如上所述的斑鑊和長(zhǎng)臀鮑，雖然在廣東、廣西等地有人養(yǎng)殖，但人工繁殖技術(shù)和親本的限制，未能批量獲得人工繁殖的魚(yú)苗，各地養(yǎng)殖的苗種多數(shù)來(lái)源于從江河捕撈的野生苗，數(shù)量有限，養(yǎng)殖規(guī)模較小。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，性成熟時(shí)間一年以上的魚(yú)類(lèi)人工養(yǎng)殖效率低，生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法。能夠有效縮短目標(biāo)魚(yú)類(lèi)的性成熟周期，提高養(yǎng)殖效率，降低生產(chǎn)成本。
[0007]本發(fā)明提供的縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法，其是以待縮短性成熟周期的魚(yú)種為供體魚(yú)，將從供體魚(yú)分離獲得的精原干細(xì)胞注射入三倍體黃顙魚(yú)仔魚(yú)腹腔性腺，當(dāng)三倍體黃顙魚(yú)發(fā)育至性成熟后，雌性黃顙魚(yú)會(huì)產(chǎn)生供體魚(yú)卵子，雄性黃顙魚(yú)會(huì)產(chǎn)生供體魚(yú)精子，供體魚(yú)卵子與供體魚(yú)精子結(jié)合，孵化魚(yú)苗，即為供體魚(yú)子代;所述供體魚(yú)為斑鑊或長(zhǎng)臀鮑。
[0008]本發(fā)明利用三倍體誘導(dǎo)技術(shù)將精原細(xì)胞引入三倍體性腺發(fā)育環(huán)境來(lái)完成供體配子的發(fā)育成熟，縮短供體魚(yú)配子產(chǎn)生時(shí)間。
[0009]最后分化出來(lái)到底是精子還是卵子，跟受體魚(yú)有關(guān)系，如果受體魚(yú)是雌性三倍體，出來(lái)的就是卵子，如果受體魚(yú)是雄性三倍體，出來(lái)的就是精子。我們采用供體的是精原細(xì)胞，本身就有X和Y兩種染色體。受體是不育的，可是有性腺發(fā)育的環(huán)境，供體參與受體胚胎的生殖系形成，并可遺傳給后代。
[0010]簡(jiǎn)單的說(shuō)，精原干細(xì)胞移植到三倍體魚(yú)中，如果是雌性三倍體受體，就產(chǎn)生含供體X染色體的卵子，如果是雄性三倍體受體，就產(chǎn)生含供體X和Y的精子。
[0011 ]優(yōu)選地，上述縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法中，分離精原干細(xì)胞的方法為:將性成熟的供體魚(yú)精巢剪碎，用膠原蛋白酶和胰蛋白酶處理后除去雜質(zhì)，獲得的細(xì)胞懸液使用梯度濃度的percoll分離液通過(guò)密度梯度離心法進(jìn)行分離，分離產(chǎn)物中A型精原細(xì)胞數(shù)量占比達(dá)到95%以上即可；
[0012]percoll分離液為Percoll原液用0.85% (w/v)氯化鈉或1.5M PBS稀釋成的多個(gè)濃度梯度的溶液。
[0013]精原細(xì)胞可分為A、B兩型，A型是精原細(xì)胞的干細(xì)胞，經(jīng)有絲分裂增殖，部分A型精原細(xì)胞保留干細(xì)胞功能，即還未分化的精原細(xì)胞，B型是已經(jīng)分化的精原細(xì)胞。選擇A型精原細(xì)胞獲得兩種成熟配子的成功率更高。
[0014]優(yōu)選地，上述縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法中，所述三倍體黃顙魚(yú)仔魚(yú)為受精卵發(fā)育至第8?13天的仔魚(yú)。根據(jù)黃顙魚(yú)性腺分化的特點(diǎn)，黃顙魚(yú)一般在孵化13天開(kāi)始性腺分化，所以受體魚(yú)一定要在性腺分化以前移植成功率最高，選擇最早8天是由于仔魚(yú)個(gè)體稍大一點(diǎn)，移植時(shí)操作比較方便及成活率高。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0016]本發(fā)明利用黃顙魚(yú)一年即可性成熟的特點(diǎn)以及三倍體黃顙魚(yú)性腺微環(huán)境內(nèi)分泌體系適宜配子發(fā)育的特點(diǎn)，將其它魚(yú)類(lèi)的配子干細(xì)胞移植到三倍體黃顙魚(yú)性腺中促進(jìn)其發(fā)育成熟，一年即可獲得成熟的供體魚(yú)精子和卵子，大大縮短了供體魚(yú)性成熟周期，可以批量獲得供體魚(yú)魚(yú)苗，提高了養(yǎng)殖效率，同時(shí)降低了養(yǎng)殖成本。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是本發(fā)明縮短魚(yú)類(lèi)性成熟周期的方法技術(shù)路線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0019]實(shí)施例1縮短長(zhǎng)臀鮑性成熟周期
[0020]1.分離長(zhǎng)臀鮑精原干細(xì)胞
[0021]取II一m期長(zhǎng)臀鮑的精巢剪刀剪碎，用0.2%(w/v)膠原蛋白酶加5% (w/v)胰蛋白酶溶于PBS中，溶解分離I小時(shí)(28.5°C)，然后用60微米篩網(wǎng)過(guò)濾，除去大的雜質(zhì)，并用PBS洗滌，細(xì)胞團(tuán)塊最后懸浮于ImL PBS中，備用。
[0022]將2毫升待分離的細(xì)胞懸液小心鋪于梯度溶液頂部，然后800轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘。離心結(jié)束后，細(xì)胞按其自身的比重沉降在不同密度的界面上，呈白色細(xì)盤(pán)狀，用針頭仔細(xì)吸取上層細(xì)胞，然后移至圓錐形試管。PBS洗兩次，1000轉(zhuǎn)離心10分鐘，去上清收集底部細(xì)胞。收集到的細(xì)胞懸浮于30微升PBS中進(jìn)行檢查A型精原細(xì)胞達(dá)到95 %以上即可。
[0023]2.制備不育黃顙魚(yú)
[0024]采用靜水壓機(jī)或冷處理方法，誘導(dǎo)三倍體黃顙魚(yú)(不育)產(chǎn)生。
[0025]當(dāng)胚胎發(fā)育至原腸中期時(shí)，隨機(jī)取樣30?50顆發(fā)育正常的原腸胚進(jìn)行混合胚胎染色體制片，統(tǒng)計(jì)黃顙魚(yú)染色體數(shù)，二倍體2n = 52 ；三倍體3n = 78。
[0026]3.將精原干細(xì)胞顯微注射到不育黃顙魚(yú)仔魚(yú)腹腔
[0027]以三倍體黃顙魚(yú)為受體魚(yú)，在受精至發(fā)育13天期間注射長(zhǎng)臀鮑的精原干細(xì)胞，具體步驟如下:
[0028](I)受體魚(yú)麻醉:用MS-222或0.01%對(duì)氨基苯酸乙酯，苯佐卡因(ethylp-aminobenzoate)將受體實(shí)驗(yàn)魚(yú)輕微麻醉。
[0029](2)細(xì)胞上樣:將提取的A型精原細(xì)胞裝入30微升的玻璃針管中，操作過(guò)程中注意避免將玻璃針頭弄斷，樣品裝好后放在冰袋上，備用。
[0030](3)受體魚(yú)苗注射:采用顯微注射裝置，將細(xì)胞懸浮液注射到受體魚(yú)苗腹腔(氣鰾前端上方或氣鰾后上方)，注射前將細(xì)胞懸浮液預(yù)先加入等量臺(tái)盼藍(lán)染色，顯示玻璃針和腹腔移入物，操作過(guò)程中盡量避免對(duì)魚(yú)體損傷。
[0031](4)檢查供體魚(yú)A型精原細(xì)胞是否成功注射進(jìn)受體魚(yú):注射后4?