免疫細(xì)胞的凍存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及免疫細(xì)胞的凍存方法，尤其涉及免疫細(xì)胞 凍存及凍存后復(fù)蘇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì) 胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。免疫細(xì)胞可以分為多種，在人體中各種免疫細(xì)胞 擔(dān)任著重要的角色。免疫細(xì)胞包括吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞、B細(xì)胞是發(fā) 揮特異性免疫的主要細(xì)胞群。從血液中分離出來的單個核細(xì)胞包括：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì) 胞和DC細(xì)胞等，是免疫細(xì)胞治療中的初始細(xì)胞來源，經(jīng)各類細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到 一群具有高效殺傷活性的免疫細(xì)胞群。
[0003]目前免疫細(xì)胞的培養(yǎng)主要應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞免疫治療。腫瘤細(xì)胞免疫治療是采集 人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增多，靶向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回 輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng) 機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。腫瘤自體細(xì)胞免疫療法適用于多種實(shí)體腫 瘤，包括惡性黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、 肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等實(shí)體瘤手術(shù)后防止復(fù)發(fā)，也可以用于多發(fā)性骨髓 瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的復(fù)發(fā)，對于大多數(shù)細(xì)胞免疫治療的適應(yīng)人群還 可以用于上述腫瘤的進(jìn)一步鞏固治療，達(dá)到延長生存期、提高生活質(zhì)量和抑制腫瘤惡化的 目的。
[0004] 常見的免疫細(xì)胞治療種類包括NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞、DC-CIK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、LAK細(xì) 胞、CART細(xì)胞等。所有這些經(jīng)誘導(dǎo)和擴(kuò)增培養(yǎng)的免疫細(xì)胞，他的初始細(xì)胞來源都是外周血 或臍血的單個核細(xì)胞，而且是直接分離培養(yǎng)。隨著年齡的增長，免疫細(xì)胞在體內(nèi)的活性也會 隨之降低，所以在年輕時期凍存具有較高活性的免疫細(xì)胞，對于未來罹患腫瘤相關(guān)疾病的 治療可以起到很好的保障。因此免疫細(xì)胞凍存及凍存后的復(fù)蘇培養(yǎng)具有非常大的意義。
[0005] 目前，細(xì)胞凍存主要是采取_196°C超低溫條件下的保存方案，在超低溫條件下，細(xì) 胞的代謝功能停滯，但并未死亡。而細(xì)胞復(fù)蘇則主要采用凍存細(xì)胞在37°C快速解凍的方法， 以恢復(fù)細(xì)胞的活性和功能。但是現(xiàn)有的免疫細(xì)胞凍存方法凍存過程中易形成冰晶損傷細(xì) 胞，復(fù)蘇后細(xì)胞活率低、細(xì)胞增殖數(shù)量不足、細(xì)胞易老化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種免疫細(xì)胞的凍存 方法。采用本發(fā)明所述免疫細(xì)胞的凍存方法凍存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活率高、細(xì)胞增殖 數(shù)量大、細(xì)胞不易老化。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種免疫細(xì)胞的凍存方法，X-VIV015無血清培養(yǎng)基重懸單個核細(xì)胞，緩慢加入同 體積的凍存液，制成細(xì)胞凍存懸液，降溫至-80°C后，-196°C超低溫凍存。
[0009] 其中，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞的凍存方法中所述凍存液由 DMS0、自體血漿和X-VIV015培養(yǎng)基組成，DMS0:自體血漿：X-VIV015培養(yǎng)基的體積比為 1:2:2〇
[0010] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞的凍存方法中所述凍存液預(yù)先于 2-8 °C預(yù)冷，以降低DMS0溶于凍存液時升溫對細(xì)胞的損傷。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞的凍存方法中所述細(xì)胞凍存懸液中凍 存密度為凍存密度為4X106cell/mL-6X106cell/mL。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞的凍存方法中所述自體血漿預(yù)先經(jīng) 56°C滅活30min，0? 22ym濾膜過濾。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的免疫細(xì)胞的凍存方法中所述降溫速度為：
[0014] 溫度> -25°C時，1°C/min~2°C/min;
[0015] -25°C彡溫度 >_80°C時，5°C/min~7°C/min。
[0016] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述免疫細(xì)胞的凍存方法采用程序降溫儀進(jìn)行降 溫。
[0017] 按照本發(fā)明，所述免疫細(xì)胞的凍存方法中所述免疫細(xì)胞的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的任意一種免疫細(xì)胞即可，并無特殊的限制。本發(fā)明中所述免疫細(xì)胞優(yōu)選為NK細(xì)胞、 CIK細(xì)胞或DC細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明所述免疫細(xì)胞的凍存方法，X-VIV015無血清培養(yǎng)基重懸單個核細(xì)胞，緩慢 加入同體積的凍存液，制成細(xì)胞凍存懸液，降溫至-80°C后，_196°C超低溫凍存。實(shí)驗(yàn)表明， 采用本發(fā)明所述免疫細(xì)胞的凍存方法凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后在細(xì)胞活率、細(xì)胞增殖數(shù)量上明顯 優(yōu)于常規(guī)凍存方案凍存的細(xì)胞復(fù)蘇得到的細(xì)胞，而對K562細(xì)胞的殺傷能力與未凍存細(xì)胞 相當(dāng)，保持了細(xì)胞的殺傷活性。
【附圖說明】
[0019] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0020] 圖1示實(shí)施例6中初始分離的PBMC細(xì)胞中NKT細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶3⑶56表達(dá)情 況圖；
[0021] 圖2示實(shí)施例6中組2培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶3⑶56表達(dá)情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024] 實(shí)施例1 :單個核細(xì)胞的分離
[0025] 1?抽取外周血20mL，加到50mL離心管中，700g離心lOmin;
[0026] 2.吸取上層血漿8-9mL至15mL離心管備用，下層血液加2倍體積的生理鹽水稀 釋；
[0027] 3.取新的50mL離心管，加入15mL淋巴細(xì)胞分離液，緩慢加入稀釋后的血液，保證 分層清晰。
[0028] 4. 700g離心20_30min，離心升降速降為零。
[0029] 5.提取中間白膜層細(xì)胞，即得單個核細(xì)胞，加生理鹽水清洗兩遍，計數(shù)，細(xì)胞量為 2X107-3X107〇
[0030] 實(shí)施例2、本發(fā)明所述免疫細(xì)胞凍存方法
[0031] 1?自體血衆(zhòng)56°C滅活30min，0. 22ym濾膜過濾，備用。
[0032]2.按DMS0:自體血漿：X-VIV015培養(yǎng)基體積比為1:2:2的比例配制凍存液1，置于 2-8 °C冰箱預(yù)冷。
[0033] 3.用2-3mLX-VIV015無血清培養(yǎng)基重懸單個核細(xì)胞，緩慢加入同體積的凍 存液1，制成4-6mL細(xì)胞凍存懸液，分4-6管凍存，每管lmL，凍存密度為：4X106cel1/ mL_6X106cell/mL〇
[0034] 4.用程序降溫儀降溫至_80°C，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。
[0035]實(shí)施例3、常規(guī)凍存方法
[0036] 按DMS0:FBS:X-VIV015無血清培養(yǎng)基體積比為1:2:7的比例配制凍存液，凍存液 重懸單個核細(xì)胞后液氮凍存。
[0037] 實(shí)施例4、復(fù)蘇方法及復(fù)蘇后培養(yǎng)方法
[0038] 細(xì)胞凍存管在37°C兩分鐘內(nèi)解凍細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞后，直接加X-VIV015無血 清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，添加l〇〇-l〇〇〇U/mL的IL-2、100-1000U/mL的 0KT3、100-1000U/mL的 IL-15、100-1000U/mL的IL-21 進(jìn)行NKT細(xì)胞培養(yǎng)。
[0039] 實(shí)施例5:對比實(shí)驗(yàn)
[0040] 按照實(shí)施例1所述方法抽取40mL外周血，分離得到4X107-8X107個單個核細(xì)胞。 共6個管分成3組進(jìn)行凍存，每組兩管，每管lmL，細(xì)胞密度為5X106cell/mL。具體分組如 下：
[0041] 組1:采用實(shí)施例3所述凍存方案凍存，1個月后采用實(shí)施例4所述復(fù)蘇及培養(yǎng)方 法進(jìn)行培養(yǎng)；
[0042] 組2:采用實(shí)施例2所述凍存方案凍存，1個月后采用實(shí)施例4所述復(fù)蘇及培養(yǎng)方 法進(jìn)行培養(yǎng)；
[0043] 組3 :2管細(xì)胞不進(jìn)行凍存，直接按常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)；
[0044] 統(tǒng)計各組復(fù)蘇后的細(xì)胞量及活率結(jié)果如表1所示。各組復(fù)蘇培養(yǎng)后細(xì)胞增殖情況 如表2所示。
[0045]表1各組復(fù)蘇后的細(xì)胞量及活率
[0046]
[0047] 由表1結(jié)果可見，組2復(fù)蘇后細(xì)胞量高于組1，組2復(fù)蘇后細(xì)胞活率也高于組1，表 明采用本發(fā)明所述凍存方法復(fù)蘇后細(xì)胞量和活率高于常規(guī)凍存方法。
[0048] 表2各組NKT細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞增殖情況
[0049]
[0050] 由表2結(jié)果可見，組1在第4天細(xì)胞未增殖，第12天細(xì)胞部分死亡；而組2細(xì)胞增 殖明顯，和組3的未經(jīng)凍存直接培養(yǎng)得到的細(xì)胞量無統(tǒng)計學(xué)差異。表明采用本發(fā)明所述凍 存方法復(fù)蘇后細(xì)胞大量增殖，接近直接分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞量；
[0051] 以初始分離的PBMC細(xì)胞作為對照，對組2培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢 測，結(jié)果如圖1-2所示。
[0052] 圖1-2的結(jié)果顯示，NKT效應(yīng)細(xì)胞為⑶3+⑶56+的細(xì)胞群，初始分離的PBMC中， ⑶3+⑶56+細(xì)胞群只有2 %，組2細(xì)胞中⑶3+⑶56+細(xì)胞群為24. 9 %。表明本發(fā)明所述免疫 細(xì)胞的凍存方法經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后可以獲得更高純度的NKT效應(yīng)細(xì)胞。
[0053] 同時對組2和組3培養(yǎng)的細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)行檢測，結(jié)果如表3所示。
[0054] 表3組2、組3培養(yǎng)的NKT細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)
[0055]
[0056]由表3結(jié)果可見，組2、組3的細(xì)胞對K562的殺傷能力效果相當(dāng)。說明本專利的免 疫細(xì)胞凍存后復(fù)蘇培養(yǎng)方案保持了細(xì)胞的殺傷活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 免疫細(xì)胞的凍存方法，X-VIV015無血清培養(yǎng)基重懸單個核細(xì)胞，緩慢加入同體積的 凍存液，制成細(xì)胞凍存懸液，降溫至_80°C后，_196°C超低溫凍存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存方法，所述凍存液由DMSO、自體血漿和X-VIV015培養(yǎng)基 組成，DMSO :自體血漿：X-VIV015培養(yǎng)基的體積比為1:2:2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存方法，所述凍存液預(yù)先于2-8°C預(yù)冷。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存方法，所述細(xì)胞凍存懸液中凍存密度為凍存密度為 4X 106cell/mL-6 X 106cell/mL〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存方法，所述自體血衆(zhòng)預(yù)先經(jīng)56°C滅活30min，0. 22 y m濾 膜過濾。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存方法，所述降溫速度為： 溫度> _25°C時，1°C /min ~2°C /min ; -25°C 彡溫度 >_80°C時，5°C /min ~7°C /min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍存方法，所述免疫細(xì)胞為NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞或DC細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體公開了免疫細(xì)胞的凍存方法。本發(fā)明所述免疫細(xì)胞的凍存方法，X-VIVO15無血清培養(yǎng)基重懸單個核細(xì)胞，緩慢加入同體積的凍存液，制成細(xì)胞凍存懸液，降溫至-80℃后，-196℃超低溫凍存。實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明所述免疫細(xì)胞的凍存方法凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后在細(xì)胞活率、細(xì)胞增殖數(shù)量上明顯優(yōu)于常規(guī)凍存方案凍存的細(xì)胞復(fù)蘇得到的細(xì)胞，而對K562細(xì)胞的殺傷能力與未凍存細(xì)胞相當(dāng)，保持了細(xì)胞的殺傷活性。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN105076113
【申請?zhí)枴緾N201510515024
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 應(yīng)杰, 萬樺
【申請人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月20日