一種利迪鏈霉菌發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利迪鏈霉菌發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農(nóng)林業(yè)中每年因蟲害、病害和雜草危害造成的損失占總產(chǎn)值的37%，真菌病害占據(jù)各種病害之首，損失額高達(dá)1260億美元，相當(dāng)于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是國民經(jīng)濟(jì)中的重要組成部分，而農(nóng)作物的病蟲害又是影響農(nóng)業(yè)豐產(chǎn)的重要生物學(xué)因子，因此用于防治植物病蟲害的農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用。
[0003]化學(xué)農(nóng)藥在病蟲草害的防治上一直居于主導(dǎo)地位，但化學(xué)農(nóng)藥的使用越來越顯現(xiàn)出以下幾個方面的問題:高毒性，殺滅病原物的同時也殺傷害蟲天敵及其它有益生物；高殘留，化學(xué)農(nóng)藥對土壤、水體和大氣的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留增加；抗藥性，化學(xué)農(nóng)藥長期大量的使用致使病原物及害蟲改變代謝途徑產(chǎn)生抗藥性等。因此，生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用已成為全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢，其綠色、環(huán)保、節(jié)能等優(yōu)越特性比以往任何時期都更加受到世界各國的重視，成為生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0004]鏈霉菌是一種分布及其廣泛的革蘭氏陽性菌，呈類似于真菌的纖維狀，幾乎60%的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的生物活性物質(zhì)均來源于鏈霉菌。因此鏈霉菌被公認(rèn)為在農(nóng)業(yè)上極具應(yīng)用潛力的工業(yè)微生物。生物活性物質(zhì)是生物包括微生物、動植物在內(nèi)在其生命活動過程中所產(chǎn)生的(或由其它方法獲得的)能在低微濃度下有選擇性地抑制或影響其它生物機(jī)能的有機(jī)物質(zhì)，含量一般占發(fā)酵液的0.1%-5% (w/v)，有些更低，因此選用合理有效的分離純化技術(shù)，是成功獲取聞純度抗生素的關(guān)鍵。
[0005]目前已有許多學(xué)者在進(jìn)行抗真菌活性物質(zhì)分離純化的研究。2009年隋琴等人通過乙醇提取、吸附柱層析、娃膠柱層析、制備型HPLC從Streptomyces lydicus AO2的發(fā)酵液中分離純化出具有廣譜抗真菌活性的那他霉素；2011年穆凌霄等人通過酸沉淀、大孔樹脂SP825L吸附柱層析、娃膠柱層析、Sephadex LH 一 20凝膠柱層析從Streptomyces tz92的發(fā)酵液中分離純化出嘧肽霉素；2011年張楠等人通過大孔樹脂X-5吸附柱層析、硅膠柱層析、制備型HPLC從Streptomyces hygroscopicus BS-112的發(fā)酵液中分離純化出抗真菌的Tetramycins A和B。2010年梁雪琴等人通過殼聚糖絮凝處理、酸沉淀、大孔樹脂吸附層析、離子交換層析、制備型HPLC從Bacillu.sp N-23的發(fā)酵液中分離純化出一種核苷嘧啶類抗真菌抗生素。Streptomyces lydicus E12是從海南省的土壤中篩選出來的一株放線菌,其發(fā)酵液對植物病原真菌(立枯絲核和灰葡萄孢等)具有明顯的抑制作用，但對其抗真菌活性成分的分離純化研究較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種工藝簡單、成本低廉、操作簡便、產(chǎn)品純度高的利迪鏈霉菌發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的分離純化方法。
[0007]—種利迪鏈霉菌發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的分離純化方法，包括如下步驟:
[0008](I)將利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075的發(fā)酵液在4000-5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10_20min，收集上清液，按比例在IL上清液中加入4_8g絮凝劑，攪拌混勻后在0-4°C靜置10-12h，真空抽濾收集濾液；所述絮凝劑是由質(zhì)量比為0.6:1:I的亞鐵氰化鉀，硫酸鋅和硼砂組成；
[0009](2)濾液經(jīng)裝填有型號為Dia1n HP-20的大孔樹脂的層析柱進(jìn)行吸附層析，用1-2倍柱體積的體積濃度為40%-60%的甲醇水溶液沖洗所述層析柱以除去色素和未吸附的雜質(zhì)，再用3-5倍柱體積的體積濃度為50%-80%的乙醇水溶液洗脫活性成分，分管收集洗脫液，檢測其抗真菌活性；
[0010](3)合并步驟(2)中收集的抗真菌活性組分并減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，得活性濃縮液；
[0011](4)活性濃縮液經(jīng)裝填有型號為Sephadex LH20的葡聚糖凝膠的層析柱進(jìn)行分子篩層析，用1-2倍柱體積的體積濃度為60%的乙醇水溶液洗脫，分管收集洗脫液，檢測其抗真菌活性，收集抗真菌活性組分。
[0012]步驟(I)中的離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為4500rpm，離心的時間為1min。
[0013]步驟(2)中所述甲醇水溶液的體積濃度優(yōu)選為50%，用量為2倍柱體積。
[0014]步驟(2)中乙醇水溶液的體積濃度優(yōu)選為60%，用量為5倍柱體積。
[0015]步驟(2)的層析柱的裝柱體積優(yōu)選為15-25ml、柱高徑比為8:1_15:1，上樣流速為1-1.5ml/min,洗脫流速為 0.3-0.6ml/min。
[0016]步驟(3)優(yōu)選為:合并步驟(2)中收集的抗真菌活性組分并減壓濃縮至原體積的1/3,得活性濃縮液。
[0017]步驟(4)的層析柱的裝柱體積優(yōu)選為80_100ml，柱高徑比為10:1_20:1，上樣流速為 0.1-0.3ml/min,洗脫流速為 0.1-0.3ml/min。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0019]1.分離純化流程簡單快速、操作方便、成本低廉。
[0020]2.三廢排放較少，對環(huán)境友好。
[0021]3.純化過程溫和，抗真菌活性物質(zhì)的純度較高。
[0022]4.選用低毒性、低沸點(diǎn)的乙醇作為洗脫劑，后續(xù)回收處理簡單；分離時間較短。
【附圖說明】
[0023]圖1為實(shí)施例2中絮凝處理后的發(fā)酵液與原始發(fā)酵液抗真菌活性的對比。
[0024]圖2為實(shí)施例2中吸附柱層析收集到的組分的抗真菌活性檢測結(jié)果。分管收集并按收集順序依次編號后，每管取1ul滴加到PDA平皿的病原真菌菌絲塊周圍，28°C恒溫培養(yǎng)12h，記錄結(jié)果。對照分別為絮凝后的發(fā)酵液(CK)、50%甲醇(50%甲)和60%乙醇(60%乙)。
[0025]圖3為實(shí)施例2中分子篩層析收集到的組分的抗真菌活性檢測結(jié)果。分管收集并按收集順序依次編號后，每管取1ul滴加到PDA平皿的病原真菌菌絲塊周圍，28°C恒溫培養(yǎng)12h,記錄結(jié)果。
[0026]圖4為實(shí)施例2中分子篩層析收集到的抗真菌活性組分的LC-MS圖。LC-MS條件為LCQ Deca XP MAX四級桿離子肼質(zhì)譜檢測器(Thermo Finnigan，CA，USA)，色譜柱為XBPC18column(150mm, 2.lmm;Agela Technologies)，流動相為乙臆:水(35:65)，流速 0.2ml/min0
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明作任何限制。
[0028]利迪鏈霉菌StMptomyces lydicus E9于2009年5月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，并已存活。保藏機(jī)構(gòu)地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101，電話:010-64807355,保藏號為CGMCC N0.3075。以下簡稱利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075。
[0029]實(shí)施例1
[0030]取_40°C保存的菌種(利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075)接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，220rpm、28°C回旋式搖床培養(yǎng)48h，得到一級種子。將一級種子以10% (v/v)接種于裝有10mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，220rpm、28°C回旋式搖床培養(yǎng)24h,得到二級種子。將二級種子混勻后，4500rpm離心1min,用同等體積的無菌水重懸，然后按10% (v/v)的接種密度接種到裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在28°C，攪拌轉(zhuǎn)速500rpm,通氣量2vvm,pH自然,發(fā)酵18h即可卸罐,收集發(fā)酵液用于抗真菌活性物質(zhì)的分離純化。
[0031]種子培養(yǎng)基(g/L)的組成如下，淀粉30，葡萄糖5，酵母粉4，蛋白胨2，K2HPO4L 5，Mg2SO4.7Η200.5，NaCl0.5，余量為水，pH 自然，121°C蒸汽滅菌 20min。
[0032]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)的組成如下，淀粉40，葡萄糖5，蛋白胨2，K2HPO4L 0，Mg2SO4.7Η200.5，NaCl0.5，余量為水，pH 自然，121°C蒸汽滅菌 20min。
[0033]實(shí)施例2
[0034]一種利迪鏈霉菌發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的分離純化方法，包括如下步驟:
[0035](I)將利迪鏈霉菌S.lydicus E9保藏號為CGMCC N0.3075的發(fā)酵液在4500rpm的轉(zhuǎn)速下離心1min,收集上清液,檢測其抗真菌活性,按比例在IL上清