利用油茶下胚軸獲得再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于油茶細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種以油茶下胚軸為外植體誘導(dǎo)不定 芽，繼而獲得完整試管苗的組織培養(yǎng)培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油茶（Camellia Oleifera)是山茶科（Theaceae)山茶屬（Camellia)常綠灌木或 小喬木，是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，與油橄欖、油棕、椰子并稱(chēng)為世界四大木本油料 植物。茶油不飽和脂肪酸含量達(dá)90%以上，色佳味香，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，耐貯藏，有降血 壓、血脂及軟化血管的作用，對(duì)心血管疾病的預(yù)防有重要作用，是優(yōu)質(zhì)的食用油之一，被譽(yù) 為"東方橄欖油"。同時(shí)，油茶副產(chǎn)物還是生產(chǎn)肥料、農(nóng)藥、栲膠的優(yōu)質(zhì)原料。油茶主要分布 于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，湖南和江西是油茶主要種植區(qū)。目前，中國(guó)共有油茶林4531. 2 萬(wàn)畝，年產(chǎn)茶油20多萬(wàn)噸，平均畝產(chǎn)茶油5. 8kg，油茶產(chǎn)業(yè)普遍存在著單位面積產(chǎn)量低和 經(jīng)濟(jì)效益差兩大問(wèn)題。油茶低產(chǎn)低效的重要原因之一就是良種化程度低，品種混亂，大部 分油茶林處于野生狀態(tài)，產(chǎn)量較低，良種苗木短缺不能大面積推廣種植。同時(shí)，油茶炭疽病 Glomerella cingulata(Stonem.)Spauld et Schrenk是油茶的主要病害。在長(zhǎng)江流域以南 各省的大面積油茶栽培區(qū)，以及河南、陜西南部地區(qū)發(fā)生普遍。病害發(fā)生后，引起嚴(yán)重落果、 落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，嚴(yán)重影響了油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。通過(guò)組織培養(yǎng)可以快速 繁殖油茶脫毒苗，在此基礎(chǔ)上通過(guò)遺傳體系轉(zhuǎn)化而獲得抗病植株，在木本油料植物遺傳改 良方面有廣闊的前景。
[0003] 組織培養(yǎng)是快速繁殖優(yōu)良植物品種的一條重要途徑，具有廣闊的商業(yè)化前景。關(guān) 于油茶組織培養(yǎng)的研宄較多，張智俊等人利用油茶無(wú)性系子葉通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲 得了再生植株，李澤等人利用油茶帶芽莖段獲得再生植株，但以上研宄只能在油茶組織培 養(yǎng)快繁方面有重要意義，不能應(yīng)用到油茶遺傳體系轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。植物遺傳體系轉(zhuǎn) 化最常用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染植物葉片、下胚軸、葉柄、胚根等器官，而油茶葉片誘 導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率僅為17.86%，目前還不能應(yīng)用在油茶遺傳體系轉(zhuǎn)化方面，油茶轉(zhuǎn)基因至 今還未找到合適的外植體。下胚軸是通過(guò)合子胚發(fā)育而來(lái)胚性器官，胚性較強(qiáng)，具有很高的 活力及分化再生能力，在植物遺傳體系轉(zhuǎn)化中有廣闊的前景。本發(fā)明通過(guò)利用油茶下胚軸 誘導(dǎo)不定芽，再通過(guò)不定芽的繼代增殖、生根和煉苗移栽等一系列過(guò)程，旨在建立一個(gè)高效 穩(wěn)定的油茶下胚軸離體快繁體系，為油茶快速繁殖及工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵還在于能 夠通過(guò)農(nóng)桿菌浸染實(shí)現(xiàn)油茶遺傳轉(zhuǎn)化的可能性，為油茶快速繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化提供更廣的途 徑和技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前油茶采用葉盤(pán)法獲得再生植株技術(shù)還未建立，在此基 礎(chǔ)上，提供了利用油茶下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)獲得再生植株的方法，該方法利用油茶幼嫩的 下胚軸誘導(dǎo)不定芽，其誘導(dǎo)率高，不定芽健壯，不定芽繼代增殖系數(shù)高，壯苗效果好，生根率 高，關(guān)鍵還在于能夠通過(guò)農(nóng)桿菌浸染實(shí)現(xiàn)油茶遺傳轉(zhuǎn)化的可能性。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的。
[0006] 利用油茶下胚軸獲得再生植株的方法
[0007] 1)誘導(dǎo)不定芽：在無(wú)菌條件下切取長(zhǎng)為1. 0-2. 0cm的油茶無(wú)菌苗下胚軸軸段，接 種到培養(yǎng)基為 1/2MS+3. 0-5. Omg/L 6-BA+0. 05-0. lmg/L IAA+0-0. lmg/L NAA+2. Omg/L GA3 誘導(dǎo)不定芽；
[0008] 2)繼代培養(yǎng)：將下胚軸誘導(dǎo)的不定芽切下接種到1/2MS+2. 0-3. Omg/L 6-BA+0. 05-0. lmg/L IBA+0-1. Omg/L 6^的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的繼代培養(yǎng)；
[0009] 3)壯苗培養(yǎng)：將增殖培養(yǎng)得到的芽轉(zhuǎn)接到WPM+0. 5mg/LNAA+3. 0-5.Omg/L6八3的 培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；
[0010] 4)生根培養(yǎng)；
[0011] 5)煉苗、移栽。
[0012] 上述方法中誘導(dǎo)不定芽時(shí)暗培養(yǎng)2天后，再到光照條件下培養(yǎng)20-25天。
[0013] 上述方法中繼代增殖培養(yǎng)時(shí)暗培養(yǎng)3天，再到光照條件下培養(yǎng)20-30天。
[0014] 上述方法中壯苗培養(yǎng)時(shí)暗培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)20-25天。
[0015] 上述方法中將壯苗培養(yǎng)獲得3-4cm的苗接到1/2MS+1. 0-2. 0mg/L IBA+1. 0-2. 0mg/L NAA+35g/L珍珠巖的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0016] 上述方法中生根培養(yǎng)時(shí)暗培養(yǎng)5天，再轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)20天即可生根。
[0017] 上述方法中培養(yǎng)溫度為26±1°C，光照培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度為2100-22001X，光照時(shí)間 12-14h/d;所述方法中用到的培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH調(diào)至5. 4-5. 6。
[0018] 上述方法中下胚軸誘導(dǎo)不定芽使用的培養(yǎng)基優(yōu)選為：l/2MS+3. 0mg/L 6-BA+0.0 5-0. lmg/L IAA+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L GA3；
[0019] 上述方法中增殖培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基優(yōu)選為：l/2MS+2.0-3. Omg/L 6-BA+0.0 5mg/L IBA+0-1. Omg/L GA3〇
[0020] 上述方法中煉苗、移栽的具體過(guò)程如下：
[0021] 將生根后的油茶試管苗先在室內(nèi)進(jìn)行移栽前煉苗3-5天，然后從培養(yǎng)瓶中取出， 附帶珍珠巖直接移栽到營(yíng)養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土：珍珠巖：黃土= 2:1: 1，組培苗移栽后保 持濕度80%以上，覆蓋薄膜并每天噴水1-2次，兩周后即逐步進(jìn)行正常管理。
[0022] 上述方法中油茶無(wú)菌苗的獲得過(guò)程如下：
[0023] 選取成熟的當(dāng)年生油茶種子，取除種皮，將種仁用自來(lái)水沖洗3-5min，然后浸泡 10-15h，中間換水2-3次，然后在超凈工作臺(tái)中先用75%的酒精浸泡20-30s無(wú)菌水沖洗 3-5次，再用0. 1 %的HgCl2消毒3-6min，用無(wú)菌水沖洗5-6次，切掉胚乳的大部分，把附帶 胚乳的種胚接種在WPM基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2-3天后轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)20-25天即可 獲得無(wú)菌苗；培養(yǎng)溫度為26±1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001X，光照時(shí)間12-14h/d。
[0024] 本發(fā)明主要過(guò)程包括：油茶種胚無(wú)菌苗的獲得，下胚軸不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖培 養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽。該方法對(duì)油茶下胚軸不定芽誘導(dǎo)率高，出芽數(shù)多，繼 代增殖系數(shù)高，壯苗效果好，生根率高；不僅為快速繁殖油茶植株提供了一條新的技術(shù)途 徑，而且為以后通過(guò)基因工程的方法改良油茶抗性、培育抗病植株，提高油茶產(chǎn)量及油茶遺 傳體系的建立打下基礎(chǔ)。這為油茶從傳統(tǒng)的育種方式向分子育種方向邁進(jìn)提供了可行性， 為以后緩解我國(guó)糧油安全方面有著重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為本發(fā)明油茶下胚軸誘導(dǎo)出不定芽初期的照片；
[0026] 圖2為本發(fā)明油茶下胚軸誘導(dǎo)不定芽30天的照片；
[0027] 圖3為本發(fā)明油茶不定芽增殖培養(yǎng)的照片；
[0028] 圖4為本發(fā)明不定芽增殖培養(yǎng)后期的照片；
[0029]圖5為本發(fā)明油茶不定芽壯苗培養(yǎng)的照片；
[0030]圖6為本發(fā)明油茶不定芽壯苗培養(yǎng)的照片；
[0031]圖7為本發(fā)明油茶不定芽生根培養(yǎng)的照片；
[0032] 圖8為本發(fā)明油茶不定芽生根培養(yǎng)的照片；
[0033]圖9為本發(fā)明油茶生根后移栽的組培苗的照片；
[0034] 圖10為本發(fā)明油茶移栽后成活的組培苗的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 依次進(jìn)