采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定 根中皂苷積累的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西洋參為五加科人參屬多年生草本植物，70年代在我國引種成功。其味甘、微苦， 性涼，入心、肺、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)、強(qiáng)心、造血、健胃、鎮(zhèn)靜、降血脂、抗癌和抗衰老等多種醫(yī)療 作用，是當(dāng)今社會人們一致看好的名貴強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥。
[0003] 西洋參皂苷作為西洋參中的一類主要活性成分，其產(chǎn)量低，目前尚未人工合成。目 前，西洋參主要依賴大田培養(yǎng)，然而栽培的西洋參栽培技術(shù)復(fù)雜，生長周期長，"老參地"加 之生態(tài)環(huán)境破壞等問題一直難以解決，使西洋參的市場呈現(xiàn)供不應(yīng)求的狀態(tài)，為了解決這 個問題，滿足人們的需要，人們嘗試通過各種途徑來提高西洋參次級代謝產(chǎn)物的含量，如組 織培養(yǎng)及反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，補(bǔ)料培養(yǎng)、兩步培養(yǎng)、前體飼喂、毛狀根的誘導(dǎo)、誘導(dǎo)子的添加 等。
[0004] 目前，采用水解乳蛋白和茉莉酸甲酯這兩種誘導(dǎo)子的協(xié)同作用在西洋參不定根培 養(yǎng)中尚未報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不 定根中皂苷積累的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] 采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法，包括以下步驟：挑選生 長良好的西洋參不定根接種到改造的3/4MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28~30天，加入作為誘 導(dǎo)子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白終濃度為98~ 100mg/L，使茉莉酸甲酯終濃度為8~10mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)2~7天，收獲，干燥，所述改造的 3/4MS液體培養(yǎng)基用下述方法制成：在3/4MS液體培養(yǎng)基中加入蔗糖使終濃度為30-40g/L， 加入吲哚丁酸使終濃度為3-5mg/L，加入萘乙酸使終濃度為0. 5-lmg/L，調(diào)節(jié)pH為5. 8-6. 0， 滅菌。
[0008] 優(yōu)選的是水解乳蛋白水溶液母液用下述方法制成：將水解乳蛋白用蒸餾水溶解配 制成濃度為lmg/ml的溶液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾滅菌。
[0009] 優(yōu)選的是茉莉酸甲酯乙醇溶液母液用下述方法制成：將茉莉酸甲酯用無水乙醇配 制成濃度為lmg/ml的溶液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾滅菌。
[0010] 培養(yǎng)的條件優(yōu)選為：無菌、23±2°C、無菌空氣通氣量為0. 3-0. 5vvm。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 實(shí)驗(yàn)證明水解乳蛋白和茉莉酸甲酯兩種誘導(dǎo)子能發(fā)揮協(xié)同作用，配合改造的 3/4MS液體培養(yǎng)基的作用，對西洋參不定根次級代謝產(chǎn)生影響，皂苷含量高，為西洋參的大 規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)，實(shí)現(xiàn)西洋參皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0014] 表1 MS培養(yǎng)基配方表
[0016] (1L3/4MS液體培養(yǎng)基的配制：取上述MS培養(yǎng)基配方中的3/4質(zhì)量份加水至1L)
[0017] 實(shí)施例1
[0018] 水解乳蛋白水溶液母液的制備：將水解乳蛋白用蒸餾水溶解配制成濃度為Img/ ml的溶液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾滅菌。
[0019] 茉莉酸甲酯乙醇溶液母液的制備：將茉莉酸甲酯用無水乙醇配制成濃度為Img/ ml的溶液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾滅菌。
[0020] 實(shí)施例2
[0021] 采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法，包括以下步驟：
[0022] 挑選生長良好的西洋參不定根接種到2. 5L改造的3/4MS液體培養(yǎng)基中，在無菌、 23±2°C、調(diào)節(jié)通氣量為0. 3vvm，自然光照條件下培養(yǎng)29天，加入作為誘導(dǎo)子的實(shí)施例1制 備的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白終濃度為98mg/L， 使茉莉酸甲酯終濃度為8mg/L，再以無菌、23±2°C，調(diào)節(jié)通氣量為0.3vvm，自然光照條件下 培養(yǎng)2天，收獲，干燥。
[0023] 改造的3/4MS液體培養(yǎng)基的制備：在3/4MS液體培養(yǎng)基中加入蔗糖使終濃度為 35g/L，加入吲哚丁酸使終濃度為3mg/L，加入萘乙酸使終濃度為0. 5mg/L，調(diào)節(jié)pH為6,在 121 °C，0.1 MP壓力下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0024] 與實(shí)施例2相同的步驟，僅將水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的終濃度分別調(diào)節(jié)為： 0mg/ml，0mg/ml (第一對照組）；98mg/ml，0mg/ml (實(shí)驗(yàn) 1 組）；0mg/ml，8mg/ml (實(shí)驗(yàn) 2 組）。
[0025] 對上面的各個產(chǎn)物進(jìn)行總皂苷含量測定與分析。
[0026] 西洋參不定根培養(yǎng)中皂苷含量的HPLC定量分析：
[0027] 實(shí)驗(yàn)儀器及試藥：
[0028] 安捷倫1200高效液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)和四元泵。人參皂苷RgpRg2JV Rb 2、Rc、RcU Re對照品購于中國藥品生物制品檢定所，色譜純甲醇，色譜純乙腈，超純水。
[0029] 方法：
[0030] 1)色譜條件
[0031] 色譜柱為Kromasil C18(4. 6mmX250mm，5 μπι);流動相（A)為乙腈，流動相⑶為 超純水；梯度洗脫程序：〇 - 35min，Α:20% ;35 - 40min，A :20% - 30% ;40 - 50min, A : 30%- 32% ;50 - 57min，A:32%- 33% ;57 - 65min，A :33%- 45%。流速 1.0 mL/min ; 進(jìn)樣體積為20 μ L ;柱溫35°C ;檢測波長203nm。
[0032] 2)供試品溶液的制備
[0033] 精密稱取0. 2g干燥的不定根樣品置于IOOmL具塞三角瓶中，加入20mL甲醇，60°C 水浴lh，趁熱抽濾，重復(fù)抽提一次，合并濾液。揮干濾液，再加入IOmL蒸餾水溶解，用20mL 正丁醇萃取兩次，收集正丁醇層，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理后，甲醇定容至lmL。用0. 22 μπι微孔濾 膜過濾，得樣品供試品。
[0034] 3)皂苷對照品溶液的制備
[0035] 精密稱取經(jīng)減壓干燥24小時以上的西洋參皂苷Rgl、Rg2、Rb^ Rb2、Rc、RcU Re標(biāo)品 各lmg，置于5mL容量瓶中，少量甲醇超聲溶解，再用甲醇定容至刻度，配成0. 2mg/L的西洋 參皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，密封置冰箱4°C保存。檢測結(jié)果見表2。
[0036] 表 2
[0038] 實(shí)施例3
[0039] 采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法，包括以下步驟：
[0040] 挑選生長良好的西洋參不定根接種到2. 5L改造的3/4MS液體培養(yǎng)基中，在無菌、 23±2°C、調(diào)節(jié)通氣量為0. 4vvm，自然光照條件下培養(yǎng)30天，加入作為誘導(dǎo)子的實(shí)施例1制 備的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白終濃度為99mg/L， 使茉莉酸甲酯終濃度為9mg/L，再以無菌、23±2°C，調(diào)節(jié)通氣量為0. 4vvm，自然光照條件下 培養(yǎng)5天，收獲，干燥。
[0041] 改造的3/4MS液體培養(yǎng)基的制備：在3/4MS液體培養(yǎng)基中加入蔗糖使終濃度為 30g/L，加入吲哚丁酸使終濃度為3mg/L，加入萘乙酸使終濃度為lmg/L，調(diào)節(jié)pH為5. 9,在 121 °C，0.1 MP壓力下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0042] 與實(shí)施例3相同的步驟，僅將水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的終濃度分別調(diào)節(jié)為： Omg/ml，Omg/ml (第二對照組）；99mg/ml，Omg/ml (實(shí)驗(yàn) 3 組）；0mg/ml，9mg/ml (實(shí)驗(yàn) 4 組）。
[0043] 對上面的各個產(chǎn)物進(jìn)行總皂苷含量測定與分析，檢測結(jié)果見表3。
[0044] 表 3
[0046] 實(shí)施例4
[0047] 采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法，包括以下步驟：
[0048] 挑選生長良好的西洋參不定根接種到2. 5L實(shí)施例1制備的改造的3/4MS液體培 養(yǎng)基中，在無菌、23±2°C、調(diào)節(jié)通氣量為0. 5vvm，自然光照條件下培養(yǎng)28天，加入作為誘 導(dǎo)子的實(shí)施例4制備的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋 白終濃度為l〇〇mg/L，茉莉酸甲酯的終濃度為10mg/L，再以無菌、23±2°C，調(diào)節(jié)通氣量為 0. 5vvm，自然光照條件下培養(yǎng)7天，收獲，干燥。
[0049] 改造的3/4MS液體培養(yǎng)基的制備：在3/4MS液體培養(yǎng)基中加入蔗糖使終濃度為 40g/L，加入吲哚丁酸使終濃度為5mg/L，加入萘乙酸使終濃度為lmg/L，調(diào)節(jié)pH為5. 8,在 121 °C，0.1 MP壓力下滅菌25分鐘，冷卻至常溫，備用。
[0050] 與實(shí)施例4相同的步驟，僅將水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的終濃度分別調(diào)節(jié)為： 0mg/ml，0mg/ml (第三對照組）；100mg/ml，0mg/ml (實(shí)驗(yàn) 5 組）；0mg/ml，10mg/ml (實(shí)驗(yàn) 6 組）。
[0051] 對上面的各個產(chǎn)物進(jìn)行總皂苷含量測定與分析，檢測結(jié)果見表4。
[0052] 表 4
[0054] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的方法培養(yǎng)的西洋參不定根，培養(yǎng)周期要比原根短，并且其活性 次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率高且比較穩(wěn)定，培養(yǎng)物均一。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法，其特征在于包括以下步驟： 挑選生長良好的西洋參不定根接種到改造的3/4MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28~30天，加入 作為誘導(dǎo)子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白終濃度 為98~100mg/L，使茉莉酸甲酯終濃度為8~10mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)2~7天，收獲，干燥，所 述改造的3/4MS液體培養(yǎng)基用下述方法制成：在3/4MS液體培養(yǎng)基中加入蔗糖使終濃度為 30-40g/L，加入吲哚丁酸使終濃度為3-5mg/L，加入萘乙酸使終濃度為0. 5-lmg/L，調(diào)節(jié)pH 為5. 8-6. 0,滅菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述水解乳蛋白水溶液母液用下述方法制 成：將水解乳蛋白用蒸餾水溶解配制成濃度為lmg/ml的溶液，經(jīng)0. 22ym濾膜過濾滅菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述茉莉酸甲酯乙醇溶液母液用下述方法 制成：將茉莉酸甲酯用無水乙醇配制成濃度為lmg/ml的溶液，經(jīng)0. 22ym濾膜過濾滅菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件為：無菌、23±2°C、 無菌空氣通氣量為〇? 3-0. 5vvm〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了采用兩種誘導(dǎo)子促進(jìn)西洋參不定根中皂苷積累的方法，包括以下步驟:挑選生長良好的西洋參不定根接種到改造的3/4MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)28～30天，加入作為誘導(dǎo)子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白終濃度為98～100mg/L，使茉莉酸甲酯終濃度為8-10mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)2-7天，收獲，干燥。實(shí)驗(yàn)證明水解乳蛋白和茉莉酸甲酯兩種誘導(dǎo)子能發(fā)揮協(xié)同作用，對西洋參不定根次級代謝產(chǎn)生影響，皂苷含量高，為西洋參的大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)，實(shí)現(xiàn)西洋參皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN104920209
【申請?zhí)枴緾N201510255597
【發(fā)明人】高文遠(yuǎn), 王娟, 李金鑫, 李靜, 李建麗, 劉書杰
【申請人】天津大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月18日