一種大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及染色體操作技術(shù)，具體地說是一種大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大菱鮮(Scophthalmusmaximus)屬于菱鮮科(Scophthalmidae)、菱鮮屬(Scophthalmus)，其生長快，自1992年自歐洲引入之后發(fā)展十分迅速，目前已經(jīng)成為我國北方主要的海水養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖工藝和產(chǎn)業(yè)鏈也相對完善，每年的總產(chǎn)量超過10萬噸，形成了頗具規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。但是，近年來大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)由于累代養(yǎng)殖和近親交配，造成種質(zhì)嚴(yán)重退化。因此采取有效方法，對大菱鲆進(jìn)行遺傳改良，獲得良種已成當(dāng)務(wù)之急。雜交是進(jìn)行品種改良最有效的方法之一。通過不同品系的雜交，可以獲得性狀優(yōu)良的品種。純系是進(jìn)行雜交育種的必需材料，而采用傳統(tǒng)的方法獲得近交純系，往往要連續(xù)7-8代甚至十幾代的近交選育。對于最低性成熟年齡2-3齡的海水養(yǎng)殖魚類，就需要十幾甚至幾十多年的時間。由于時間過長，資金花費和養(yǎng)殖技術(shù)難度均較大，傳統(tǒng)的培育純系方法往往使人望而卻步。雌核發(fā)育是單性生殖的一種，用遺傳物質(zhì)滅活的精子，激活卵子受精發(fā)育，隨后通過抑制第二極體釋放或者抑制早期卵裂使其恢復(fù)二倍體倍性，分別得到異質(zhì)雌核發(fā)育二倍體及同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體，兩者子代的遺傳物質(zhì)完全來自雌核，純化度高，特別是后者的兩套染色體幾乎完全相同，僅需1-2代就可得到穩(wěn)定的純系，從而極大縮短了育種周期。因此，開展大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)和培育研宄，對于大菱鲆良種培育及其養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展是非常必要的；同時，也可以為其他魚類同質(zhì)雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)方法的優(yōu)化提供有益參考。
[0003]人工誘導(dǎo)魚類同質(zhì)雌核發(fā)育首先需要對精液進(jìn)行滅活，由于大菱鲆精液濃度較低，活力較差，易在滅活過程中死亡，會導(dǎo)致受精率的下降。同時，同質(zhì)雌核發(fā)育常采用靜水壓抑制卵裂獲得，其誘導(dǎo)的成功率主要受處理時刻(處理起始的時間)、處理壓力和處理時間(處理延續(xù)的時間)三個因素的影響。靜水壓處理過程中不合適的處理條件會導(dǎo)致受精卵加倍不完全形成非整倍體，或造成受精卵的損傷，也導(dǎo)致同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗成活率下降。以上兩點使得人工誘導(dǎo)大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗具有很大的難度。目前，人工誘導(dǎo)同質(zhì)雌核發(fā)育在魚類中應(yīng)用還較少。海水魚類中僅在真鯛、歐鱸、大黃魚、牙鲆中有過研宄，而在大菱鲆中尚未見報道。由于不同魚種最適的處理條件往往會有很大的差別，利用上述魚種同質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)條件無法成功進(jìn)行大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)，從而制約了其應(yīng)用。因此，對大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化和明確是十分重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0006]一種大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗的誘導(dǎo)方法，
[0007]I)大菱鲆精液滅活及人工受精:
[0008]取精液與卵子按體積比1:100-200比例進(jìn)行授精，作為對照組；
[0009]另取精液用預(yù)冷的Ringer氏液稀釋5-15倍，用劑量為36，OOOerg mm 2的紫外線將精子滅活，取滅活后的精液與卵子按體積比1:10-20比例進(jìn)行授精，作為誘導(dǎo)組；
[0010]2)染色體誘導(dǎo)加倍
[0011]以對照組受精卵出現(xiàn)第一次卵裂痕的時間作為誘導(dǎo)組受精卵出現(xiàn)第一次卵裂痕的時間，在誘導(dǎo)組第一次卵裂痕出現(xiàn)前10-20min，將步驟I)誘導(dǎo)組受精卵置于靜水壓機加壓容器內(nèi)，在55-75MPa靜水壓下進(jìn)行壓力休克處理，處理6?8min后泄壓，取出受精卵，置于海水中繼續(xù)培育。
[0012]所述步驟I)中大菱鲆精液和卵子分別為選擇性成熟的大菱鲆親魚，分別收集精液和卵，鏡檢其質(zhì)量后，待用；其中，精進(jìn)彳丁鏡檢，選擇精子活力尚于IV級的精液；卵進(jìn)彳丁鏡檢，選擇圓球形，無色透明，油球集中的卵子。
[0013]所述對照組為取精液用新鮮海水激活后，迅速與卵子按體積比1:100-200混合均勻，隨后補入卵子體積1-5倍量的新鮮海水進(jìn)行授精，授精后將受精卵用新鮮海水沖洗干凈，置于卵子體積5-10倍量的新鮮海水中培育，受精后30min內(nèi)再補加受精卵體積的10-15倍量新鮮海水，作為對照組；
[0014]所述誘導(dǎo)組為取精液用預(yù)冷的Ringer氏液稀釋5_15倍，用劑量為36，OOOerg mnT2的紫外線將精子滅活，待對照組人工受精15?25min后，滅活后的精液用新鮮海水激活，迅速與卵子按體積比1:10-20比例混合均勻，隨后補入卵子體積1-5倍量的新鮮海水進(jìn)行授精，授精后將受精卵用新鮮海水沖洗干凈，置于卵子體積5-10倍量的新鮮海水中培育，受精后30min內(nèi)再補入卵子體積10-15倍量的新鮮海水，作為誘導(dǎo)組。
[0015]所述步驟I)中精液紫外滅活時溫度保持在O?2°C。所述步驟I)誘導(dǎo)組中精液紫外滅活、滅活精液與卵子進(jìn)行授精及受精卵早期孵育過程均在黑暗避光處進(jìn)行。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下:
[0017]1.由于大菱鲆精液濃度相對較低，精子活力較差，且人工收集過程中往往不可避免的帶入一定的海水，導(dǎo)致精子提前激活，影響其活力。本發(fā)明方法在誘導(dǎo)前對精液進(jìn)行鏡檢，僅選擇精子活力高于IV級的精液進(jìn)行滅活處理，可保證滅活后精子的活力，避免了人力物力的浪費。
[0018]2.魚類雌核發(fā)育精子滅活過程中，通過紫外線照射令精子中的DNA形成嘧啶二聚體，造成精子的遺傳失活。自然光的照射可導(dǎo)致光復(fù)活，恢復(fù)精子的部分遺傳活力，形成非整倍體受精卵，無法正常發(fā)育。同時，滅活過程中不合適的溫度會對精子造成損傷，使其激活卵子的能力下降，降低受精率。以上兩點都最終降低了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育魚類的成活率。本發(fā)明針對大菱鲆精液濃度相對較低，精子活力較差的特點，對滅活過程的條件嚴(yán)格規(guī)范，精子滅活、人工授精及授精后受精卵早期孵育過程均在黑暗避光條件下進(jìn)行，避免了光照導(dǎo)致精子遺傳活力的回復(fù)，可保證人工誘導(dǎo)同質(zhì)雌核發(fā)育大菱鲆的純合度，并提高其成活率。本發(fā)明同時明確了大菱鲆精子紫外滅活過程的溫度范圍，在0-2°C條件下對大菱鲆精子進(jìn)行紫外滅活，在保證滅活效果的同時也不會降低精子的活力。
[0019]3.不同的魚種中，最適的同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)條件往往會有很大的差別，以往國內(nèi)外報道中，均未涉及大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的相關(guān)參數(shù)。本發(fā)明首次對大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的參數(shù)進(jìn)行篩選優(yōu)化，在保證處理時刻穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，對處理壓力強度和處理時間進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳的處理參數(shù)范圍；并按照本發(fā)明的操作過程可快速穩(wěn)定的，得到大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體魚苗，對于大菱鲆良種培育及其養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要價值。
【附圖說明】
[0020]圖1A、B、C分別為大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)組發(fā)育情況圖，其中A為胚體、B為初孵仔魚和C為魚苗。
【具體實施方式】
[0021]本發(fā)明是利用遺傳滅活的精子與卵子進(jìn)行人工授精，通過靜水壓力抑制受精卵卵裂的原理，誘導(dǎo)大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗的方法。通過此方法對目前的海水魚類同質(zhì)雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)方法進(jìn)行了優(yōu)化，可更加準(zhǔn)確的確定誘導(dǎo)的處理時刻，提高了誘導(dǎo)的穩(wěn)定性，能夠得到高成活率的大菱鲆同質(zhì)雌核發(fā)育魚苗，為生產(chǎn)和進(jìn)一步的實驗研宄提供了材料和技術(shù)支持。
[0022]下面結(jié)合實施例詳述本發(fā)明。
[0023]實施例1
[0024]本實施例受精時期、孵育時期以及誘導(dǎo)時期，三個時期所用海水溫度為恒定的適宜大菱鲆卵受精及孵化的水溫，即受精時期、孵育時期以及誘導(dǎo)時期三個時期海水溫度均為 14.5±0.10Co
[0025]I)配子的采集
[0026]選取處于產(chǎn)卵產(chǎn)精盛期待產(chǎn)的親魚輕輕平放在軟墊上，拭去其體表及生殖孔周圍的水和污物，然后自后向前緩緩擠壓，精卵分別擠入燒杯或者盆中備用。解剖鏡下觀察其卵呈圓球形，透明、油球集中、卵徑適中、大小均一；其精液呈乳白色，濃度適宜，顯微鏡下加適量海水激活后精子活力為IV級、游動時間長。
[0027]2)人工受精
[0028]對照組人工受精:
[0029]取0.1mL精液，用少許海水激活后，迅速倒入1mL卵中，輕輕攪動使其混勻。再補充約1mL海水，受精5min后，用新鮮海水反復(fù)沖洗數(shù)次以去掉多余精液，而后將受精卵放入盛有約50mL新鮮海水的容器中待用，并在期間補充約10mL同溫新鮮海水。
[0030]誘導(dǎo)組精子紫外滅活:
[0031]取同批采集的精液用預(yù)冷至2°C的Ringer氏液稀釋10倍，用劑量為36，OOOergmm 2的紫外線將精子滅活，滅活在黑暗避光條件下進(jìn)行。
[0032]誘導(dǎo)組人工受精:
[0033]在對照組人工受精25min后，取15mL滅活的精液，用少許海水激活后，迅速倒入150mL同批采集的卵中，輕輕攪動使其混勻。再補充約150mL海水，受精5min后，用新鮮海水反復(fù)沖洗數(shù)次以去掉多余精液，而后將受精卵放入盛有約800mL新鮮海水的容器中待用，并在期間補充約1500mL同溫新鮮海水。人工授精以及受精卵早期孵育過程均在黑暗避光條件下進(jìn)行。
[0034]3)處理時刻的確定
[0035]人工受精后，用解剖鏡隨時觀察對照組及誘導(dǎo)組的受精卵發(fā)育情況。發(fā)現(xiàn)對照組受精后103min時，受精卵剛剛開始出現(xiàn)第一次卵裂痕，記錄為誘導(dǎo)組的第一次卵裂痕時間，
[0036]此時誘導(dǎo)組的處理時刻為第一次卵裂痕出現(xiàn)前20min，即受精后83min。
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