一種草莓莖尖超低溫脫毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于草莓脫毒技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種草莓莖尖超低溫脫毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草莓（FragariaXananassaDuch.)是薔薇科（Rosaceae)草莓屬（Fragaria)宿 根性多年生常綠草本植物。果實(shí)鮮嫩多汁、色澤艷麗、香氣怡人、口感酸甜適中，是我國(guó)傳統(tǒng) 的優(yōu)秀漿果果品之一。草莓果實(shí)富含維生素C、有機(jī)酸、糖、礦物質(zhì)及果膠等多種營(yíng)養(yǎng)成分。 近年來(lái)研宄發(fā)現(xiàn)草莓所含的親花單寧（Ellagitannins)、花青素（Anthocyanins)和原花青 素（Proanthocyanidins)等生物活性物質(zhì)能預(yù)防心腦血管和癌癥的發(fā)生，因此草莓倍受消 費(fèi)者青睞。
[0003] 草莓繁殖常采用傳統(tǒng)的匍匐莖埋壓或分株繁殖，這種無(wú)性繁殖方式提高了病毒侵 染植株的幾率，病毒侵染草莓植株后將破壞細(xì)胞的代謝，使其表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、 葉片失綠或變色等特征，從而嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，嚴(yán)重減產(chǎn)可達(dá)30%?80%。目前， 已發(fā)現(xiàn)約62種侵染草莓的病毒，其中以草莓皺縮病毒（Strawberrycrinklevirus，SCV)、 草莓斑駁病毒（Strawberrymottlevirus，SMoV)、草莓輕型黃邊病毒（Strawberrymild yellowedgevirus，SMYEV)和草莓鑲脈病毒（Strawberryveinbandingvirus，SVBV)四 種病毒浸染造成的危害最為嚴(yán)重。在栽培過(guò)程中，這四種病毒往往同時(shí)存在，單獨(dú)侵染時(shí)， 除草莓皺縮病毒外其他三種病毒都不表現(xiàn)出明顯癥狀，但會(huì)導(dǎo)致植株矮小、產(chǎn)量下降和品 質(zhì)變劣，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 種苗是生產(chǎn)的起點(diǎn)。為避免病毒給生產(chǎn)帶來(lái)的巨大影響，實(shí)現(xiàn)草莓的無(wú)病毒苗栽 培生產(chǎn)化，是目前我國(guó)草莓業(yè)勢(shì)在必行的發(fā)展趨勢(shì)。目前無(wú)病毒苗主要通過(guò)熱處理脫毒法、 莖尖脫毒法、熱處理結(jié)合莖尖脫毒法、花藥培養(yǎng)法、珠心組織培養(yǎng)法、微莖尖嫁接脫毒法、愈 傷組織培養(yǎng)法和抗病毒劑法等生物技術(shù)方法獲取，其中熱處理結(jié)合莖尖脫毒法運(yùn)用最為 廣泛，然而此法與新興的超低溫冷凍療法相比，存在著操作困難，耗時(shí)長(zhǎng)和脫毒率不高等缺 點(diǎn)。超低溫冷凍療法是一種新型高效脫除植物病毒的新技術(shù)，已在馬鈴薯、柑桔、葡萄、李、 甘薯等植物上進(jìn)行研宄并取得一定成果，目前該法被認(rèn)為是最有效脫除植物病毒的方法， 為脫毒苗的生產(chǎn)開辟了一條新的途經(jīng)。但是，該技術(shù)在草莓上的研宄幾乎空白，四川又是我 國(guó)冬草莓的生產(chǎn)大省，因此建立草莓超低溫療法脫毒技術(shù)勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種草莓莖尖超低溫 脫毒的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種草莓莖尖超低溫脫毒的方法，具體包 括以下步驟：
[0007] 剝離2mm草莓莖尖轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)基，在4°C黑暗條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，蔗糖濃度為 0.3?0.5111〇1*171，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3?5(1，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖，在251：條件下放入60% PVS2培養(yǎng)基中加載30?90min后，轉(zhuǎn)移至PVS2培養(yǎng)基溶液中，于0°C條件下處理1?3h， 然后轉(zhuǎn)入I. 5ml凍存管中，投入液氮中處理lh，將凍存管快速轉(zhuǎn)移至40°C水中，水浴化凍 2min后的莖尖放入洗液中洗滌2次，每次20min，直至莖尖漂浮在洗液表面，最后將處理結(jié) 束的莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中，21?25°C暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)入16h? (T1光照下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度 為52ymol? (m2 ?S)'獲得草莓脫毒苗。
[0008] 所述的預(yù)培養(yǎng)基成為以5培養(yǎng)基+2%甘油+0.3?0.5111〇1噸- 1蔗糖+6.5§噸-1瓊 脂，pH5. 8。
[0009] 所述的PVS#§養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞 砜+4(^.171蔗糖。
[0010] 所述的60%PVS#§養(yǎng)基為：0. 6mol?I蔗糖的MS液體培養(yǎng)基與PVS2培養(yǎng)基的 體積比為40:60。
[0011] 所述的洗液為含有I. 2mol?I71蔗糖的MS培養(yǎng)基。
[0012] 所述的恢復(fù)培養(yǎng)基的配方為：MS培養(yǎng)基+0. 4mg 05mg?PNAA+O. 15mg?L _^3+6. 5g?L-1 瓊脂 +30g?L―1 蔗糖。
[0013] 本發(fā)明中的草莓莖尖超低溫脫毒的原理為：
[0014] 超低溫冷凍療法的脫毒原理主要是利用莖尖分生組織細(xì)胞與分化細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的 差異。為忍受超低溫（-196°c)的極端環(huán)境，材料需經(jīng)過(guò)脫水處理后再放入液氮中，以免細(xì) 胞內(nèi)大量冰晶形成，降低對(duì)細(xì)胞器和細(xì)胞膜的損傷，從而提高細(xì)胞存活率。莖尖分生組織 細(xì)胞具有體積較小，液泡小和較大核質(zhì)體積比等特點(diǎn)，脫水更容易，在液氮環(huán)境中不易被凍 死；而分化細(xì)胞體積較大，含有較大的液泡和較小的核質(zhì)比，脫水處理較難，在超低溫環(huán)境 下易被凍死。此外，莖尖分生組織所在區(qū)域所含病毒少或不含病毒，而分化組織細(xì)胞所在區(qū) 域往往是病毒積累區(qū)。因此，當(dāng)莖尖分生組織經(jīng)液氮處理后，受傷死亡的細(xì)胞往往是分化細(xì) 胞，存活的細(xì)胞是不含病毒的分生組織細(xì)胞，繼而通過(guò)培養(yǎng)使其形成無(wú)病毒植株。
[0015] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0016] 本發(fā)明超低溫冷凍療法應(yīng)用到草莓脫毒的領(lǐng)域，建立了草莓莖尖超低溫脫毒的方 法，具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短和脫毒率高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的草莓莖尖超低溫脫毒方法的超低溫 保存成活率為69. 03 %，其脫毒率達(dá)100 %，具有很好的技術(shù)效果和推廣前景。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為脫毒再生苗RT-PCR電泳結(jié)果圖，其中，M為marker，l?8為不同脫毒再生 苗。
[0018] 圖2為再生脫毒苗圖，其中，A為草莓莖尖超低溫脫毒后恢復(fù)再生，B脫毒再生苗誘 導(dǎo)成完整植株。
[0019] 圖3為脫毒苗生根和移栽圖，其中，A為脫毒再生苗誘導(dǎo)生根，B脫毒再生苗移栽煉 苗。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0021] 實(shí)施例I
[0022] 本發(fā)明提供了一種草莓莖尖超低溫脫毒的方法，具體包括以下步驟：
[0023] 剝離2mm草莓莖尖轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2 %甘油+3M蔗糖+6.58.171, pH5. 8)，在4°C黑暗條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，蔗糖濃度為0. 3?0. 5mol?L'預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為 3?5d，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖，在25°C條件下放入60 %PVS2培養(yǎng)基（PVS2培養(yǎng)基：MS培養(yǎng) 基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+4(^.171蔗糖，60%PVS2培養(yǎng)基：0.6mol?廠1 蔗糖MS液體培養(yǎng)基與PVS2的體積比為40:60)中加載30?90min后轉(zhuǎn)移至100%PVS2培 養(yǎng)基溶液中，于(TC條件下處理1?3h，然后轉(zhuǎn)入I. 5ml凍存管中，投入液氮中處理Ih，將凍 存管快速轉(zhuǎn)移至40°C水中，水浴化凍2min后的莖尖放入洗液（MS培養(yǎng)基+1. 2mol?I71蔗 糖）中洗滌2次，每次20min，直至莖尖漂浮在洗液表面，最后將處理結(jié)束的莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培 養(yǎng)基中（恢復(fù)培養(yǎng)基為MS+0. 4mg?Lh-BA+O. 05mg?LiNAA+O. 15mg?L1GAfG. 5g?L1瓊脂 +30g噸―1)，21?25°C暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)入16h^cf1正常光照（光照強(qiáng)度為52ymol? (m2 .s)-1) 下培養(yǎng)，獲得草莓脫毒苗。一周之后統(tǒng)計(jì)存活率。
[0024] 進(jìn)行獲得的草莓脫毒苗的脫毒率檢測(cè)
[0025] 將檢測(cè)不含病毒的株系轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上（生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+6. 5g*L1 瓊脂+SOg*!/1鹿糖。待根長(zhǎng)枝2cm左右時(shí)，進(jìn)行煉苗移栽。提取再生苗葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄 成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNAIy1進(jìn)行單一PCR反應(yīng)，檢測(cè)草莓脫毒苗的脫毒率。PCR體系 中所加的引物為篩選的合適引物（如表1中所示），濃度為0.2ymol 體系中加 Iy1)，體系中還包括：TaqMixlOml，用超純水補(bǔ)充至20y1，整個(gè)操作必須在冰上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C，3min;94°C，Imin;退火溫度（SCV1/SCV2 為 58°C，SMoVl/SMoV2 為 60°C， SMYEV1/SMYEV2 為 50°C，SVBV1/SVBV2 為 52°C)，40s;72°C，40s，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 5min。用2. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳EB染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，脫毒再生苗RT-PCR電泳結(jié)果如圖 1所示。
[0026] 表1四種病毒基因組特異片段相關(guān)的引物對(duì)
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種草莓莖尖超低溫脫毒的方法，其特征在于：具體包括以下步驟： 剝離2_草莓莖尖轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)基，在4°C黑暗條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，蔗糖濃度為0. 3? 0. 5mol · Γ1，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3?5d，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后的莖尖，在25°C條件下放入60% PVS#§ 養(yǎng)基中加載30?90min后，轉(zhuǎn)移至PVS2培養(yǎng)基溶液中，于0°C條件下處理1?3h，然后轉(zhuǎn) 入I. 5ml凍存管中，投入液氮中處理lh，將凍存管快速轉(zhuǎn)移至40°C水中，水浴化凍2min后 的莖尖放入洗液中洗滌2次，每次20min，直至莖尖漂浮在洗液表面，最后將處理結(jié)束的 莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中，21?25°C暗培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)入16h · (Γ1光照下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為 52μπι〇1 · (m2 · sr1，獲得草莓脫毒苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖超低溫脫毒的方法，其特征在于：所述的預(yù)培養(yǎng)基 成為：MS培養(yǎng)基+2%甘油+3M蔗糖+6. 5g · L-1瓊脂，pH5. 8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖超低溫脫毒的方法，其特征在于：所述的PVS 2培養(yǎng) 基的配方為：MS培養(yǎng)基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+40g · Γ1蔗糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖超低溫脫毒的方法，其特征在于：所述的60% PVS 2 培養(yǎng)基為：〇. 6mol · Γ1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基與PVS 2培養(yǎng)基的體積比為40:60。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖超低溫脫毒的方法，其特征在于：所述的洗液為含 有I. 2mol · L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖超低溫脫毒的方法，其特征在于：所述的恢復(fù)培養(yǎng) 基的配方為：MS 培養(yǎng)基 +0· 4mg · Ll-BA+O. 05mg · LlAA+O· 15mg · T1GAje. 5g · Γ1 瓊脂 +30g · L-1 鹿糖。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種草莓莖尖超低溫脫毒的方法，屬于草莓脫毒技術(shù)領(lǐng)域。所述的草莓莖尖超低溫脫毒的方法，具體包括以下步驟：取感染病毒的草莓外植體，切取莖尖，預(yù)培養(yǎng)，投入液氮，化凍和洗滌，恢復(fù)培養(yǎng)和植株再生，再生植株病原體檢測(cè)。本發(fā)明超低溫冷凍療法應(yīng)用到草莓脫毒的領(lǐng)域，建立了草莓莖尖超低溫脫毒的方法，具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短和脫毒率高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的草莓莖尖超低溫脫毒方法的超低溫保存成活率為69.03％，其脫毒率達(dá)100％，具有很好的技術(shù)效果和推廣前景。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104604685
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510050577
【發(fā)明人】羅婭, 湯浩茹, 邱靜, 李雁翎, 田鈺, 冉謝然夫, 凌亞杰, 王小蓉, 張勇, 陳清
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年1月31日