專利名稱：編碼類黃酮途徑酶的遺傳序列及其應(yīng)用的制作方法
總的來說，本發(fā)明涉及編碼類黃酮途徑代謝酶的遺傳序列及其應(yīng)用。例如用于控制植物和其他有機(jī)體的著色作用。
花卉工業(yè)的目標(biāo)就是致力于培育出新的不同的顯花植物品種。產(chǎn)生這種新品種的有效方法是通過對花卉顏色的控制，曾使用過傳統(tǒng)的培育技術(shù)成功地使大部分商業(yè)花卉品種顯示出各種各樣的顏色。但是，這種技術(shù)受到某種特定種屬基因庫的限制，鑒于此原因，對于一個(gè)花卉品種很少有全色譜的花色種類。的確，由于蘭色花卉來源有限，在荷蘭1988年通過拍賣系統(tǒng)出售的切花不到百分之五是蘭色花。在十二種銷路最好的花卉中，只有鳶尾和小蒼蘭屬提供蘭色品種，并且這些品種占整個(gè)花卉銷售量的不到百分之四。培育主要切花種屬例如玫瑰，菊花，荷蘭石竹和非洲菊的蘭色品種，將為切花和裝飾市場開拓廣闊前景。
花的顏色主要取決于兩種類型的色素類黃酮和類胡蘿卜素。類黃酮可產(chǎn)生從黃到紅到蘭范圍內(nèi)的顏色。類胡蘿卜素帶來橘黃或黃色，并且通常是黃色或橘黃色花卉中的唯一色素。在花卉顏色中起主要作用的類黃酮分子是花色素苷，這種物質(zhì)是花青素，翠雀素，3′-甲花翠素，芍藥色素，錦葵色素和天竺葵色素的糖基化衍生物，并且位于液泡中。不同的花色素苷可以帶來明顯不同的顏色?；ɑ艿念伾€會(huì)受到與無色類黃酮的共同色素沉著。金屬絡(luò)合作用，糖基化，?；谆耙号輕H的影響(Forkmann，1991)。
已經(jīng)完善地建立了類黃酮色素的生物合成途徑(以后稱之為“類黃酮”途徑)，如


圖1所示(Ebel和Hahlbrock，1988;Hahlbrock和Grisebach，1979，WieringanddeVlaming，1984;Schrametal，1984;Stafford，1990)。該途徑中第一個(gè)指定的步驟包括三分子的丙二?；o酶A與一分子的對一香豆酰CoA的縮合反應(yīng)。該反應(yīng)受苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)的催化。此反應(yīng)的產(chǎn)物，2′，4，4′，6′-四羥苯基苯乙烯酮，通常很快被苯基苯乙烯酮黃烷酮異構(gòu)酶(CHI)異構(gòu)化而產(chǎn)生柚配質(zhì)，柚配質(zhì)接著被黃烷酮3-羥化酶(F3H)在中心環(huán)的3位上羥基化而產(chǎn)生二氫莰非醇(DHK)。
二氫莰非醇的B環(huán)可以在3′或同時(shí)在3′和5′位被羥基化而分別產(chǎn)生二氫五羥黃酮(DHQ)和二氫楊梅黃酮(DHM)。在此途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵性酶是類黃酮3′-羥化酶(以后稱之為3′-羥化酶)和類黃酮3′，5′-羥化酶(以后稱之為3′，5′-羥化酶)。3′-羥化酶作用于DHK產(chǎn)生DHQ，并且作用于柚配質(zhì)產(chǎn)生圣草酚。3′，5′-羥化酶是一種廣譜酶，可以催化柚配質(zhì)和DHK的3′和5′位的羥基化，以及圣草酚和DHQ的5′位羥基化(StotzandForkmann，1982)，在這兩種情況分別產(chǎn)生五羥黃烷酮和DHM。B環(huán)的羥基化方式在決定花瓣顏色方面起著重要作用。
在微粒體提取物中類黃酮的3′-羥基化需要NADPH和氧氣以及柚配質(zhì)或DHK的糖苷配基。已對縐葉歐芹細(xì)胞培養(yǎng)物酶進(jìn)行細(xì)致的研究(Hagmann et al.，1983)。由于它受一氧化碳，細(xì)胞色素C和NADP+的抑制，說明這種酶是一種細(xì)胞色素P450-依賴性酶。在玉米中也證實(shí)了這種相似的酶活性(Larson and Bussard，1986)。3′，5′-羥化酶也是細(xì)胞色素P450類的酶。細(xì)胞色素P450酶廣泛存在于自然界中，并且已在脊椎動(dòng)物，昆蟲，酵母，真菌，細(xì)菌和一種植物中進(jìn)行表征。已經(jīng)確定了至少154種細(xì)胞色素P450基因的序列，這些基因歸屬于27個(gè)不同的基因族(Nebertetal，1991)。在一個(gè)族內(nèi)，P450蛋白序列的一致性一般大于40%，而在相同的亞族中序列的一致性大于46%(Nebertetal，1991)。有關(guān)植物細(xì)胞色素P450的資料是有限的。
對植物中與類黃酮途徑有關(guān)的3′或3′，5′-羥化酶活性或其他酶的控制，提供了一種控制花瓣顏色的方法，從而使單一品種表現(xiàn)出廣譜的花色。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)識別和克隆了編碼類黃酮途徑酶如3′，5′-羥化酶的遺傳序列。這些重組序列可以允許對DHK代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，以及調(diào)節(jié)其他底物如DHQ柚配質(zhì)和圣草酚的代謝，從而確定花色素苷的羥化方式，以提供一種控制花瓣顏色的手段。但是，本發(fā)明可以從花卉延伸到水果、蔬菜植物以及例如裝飾植物的葉子。
因此，本發(fā)明的一方面提供了一種核酸分離物，包括一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或其部分分子的編碼序列或它的互補(bǔ)序列。
為了方便，而且只是為了用于縮寫表示，這里所說的“DHK羥化酶”包括作用于一種或幾種下列物質(zhì)DHK，DHQ，柚配質(zhì)，圣草酚的類黃酮途徑羥化酶。
優(yōu)選的DHK羥化酶是3′，5′-羥化酶。但是，用于克隆編碼這種酶的遺傳序列的方法，也可以用于分離編碼如3′-羥化酶的其他遺傳序列。因此，本文所指的3′，5′-羥化酶的分離和克隆應(yīng)當(dāng)包括其他的類黃酮羥化酶如3′-羥化酶。
術(shù)語“核酸分離物”是指處于非自然存在狀態(tài)的遺傳序列。一般地說，這是指從其自然狀態(tài)分離出，或通過在其自然環(huán)境中不必使用的方法而形成。更具體地說，它包括體外形成或保存的核酸分子，重組或合成分子，和異源核酸結(jié)合的核酸。它也可以延伸到與其他核酸序列相關(guān)的至少部分純化之后的自然存在的序列。
本文所說“遺傳序列”是指直接對DHK羥化酶，如，3′，5′-羥化酶的一個(gè)氨基酸序列進(jìn)行編碼或通過堿基互補(bǔ)序列進(jìn)行編碼的核苷酸堿基連續(xù)序列。這種核酸或其互補(bǔ)形式可以編碼全長度的酶，或其衍生物，或其一部分?！把苌铩笔侵赶鄬τ谧匀淮嬖诘拿付缘娜魏螁我换蚨鄠€(gè)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。鑒于此，該核酸包括編碼3′，5′-羥化酶的自然產(chǎn)生的核苷酸序列或包含有相對于所說自然產(chǎn)生的序列而言的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入。本文所指的核酸序列還包括寡聚核苷酸，它可用作基因探針，或者用作能夠調(diào)節(jié)植物內(nèi)相應(yīng)基因表達(dá)的“反意”分子。因此，當(dāng)核酸或其互補(bǔ)形式編碼3′，5′-羥化酶的一部分時(shí)，這種核酸分子可以用作寡聚核苷酸探針、聚合物酶鏈反應(yīng)或各種誘變技術(shù)中的引物。
本發(fā)明中DHK羥化酶尤其是3′，5′-羥化酶的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基的末端融合以及序列內(nèi)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。插入性氨基酸序列變異是指向蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)然通過合適地篩選所得產(chǎn)物也可以進(jìn)行隨意插入。缺失變異特征是從序列中去除掉一個(gè)或多個(gè)氨基酸。取代氨基酸變異是指序列中至少去掉了一個(gè)殘基并且在該位點(diǎn)插入一個(gè)不同的殘基。典型的取代是根據(jù)下表1進(jìn)行的取代
表1用于氨基酸取代的合適殘基原始?xì)埢湫腿〈鶤laSerArgLysAsnGln;HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn;GlnIleLeu;ValLeuIle;ValLysArg;Gln;GluMetLeu;IlePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheValIle;Leu如果3′，5′-羥化酶發(fā)生氨基酸取代，其氨基酸一般用具有類似特性的其他氨基酸取代，如類似的疏水性、親水性、電負(fù)性、大側(cè)鏈等等。典型的氨基酸取代是一個(gè)殘基的取代。氨基酸插入通常是按照大約1-10個(gè)氨基酸殘基的次序插入，而缺失大約是1-20個(gè)殘基。優(yōu)選的缺失或插入是以相鄰的成對進(jìn)行，也就是缺失兩個(gè)殘基或插入兩個(gè)殘基。
可以利用本領(lǐng)域中公知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成(Merrifield，1964)及其類似方法，或通過重組DNA操作法而容易地制備上述氨基酸變異體。在具有已知或部分已知序列的DNA預(yù)定位點(diǎn)進(jìn)行取代突變的技術(shù)是公知的，它包括如，M13誘變。通過對DNA序列進(jìn)行操作產(chǎn)生表現(xiàn)為取代、插入或缺失變異的變異蛋白，在如Sambrooketal(1989)的著作中有詳細(xì)描述。
本發(fā)明中3′，5′-羥化酶的其他代表性重組或合成突變體和衍生物包括取代、缺失和/或加上一個(gè)或多個(gè)與該酶相關(guān)的分子如糖類、脂類和/或蛋白或多肽。
術(shù)語“類似物”和“衍生物”也可延伸到3′，5′-羥化酶的任何功能性化學(xué)等同物，并也可延伸到上述的任何氨基酸衍生物。
本發(fā)明的核酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，單股或雙股和線性或共價(jià)相連的環(huán)狀分子。優(yōu)選的核酸分子是cDNA。本發(fā)明也可延伸到其他的核酸分子，這些分子能在低等，優(yōu)選中等，最好是在高度嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所指的核酸分子雜交。用另一種術(shù)語表達(dá)則是，本發(fā)明延伸至具有圖9或10中的某一核苷酸序列的核酸分子，或者延伸到在核苷酸或氨基酸序列水，上具有至少33%，較好是至少45%，優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選是至少65-70%，甚至最好是大于85%的相似性的一種分子，而且其中該核酸編碼或互補(bǔ)于編碼具有3′，5′-羥化酶活性的酶的序列。但是，應(yīng)當(dāng)注意的是核苷酸或氨基酸序列可以具有低于上述給定的百分率的相似性，并且仍能編碼DHK羥化酶，這種分子由于保留同源區(qū)仍然被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還延伸到寡聚核苷酸引物形式的核酸分子，這種引物能夠在低等，優(yōu)選中等，最好是高度嚴(yán)格條件下與上述的部分核酸分子進(jìn)行雜交。
這里所說的核酸分子可以單獨(dú)存在，或者與一種載體分子最好是表達(dá)載體以結(jié)合形式存在。這種載體分子可在真核和/或原核細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。優(yōu)選地是，這種載體分子或其一部分能夠整合到植物基因組中。該核酸分子還可以含有一個(gè)能夠控制植物細(xì)胞內(nèi)核酸分子表達(dá)的啟動(dòng)子序列?？梢酝ㄟ^許多的方式如通過電擊穿或土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(AgrobacteriumMediatedtransfer)將該核酸分子和啟動(dòng)子導(dǎo)入到細(xì)胞中。
使用來源于牽?；ǖ暮怂嵝蛄锌梢缘湫偷貙?shí)施本發(fā)明，因?yàn)樗砹似褡罘奖愫蛢?yōu)選的材料來源，但是，本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員會(huì)很快地意識到可以從任何的其他來源如其他植物或某種微生物中分離相似的序列。有關(guān)金魚草，馬鞭草和矮牽牛的花以及玉米種子的糊粉層及幼苗中的3′-羥化酶遺傳學(xué)特性是已知的(HellerandForkmann，1988)。在金魚草中基因eos控制3′-羥化酶(ForkmannandStotz，1981)，而在牽牛花(Stotzetal，1985)和玉米糊粉層(LarsonandRussard，1986)中的相似酶分別由Htl和Pr控制。例如，對馬鞭草雜交種的化學(xué)遺傳學(xué)研究表明，在這種植物中花色素苷B環(huán)中3′和5′位的羥化都是由一種基因控制的(Beale，1990)?？蛇M(jìn)行3′，5′-羥化反應(yīng)的酶活性只存在于能產(chǎn)生翠翟素的植物的花卉提取物中(StotzandForkmann，1982)。在翠菊屬(Callistephus)和山黧豆屬(Lathyrus)的花卉提取物中也表現(xiàn)出了在3′和5′位發(fā)生羥化反應(yīng)的NADPH-依賴性微粒體酶活性(Forkmann，1991)。和馬鞭草雜交種一樣，發(fā)現(xiàn)使黃烷酮和二氫黃酮醇發(fā)生3′，5′-羥化反應(yīng)的酶活性只存在于那些花卉中含有3′，4′，5′-羥化類黃酮化合物(或其甲基化衍生物)的植物品種的花卉提取物中。因此，3′，4′，5′-羥化類黃酮的形成顯然依賴于類黃酮3′，5′-羥化酶活性。
已經(jīng)在許多裝飾植物包括翠菊(Callistephus(R))、牽?；?Hf1，Hf2)和馬鞭草(P)中利用不能夠產(chǎn)生翠雀素的相應(yīng)突變體識別出了編碼3′，5′-羥化酶的基團(tuán)。而且，已經(jīng)證實(shí)了各自的酶活性(Forkmann，1991)。這種3′，5′-羥化酶也被認(rèn)為是一種微粒體細(xì)胞色素p450酶(HellerandForkmann，1988)。但是，沒有公開出版物報(bào)道從這些或其他植物種類中克隆出3′，5′-羥化酶基因。
其他能夠產(chǎn)生3′，4′，5′-羥化類黃酮或其衍生物的植物種類包括繡球花屬(Takeda，etal，1985)，翠雀屬(Asenetal，1975)，Lisianthus(Asenetol，1986)，西紅柿(VonWettstein-Knowles，1968)和土豆(HarborneandSimmonds，1962)。這些或其他能夠產(chǎn)生3′，4′，5′-羥化類黃酮的植物品種也是分離3′，5′-羥化酶基因的合適來源。不管基來源如何，所有這些直接或間接編碼類黃酮途徑酶(如，3′，5′-羥化酶)的核酸序列都屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
同樣，本文所描述的基因克隆方法也可以用于從其他產(chǎn)生3′，4′，5′-羥化類黃酮的植物中分離3′，5′-羥化酶基因?？梢杂帽疚墓_的克隆和寡聚核苷酸以相同的技術(shù)檢測、分離和克隆相似的遺傳序列，只是對實(shí)驗(yàn)步驟需要進(jìn)行微小的修改。所有這些小的變動(dòng)都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這些酶如3′，5′-羥化酶的其他合適來源的例子包括，但不局限于，馬鞭草，飛燕草，葡萄，鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭和茄子。
根據(jù)本發(fā)明，可以將編碼一種DHK羥化酶如3′，5′-羥化酶的核酸序列導(dǎo)入到一種轉(zhuǎn)基因植物中并進(jìn)行表達(dá)，從而提供了一種轉(zhuǎn)化DHK和/或其他合適的底物的手段，如果它是在植物細(xì)胞內(nèi)合成的，最終將轉(zhuǎn)化成花色素如翠雀素、3′-甲花翠素或錦葵色素的花色素苷衍生物。這些花色素苷的產(chǎn)生將帶來各種深淺不同的蘭色或近蘭色。核酸在植物內(nèi)的表達(dá)可以是結(jié)構(gòu)型的，誘導(dǎo)型的或發(fā)育中進(jìn)行的。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種制備能夠表達(dá)重組DHK羥化酶或其活性突變體或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所說的方法包括向一種合適植物的細(xì)胞中導(dǎo)入一種核酸分子，該分子包含有一種編碼所說DHK羥化酶的核苷酸序列，這種方法的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)當(dāng)允許最終表達(dá)所說的核酸分子，從細(xì)胞中再產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物并且使所說的轉(zhuǎn)基因植物生長一段時(shí)間，這種條件以能夠允許核酸的表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種產(chǎn)生顯示有變化的花簇特性的轉(zhuǎn)基因開花植物的方法，所說的方法包括在允許最終表達(dá)所說的核酸序列的條件下，向一種合適的植物細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的核酸序列，從細(xì)胞中再產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，并使所說的轉(zhuǎn)基因植物生長一段時(shí)間，而且該條件足以允許將該核酸序列表達(dá)為DHK羥化酶。
優(yōu)選的DHK羥化酶是3′，5′-羥化酶，是在發(fā)育中可被調(diào)節(jié)的，變化的花簇包括依據(jù)受體植物的生理狀況而產(chǎn)生蘭色或紅色花卉或其他濃淡的顏色?！昂线m的植物”是指一種能夠產(chǎn)生適用于3′，5′-羥化酶的底物植物，并且該植物具有合適的生理特性和產(chǎn)生所期望顏色而需要的基因型。這種植物可以包括但不局限玫瑰，矮牽?；ǎ瘢栈ê头侵蘧?。在特定植物種類中最好選擇一種“高pH系”，它被定義為一種具有比平均值較高的花瓣液泡pH。重組3′，5′-羥化酶或其突變體和衍生物的來源如本文前面所述，并包括矮牽?；āⅠR鞭草、飛燕草、葡萄、鳶尾、小蒼蘭、繡球花、仙客來、馬鈴薯或茄子來源的酶。
本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員很快會(huì)意識到適用于該方法的改動(dòng)方案，如增加或減少自然存在于靶植物中的酶的表達(dá)。這將會(huì)產(chǎn)生不同深淺濃淡的顏色如不同濃淡的蘭色或紅色。
為了降低靶酶，如3′，5′-羥化酶的活性，可以將編碼這種酶的核酸序列或其各個(gè)部分以反義方向使用。雖然目的并不是為了將本發(fā)明局限于任何特定理論，不過這種反意核酸序列有可能與自然產(chǎn)生的編碼該酶的全部mRNA或其部分形成一個(gè)二倍體，從而防止mRNA翻譯成活性酶?；蛘?，也可以使用核糖酶使靶核酸序列失活。
因此，本發(fā)明延伸到一種產(chǎn)生能夠表達(dá)重組二氫莰非醇(DHK)羥化酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，或者該植物能控制某種核酸的轉(zhuǎn)錄，這種核酸基本上與可被翻譯成DHK羥化酶的全部或部分mRNA分子互補(bǔ)，所說的方法包括在允許最終表達(dá)所說的核酸分離物的條件下，向一種合適的植物中導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求1或6的核酸分離物，從細(xì)胞中再產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物，并使所說的轉(zhuǎn)基因植物生長一段時(shí)間，而且該條件足以允許表達(dá)該核酸分離物。在這個(gè)方案中，合適的受體植物延伸到特別是鳶尾、郁金香，百合，Lisianthus，小蒼蘭，飛燕草，檸檬，天竺葵。
因此，上述制備轉(zhuǎn)基因植物的方法延伸到將一種基因或編碼一個(gè)反意義mRNA的DNA片段或寡聚核苷酸導(dǎo)入到整個(gè)或一部分或某區(qū)域的編碼或互補(bǔ)于編碼3′，5′-羥化酶序列的一個(gè)核苷酸序列。
因此，本發(fā)明延伸到含有全部或部分本發(fā)明核酸序列，或其反義形式和/或其任何同源或相關(guān)形式的全部轉(zhuǎn)基因植物，尤其是那些表現(xiàn)有不同花朵特性的轉(zhuǎn)基因植物。因此，該轉(zhuǎn)基因植物含有一種穩(wěn)定導(dǎo)入的核酸分子，該分子包含有一種編碼或互補(bǔ)于編碼DHK羥化酶的序列的核苷酸序列，該植物尤其是那些攜帶有上述的導(dǎo)入的核酸分子的高pH植物系。本發(fā)明還延伸到這些轉(zhuǎn)基因植物的種子，這些種子，尤其是如果是彩色的，可以用作植物的特有標(biāo)志。
本發(fā)明的另一方面是指重組形式的DHK羥化酶，尤其是重組3′，5′-羥化酶。這種重組形式的酶將為制備一種如活性更強(qiáng)的酶的研究提供材料來源，而且可用于發(fā)展體外系統(tǒng)以生產(chǎn)顏料化合物。
本發(fā)明的另一方面是設(shè)計(jì)一種克隆某種核酸分子的方法，該分子包含有一種來自于植物的細(xì)胞色素p450分子或其類似分子的核苷酸序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列，所說的方法包括使用一種或幾種寡聚核苷酸引物，通過聚合物酶鏈反應(yīng)，對來源于所說植物細(xì)胞的某種合適的核酸分子制備物中的細(xì)胞色素p450核苷酸序列或互補(bǔ)序列進(jìn)行擴(kuò)增，所說的引物具有一種來源于已知微粒體細(xì)胞色素p450分子的一種或幾種共同序列的核苷酸序列。
在相關(guān)實(shí)施例中，克隆細(xì)胞色素p450核酸分子或其互補(bǔ)序列的方法包括從一種合適的cDNA庫中選擇一種能夠與一種或幾種寡聚核苷酸引物雜交的克隆，所說的引物與已知細(xì)胞色素p450分子的一種或幾種共同序列相對應(yīng)。
優(yōu)選的一種共同序列是來源于細(xì)胞色素p450分子的血紅素結(jié)合區(qū)(hacm-bindingdomain)，更優(yōu)選的是F(G，S)XGXRXCXG(其中X是任何氨基酸)或者是PCFACRRICPG。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所要克隆的核苷酸序列可以編碼或互補(bǔ)于一種編碼DHK羥化酶，尤其是3′，5′-羥化酶的序列。甚至更優(yōu)選的是，該3′，5′-羥化酶如前所述，尤其是具有一種由圖9或10中描述的氨基酸序列，或基本上由圖中的核苷酸序列編碼的氨基酸或者與上述定義的酶具有類似性。
本發(fā)明將通過下面的非限制性圖表和實(shí)施例作進(jìn)一步描述。
圖1(A)和(B)圖解說明類黃酮色素的生物合成途徑。該代謝途徑第一部分所涉及的酶類代表的含義如下PAL＝苯丙氨酸氨裂解酶;C4H＝肉桂酸鹽4-羥化酶;4CL＝4-coumarateCoA裂解酶;CHS＝苯基苯乙烯酮合成酶;CHI＝苯基苯乙烯酮黃烷酮異構(gòu)酶;F3H＝黃烷酮3-羥化酶;DFR＝二氫黃酮醇4-還原酶;UFGT＝UDP-葡萄糖類黃酮-3-氧-糖基轉(zhuǎn)移酶。代謝途徑后面步驟相當(dāng)于在P.hybrida花中發(fā)生的轉(zhuǎn)化，包括1＝向花色素-3-葡糖苷和翠雀素-3-葡糖苷的葡糖基殘基上加上一個(gè)鼠李糖的加成作用;2＝乙?；饔煤?-氧-糖基化作用;3＝3′甲基化作用;4＝5′甲基化作用;5＝3′5′甲基化作用。
圖2(A)顯示P.hybrida cv V23(Hf1/Hf1，Hf2/Hf2)的花瓣提取物中3′，5′-羥化酶活性以及P.hybrida cv R51(hf1/hf1，hf2/.hf2)中3′，5′-羥化酶活性的喪失。通過3H-4′，5，7-三羥黃烷酮向3′-和3′，5′-羥化衍生物圣草酚及四羥黃烷酮的轉(zhuǎn)變來檢測3′，5′-羥化酶的活性。圖的左手側(cè)所示為底物4′，5，7-三羥黃烷酮及其3′羥化酶反應(yīng)產(chǎn)物圣草酚和3′，5′羥化酶反應(yīng)產(chǎn)物四羥黃烷酮的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)。底物及其羥化產(chǎn)物在TLC平板上的位置示于圖的右手側(cè)，該圖從左至右顯示了由P.hybridacvV23和P.hybridacvR51花的花瓣提取物產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物和當(dāng)從反應(yīng)混合物中省去NADPH時(shí)柚苷配基不發(fā)生羥基化的對照物的放射自顯影圖。
圖2(B)顯示在不同發(fā)育階段的P.hybridacvOldGloryBlue(OGB)花的花瓣提取物中的3′，5′-羥化酶活性。從左至右的TLC平板放射自顯影圖表示(1)第一階段花[花蕾未著色，閉合(長度＜25mm)]4′，5，7-三羥黃烷酮向3′，5′-羥化衍生物四羥黃烷酮進(jìn)行有限的轉(zhuǎn)化;(2)第二階段花[花蕾已著色，閉合(長度為25-35mm)]增加了向羥黃烷酮的轉(zhuǎn)化，表明存在較高的3′，5′-羥化酶水平;(3)第3階段花[花蕾深紫色，并出現(xiàn)花冠(長度＞35mm)]最大3′，5′-羥化酶活性;(4)第4階段花[花蕾開放，深紫色，花藥開裂前(長度＞50mm)]最大3′，5′-羥化酶活性;(5)第5階段花[花朵完全開放。全部花藥開裂]不存在可檢測的3′，5′-羥化酶活性水平。
圖3(A)圖解說明一種編碼細(xì)胞色素P450的mRNA分子。深色區(qū)表示編碼血紅素結(jié)合區(qū)序列的相對位置。用單個(gè)字母代碼表明上述結(jié)合部位最保守區(qū)域的共同氨基酸序列。那些百分之百存在于位于SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫的細(xì)胞色素P450序列中的氨基酸被框起來，X表示具有低水平序列保守性的位置。
圖3(B)顯示用于PCR擴(kuò)增來自cDNA庫＃1的細(xì)胞色素P450分子pCGP450和pCGP454的寡核苷酸的位置。寡核苷酸1和3包括的順序位于保守的血紅素結(jié)合區(qū)，而寡核苷酸2和4分別對應(yīng)于pBluescript(stratagene)-20和反向引物序列。寡核苷酸1和2用來合成插入pCGP450的cDNA;寡核苷酸3和4用于合成插入pCGP454的cDNA。對所延伸的cDNA分子的表示與圖3A一致，載體順序用淺色區(qū)表示。
圖4(A)圖解說明用于探測cDNA庫＃1以鑒別包括pCGP174和pCGP175的細(xì)胞色素P450同系物的DNA片段。P450得到的細(xì)胞色素P，450cDNA克隆，帶有由深色盒表示的血紅素結(jié)合區(qū)(Haem);片段1以pCGP142DNA為模板，用寡核苷酸5和6經(jīng)PCR得到的一段900bp片段;片段2從pCGP147的SalI-EcoRI酶解片段中分離到的1.3kb片段;片段3以pCGP168 DNA為模板，用寡核苷酸4和7經(jīng)PCR得到的一段750bp片段;片段4從pCGP160的PstI-EcoRV酶解片段中分離到的一個(gè)670bp片段;片段5以pCGP454DNA為模板，用寡核苷酸3和4經(jīng)PCR提到的一段150bp片段。所有的純化片段都按下文材料與方法部分所述用32P-dCTP進(jìn)行標(biāo)記。
圖4(B)-(H)顯示來自(ⅰ)pCGP142，(ⅱ)pCGP147，(ⅲ)pCGP158，(ⅳ)pCGP160和(ⅴ)pCGP454的cDNA插入物的部分核苷酸順序以及相應(yīng)的推定的氨基酸轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物。用以探測cDNA庫井1以分離pCGP174和pCGP175的區(qū)域已用帶箭頭的直線畫出。
圖5(A)和(B)分別圖示質(zhì)粒pCGP174和pCGP175。cDNA插入物以空心盒表示，其中帶有以深色區(qū)顯示的編碼推定的血紅素結(jié)合部位的區(qū)域。位于兩個(gè)cDNA插入物的5′端都有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，在3′端有一個(gè)XhoI位點(diǎn)。
圖6(A)是用pCGP174 cDNA插入物的3′區(qū)探測RNA印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有從下列矮牽牛屬植物組織中分離的總RNA的20μg樣本1-5取自花的5個(gè)不同發(fā)育階段(見材料與方法部分所述)花的OGB瓣片組織;T取自第3-4階段花的OGB合瓣花冠組織;L取自6周老OGB幼苗的葉組織;IL取自6周老OGB幼苗并用葡萄糖/強(qiáng)光處理過的葉組織;V23取自第3-4階段花的V23瓣片組織;R51取自第3-4階段花的R51花冠組織;VR取自V23×R51F1雜種第3-4階段花的花瓣瓣片組織Sw63取自Sw63的第3-4階段花的花瓣瓣片組織;Th7取自Th7的第3-4階段花的花瓣瓣片組織。
花的花瓣瓣片組織。
圖6(B)表示V23×R51(V/R)F2植株的RFLP分析放射自顯影圖。用pCGP174的3′區(qū)探測XbaI酶解的基因組DNA。在那些于花(+)的合瓣花冠組織中具有3′，5′-羥化酶活性的所有F2植株中都檢測到了能與探針進(jìn)行堅(jiān)固雜交的V23片段。對于不同植株都標(biāo)明了有強(qiáng)雜交帶的RFLP命名(RFLR＃1)。V類似V23的RFLP，R類似R51的RFLP，H雜合子(VR)。
圖7(A)是用pCGP175cDNA插入物的3′區(qū)探測RNA印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有從下列組織中分離到的總RNA的20μg樣本1-5取自花的5個(gè)不同發(fā)育階段(見材料與方法部分所述)花的OGB瓣片組織;T取自第3-4階段花的合瓣花冠組織L取自6周齡OGB秧苗的葉組織;IL取自6周齡OGB秧苗并經(jīng)葡萄糖/強(qiáng)光處理過的葉組織;V23取自第3-4階段花的V23瓣片組織;R51取自第3-4階段花的R51花冠組織;VR取自V23×R51F1雜種的第3-4階段花的花瓣瓣片組織;Sw63取自Sw63的第3-4階段花的花瓣瓣片組織Th7取自Th7的第3-4階段花的花瓣瓣片組織。
圖7(B)表示V23×R51(V/R)F2植株的RFLP分析的放射自顯影圖。用pCGP175的3′區(qū)探測XbaI酶解的基因組DNA。用pCGP175探針獲得的RFLP命名與用Chi-A探針?biāo)o定的PO命名一致。VV23樣RFLP;RR51樣RFLP;H雜合子(VR)RFLP。
圖8圖示pCGP602的限制性酶圖譜。cDNA插入物的部分長度用帶有立線端(與箭頭相對)的粗線表示。這些片段被亞克隆到M13-mp18和mp19中，并用所示的寡核苷酸引物順序進(jìn)行測序以獲得重迭順序的信息。從每一亞克隆部分獲得的有關(guān)順序長度和方向的信息用帶有半個(gè)箭頭的直線表示。S1＝引物序列1;S2＝引物順序2;S3＝引物順序3;ATG表示甲硫氨酸起始密碼子，用堿基對表示的克隆的總長度也同時(shí)示出。
圖9(A)-(D)表示pCGP176和pCGP602中cDNA插入物的核苷酸順序的推定的氨基酸順序。得自pCGP602的插入物包括所示的完整順序。pCGP176插入物的5′端用箭頭表示。
圖10(A)-(C)表示pCGP175中cDNA插入物的核苷酸順序和推測的氨基酸順序。
圖11圖解pCGP618的構(gòu)建。pCGP618的構(gòu)建是通過將pCGP175cDNA插入物以有意義方向克隆到表達(dá)載體pYGA22m中酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(PGPD)后面實(shí)現(xiàn)的。來自pCGP175的cDNA插入物的EcoRI-KpnI片段與用EcoRI/KpnI酶解pYGA22m所得的大片段進(jìn)行連接。E＝EcoRI，H＝HindⅢ，K＝KpnI，X＝XhoI，IR＝2μm質(zhì)粒的反相重復(fù)，Trpl＝Trpl基因，Ap＝氨芐青霉素抗性標(biāo)記。
圖12(A)顯示以3H-4′，5，7-三羥黃烷酮為底物進(jìn)行的酵母提取物中3′，5′-羥化酶測定。放射自顯影圖反映了用質(zhì)粒pCGP618轉(zhuǎn)化的酵母的提取物中3H-4′，5，7三羥黃烷酮向其3′，5′-羥化衍生物四羥黃烷酮的轉(zhuǎn)化(1和2)。在未被轉(zhuǎn)化的酵母(C)中未檢測到3′，5′-羥化酶活性。用OGB3′，5′-羥化酶進(jìn)行的4′，5，7-三羥黃烷酮轉(zhuǎn)化為四羥黃烷酮也示于圖中(OGB C)。
圖12(B)顯示以3H-二氫五羥黃酮作底物進(jìn)行的酵母提取物中3′，5′-羥化酶測定。放射自顯影圖反映了用質(zhì)粒pCGP618轉(zhuǎn)化的酵母的提取物中3H-二氫五羥黃酮(DHQ)向3H-二氫六羥黃酮(DHM)的轉(zhuǎn)化(1和2)。在未被轉(zhuǎn)化的酵母(C)中未檢測到3′，5′-羥化酶活性。用OGB3′，5′-羥化酶進(jìn)行的DHQ向DHM的轉(zhuǎn)化也示于圖中(OGB C)。
圖13顯示以3H-4′，5，7-三羥黃烷酮作底物進(jìn)行的酵母提取物3′，5′-羥化酶測定，放射自顯影圖反映出用質(zhì)粒pCGP618和pCGP620轉(zhuǎn)化的酵母的提取物中3H-4′，5，7-三羥黃烷酮向其3′，5′-羥化衍生物四羥黃烷酮的轉(zhuǎn)化(分別見1和2)。從pCGP620提取物獲得的反應(yīng)產(chǎn)物還包括3′-羥化圣草酚以及一些初始4′，5，7-三羥黃烷酮底物，表明底物向其3′，5′-羥化終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是不完全的。在未被轉(zhuǎn)化的酵母(C)中未檢測到3′，5′-羥化酶活性。
圖14圖解說明質(zhì)粒pCGP90。得自pCGP602的cDNA插入物以有意義方向被克隆到如圖所示的表達(dá)載體pCGP293的Mac啟動(dòng)子后面。
圖15顯示矮牽牛屬植物花瓣提取物中3′，5′-羥化酶測定。放射自顯影圖表明在Skr4×Sw63的花瓣瓣片組織(L)中存在低3′，5′-羥化酶活性水平(3H-4′，5，7-三羥黃烷酮向3H-四羥黃烷酮的轉(zhuǎn)化)。在兩株Skr4×Sw63/pCGP90轉(zhuǎn)基因植株(T/G1602和T/G1603)的瓣片組織(L)中檢測到明顯較高水平的酶活性。在非轉(zhuǎn)基因Skr4×Sw63雜交株或兩個(gè)pCGP90轉(zhuǎn)基因植株的花瓣合瓣花冠提取物中均未測到3′，5′-羥化酶活性。通過OGB花瓣組織的瓣片(L)和合瓣花冠(T)提取物進(jìn)行的4′，5，7-三羥黃烷酮向四羥黃烷酮的轉(zhuǎn)化也示于圖中。
圖16是照相表示用32P標(biāo)記的Hf1 cDNA探測RNA印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有從下列植物分離到的總RNA的20μg樣本(1)P.hybrida cv.OGB花瓣;(2)三色堇花瓣;(3)土豆莖;(4)茄子表皮;(5)Nicotianaalata花;(6)藿香花。用于檢測A和B的探針從一個(gè)660bpBalIDNA片段衍生而來。一個(gè)1.4kb的EcoRI/HindⅢ片段用于檢測C。所用的漂洗條件為(A)6×SSC，50℃;(B)2×SSC，50℃;(C)0.2×SSC，65℃。
圖17是照相表示用32P標(biāo)記的Hf1 cDNA探測的Southern印跡的放射自顯影圖。每一泳道含有10μg用EcoRI酶解的DNA。該DNA樣本分離自(1)茄子，(2)荷蘭鳶尾，(3)土豆，(4)紫羅蘭和(5)銀蓮花屬植物。漂選條件為(A)6×SSC，50℃;(B)2×SSC，65℃。
實(shí)施例1.材料與方法化學(xué)物質(zhì)、酶類和放射性同位素圣草酚和二氫五羥黃酮得自Carl Roth KG，.4′，5，7-三羥黃烷酮購自Sigma。二氫六羥黃酮是根據(jù)Vercruysse的方法(Vercruysse et al，1985)從六羥黃酮(Extra Synthese，F(xiàn)rance)經(jīng)化學(xué)合成而得。[3H]-4′，5，7-三羥黃烷酮(5.7Ci/mmole)和[3H]-二氫五羥黃酮(12.4Ci/mmole)得自Amersham。所用的酶類均為商售來源，并按制造商的說明使用。
細(xì)菌菌株所用的E.Coli菌株為DH5α supE44，△(lacZYA-ArgF)U169，φ801acZ△M15，hsdR17(r-k，m+k)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1.deoR.(Hanahan，1983 and BRL，1986).
XLl-Blue supE44，hsdR17(r-k，m+k)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，lac-，[F′ proAB，lacIq，lacZ△M15，Tn10(tetr)](Bullock et al，1987).
PLK-F′ recA，hsdR17(r-k，m+k)，mcrA-，mcrB+，lac+，supE44，galK2，galT22，metBl，[F′ proAB，lacIq，lacZ△M15，Tn10(tetr)](Stratagene).
棄掉進(jìn)攻器官的根癌土壤桿菌菌株AGLO(Lazoetal，1991)得自R.Ludwig(DepartmentofBiology，UniversityofCalifornia，SantaCruz)。
克隆載體pBluescript和pBluescribe得自Stratagene。
E.Coli和根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化根據(jù)Inoue(Inoueetal，1990)的方法轉(zhuǎn)化E.coli株DH5α細(xì)胞。
將AGLO細(xì)胞接種于50ml MG/L(GarfinKel and Nester，1980)培養(yǎng)基中，于28℃振蕩生長16小時(shí)制得感受態(tài)AGLO細(xì)胞。加5μg質(zhì)粒pCGP90(
圖14)DNA到100μl感受態(tài)AGLO細(xì)胞中，使質(zhì)粒pCGP90導(dǎo)入根癌土壤桿菌菌株AGLO中。然后獲取上述所得細(xì)胞的團(tuán)丸，并懸浮于0.5ml含85%(V/V)100mM CaCl2/15%(V/V)甘油的溶液中。將DNA-土壤桿菌混合物置液氮中冷凍2分鐘，再置于37℃5分鐘使之解凍。將DNA/細(xì)菌混合物置于冰上10分鐘。然后加1ml MG/L培養(yǎng)基與細(xì)胞混合，再于28℃搖育16小時(shí)。用含100μg/ml慶大霉素的MG/L瓊脂板篩選攜帶pCGP90的根癌土壤桿菌細(xì)胞。對從慶大霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離到的DNA進(jìn)行Southern印跡分析來證實(shí)pCGP90的存在。
所用的矮牽牛屬植物雜交變種列于表2中。
表2植物材料植物變種特性來源/出處參考Old Glory Blue(OGB) F1Hybrid Ball Seed,USAV30An1,An2,An3,An4,An6,Koes et al.(1986)An8,An9,An10,An11,Ph1Ph2,Ph3,Ph4,Ph5,Hf1,Hf2,Ht1,Ht2,Rt,Mt1,Mt2,mf1,po,GfV23An1,An2,An3,An4,An6,Wallroth et al.(1986)An8,An9,An10,ph1,Hf1,Doodeman et al.(1984)Hf2,ht1,Rt,Po,B1,F1R51An1,An2,An3,An4,An6,Wallroth et al.(1986)An8,An9,An10,An11,van Tunen et al.(1990)Ph1,hf1,hf2,Ht1,rt,doodeman et al.(1984)Po,b1,f1Sw63An1,An2,An3,An4,An6,I.N.R.A.,Dijon,Cedex,An8,An9,An10,An11,FrancePh1,Ph2,Ph5,hf1,hf2,
ht1,ht2,rt,po,mf1,f1,GfTh7An1,An2,An3,An4,An6,"""An9,An10,An11,Hf1,Hf2,Ht1,Ht2,Ph1,Ph2,Ph5,Rt,po,mf1,mf2,Gf,F1Skr4An1,An2,An3,An4,An6,"""An11,hf1,hf2,ht1,Ph1,Ph2,Ph5,rt,Po,Mf1,Mf2,f1Skr4×Sw63 Skr4×Sw63 F1HybridRw14An1,An2,An4,Ph1,phz,I.N.R.A.,Dijon,CedexPh5,hf1,hf2,Ht1,Rt,Po,FranceBl,Lg1,Lu1,Vs1,Vs3,Vs5,la,Yg1,ws,Gf,Mt1,Mf2,f1Rp57An1,An2,An4,Ph1,ph2,"""Ph5,hf1,hf2,Ht1,Rt,Po,Mt,Mf,fl,Gf,Bl,Lg1,Lu1,Vs1,Vs3,Vs5,Yg1,Ws.
Rp57×Rw14 Rp57×Rw14 F1Hybrid
植物在特定生長室中于22-26℃生長，每天以光強(qiáng)10，000勒光照14小時(shí)，在如下所定義的發(fā)育階段采集OGB花第1階段花蕾未著色，閉合(長度＜25mm)。
第2階段花蕾著色，閉合(長度為25-35mm)。
第3階段花蕾深紫色，并出現(xiàn)花冠(長度＞35mm)。
第4階段深紫色開放的花朵，花藥開裂前期(長度＞50mm)。
第5階段花朵完全開放，伴有全部花藥開裂。
在花藥開裂前于色素累積達(dá)最大量的生長階段收集表2所述的其它變種的花。
用于測定3′，5′-羥化酶活性的植物提取物的制備用2-5倍體積的冰冷提取緩沖液(100mM磷酸鉀(pH7.5)，1mMEDTA，0.25M蔗糖，0.25M甘露糖醇，0.1%(V/V)BSA，100nM抑肽素，100nM亮肽素，0.1mg/mlPMSF，20mM2-巰基乙醇和10mg/mlpolyclarAT)將植物組織均化。所得組織勻漿用JA20轉(zhuǎn)頭(Beckman)以10，000rpm于4℃離心10分鐘，用得到的上清液的等份試樣進(jìn)行3′，5′-羥化酶活性測定。
3′，5′-羥化酶測定用修改的Stotz和Forkmann(1982)方法檢測3′，5′-羥化酶酶活性，進(jìn)行測定的反應(yīng)混合物一般含有100μl植物提取物、5μl溶于測定緩沖液(100mM磷酸鉀(pH8.0)，1mM EDTA和20mM2-巰基乙醇)中的50mM NADPH，10μCi[3H]4′，5，7-三羥黃烷酮或5μCi[3H]二氫五羥黃酮，并用測定緩沖液將反應(yīng)的終體積補(bǔ)足至210μl。于23℃培育2-16小時(shí)之后，用0.5ml乙酸乙酯抽提反應(yīng)混合物。于真空中干燥乙酸乙酯相，然后再重懸于10μl乙酸乙酯中。將氚化的類黃酮分子用氯仿∶乙酸∶水(10∶9∶1，V/V)溶劑系統(tǒng)分散于纖維素薄層板(MerchArt5577，Germany)上。在色譜分析完畢之后，用溶于二乙基乙醚中7%(V/V)的2，5-二苯基噁唑向TLC板噴灑。用放射自顯影法將反應(yīng)產(chǎn)物定位，通過與在反應(yīng)產(chǎn)物旁平行實(shí)驗(yàn)的非放射性4′，5，7-三羥黃烷酮、圣草酚、二氫五羥黃酮和二氫六羥黃酮標(biāo)準(zhǔn)物相比較對反應(yīng)混合物進(jìn)行鑒別，并在紫外光下觀察。
葡萄糖/強(qiáng)光誘導(dǎo)植物葉中翠雀素合成收集P.hybrida cv.OGB的葉子，并在無菌水中切成1cm2的葉片。將葉片漂浮于2%(M/V)的葡萄糖溶液中，并于光強(qiáng)24，000勒下暴露96小時(shí)。
＃1cDNA庫的構(gòu)建取20g第3-4階段OGB花的瓣片于100ml含10mM釩核糖核酸復(fù)合物的PEB(200mM 7ris-HCl(pH8.6)，60mM kCl，30mM MgCl2，25mM EGTA)中均化。將勻漿通過無菌Miracloth(Calbiochem)過濾除去細(xì)胞碎片。濾液鋪于Ultra-ClearTMQuick-SealTM(Beckman)離心管中含25%(W/V)蔗糖，20單位lnhibit Ace(5-Prime 3-Prime)的6ml PEM和含50%(W/V)蔗糖、250單位lnhibit Ace的6ml PEM 形成的梯度密度頂部。上述離心管用70Ti轉(zhuǎn)頭以26，000rpm離心3.5小時(shí)。從25%(W/V)蔗糖/50%(W/V)蔗糖界面收集膜結(jié)合多核糖體，并加入4M異硫氰酸胍溶液。根據(jù)Turpen和Griffith(1986)描述的方法通過-5.7M CsCl緩沖物造丸，從變性的多核糖體中分離RNA。
應(yīng)用Uni-ZAPTMXR載體試劑盒(Stratagene)以25μg多核糖體 RNA作模板在λZAP中構(gòu)建定向的cDNA庫。含250，000空斑形成單位(pfu)的初級庫通過在NZY平板(Sambrook et al，1989)上過夜生長進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)Sambrook等人所述方法(1989)用PSB(100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl(pH7.5)，0.01%(W/V)明膠)洗脫擴(kuò)增的空斑材料。
＃2cDNA庫的構(gòu)建用Turpen和Griffith的方法(1986)從P.hyhrida cv，OGB第3-4階段花的花瓣組織中分離總RNA。通過三輪oligo-dT纖維素色譜法從總RNA中篩選poly(A)+RNA(Aviv and Leder，1972)。
在20μl含1×SuperscriptTM反應(yīng)緩沖液、10mM二硫蘇糖醇，500μMdATP、500μMdGTP、500μMdTTP、500μM5-甲基-dCTP、0.75μg寡核苷酸＃8和2μl SuperscriptTM反轉(zhuǎn)錄酶(BRL)的溶液中加入2ugpoly(A)+RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)混合物于37℃溫育50分鐘，于44℃溫育10分鐘，然后置于冰上。
第二部分反應(yīng)混合物140μl加入到第一部分反應(yīng)物中。前者由21mM Tris-HCl，104mM kCl、5.3mM MgCl2，171μM β-NAD，11.4mM(NH4)2So4，214μM dATP、642μM dCTP，214μM dGTP，214μMdTTP，4mM DTT，10μCi32P-dCTP(3000Ci/mMole)和15單位E.coliDNA連接酶，40單位DNA聚合酶(Boehringer)和0.8單位RNAseH組成。所得的終混合物于16℃溫育150分鐘。為了形成雙鏈cDNA鈍端，加入10單位T4DNA聚合酶，反應(yīng)在16℃繼續(xù)進(jìn)行15分鐘。中止反應(yīng)，經(jīng)酚/氯仿抽提，繼而氯仿抽提和乙醇沉淀以純化cDNA。
根據(jù)制造商說明的條件使cDNA與EcoRI接頭(Promega)連接，然后激酶處理。加熱(70℃，20分鐘)使酶變性，經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化DNA。按照制造商說明的條件在100ul反應(yīng)體積中用50單位XhoI(Boehringer)酶解cDNA。熱滅活酶(70℃，20分鐘)，將混合物通過已經(jīng)STE緩沖液(Sambrooketal，1989)平衡的S400旋轉(zhuǎn)柱(Phamacia)。洗脫液用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。在4℃微離心30分鐘后，用70%(V/V)乙醇沖洗cDNA丸，空氣干燥，然后重懸于10μlTE緩沖液中(10mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA)。
用NA-45膜(Schleicher和Schuell)從已通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳的7.5ul樣本中分離分子太小范圍在1.3～2.5kb之間的cDNA。
在5ul含50mM Tris-HCl(pH7.0)，10mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，1mM ATP和2單位T4DNA連接酶的反應(yīng)緩沖液中用經(jīng)過1ug λZAPⅡ EcoRI/XhoI/CIAP處理的載體(Stratagene)連接已按分子大小分離的cDNA。反應(yīng)在4℃下進(jìn)行2天。
將反應(yīng)物置室溫2小時(shí)后，連接反應(yīng)混合物用Packagene系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行包裝。重組子的總數(shù)為270，000pfu。
150，000pfu量的被包裝的cDNA在轉(zhuǎn)染PLK-F′細(xì)胞后以每15cm直徑平板含10，000pfu的濃度置于平板上。平板于37℃培育8小時(shí)，然后于4℃過夜貯存。復(fù)制物置于Colony/Plaque ScreenTM濾膜上，按制造商的說明進(jìn)行處理。
寡核苷酸的合成根據(jù)制造商提供的方法用AppliedBiosystemsPCR-MateDNA合成儀合成寡核苷酸。所合成的寡核苷酸5′-3′順序?yàn)楣押塑账?GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG寡核苷酸2GGATGACTCAGTAAAACGACGGCCAGT寡核苷酸3CCIGG(A/G)CAIATIC(G/T)(C/T)(C/T)TICCIGCICC(A/G)AAIGG
寡核苷酸4GGATGACTCAAACAGCTATGACCATG寡核苷酸5GTTCAATTCGGAATGATG寡核苷酸6GCTGCACTTAATCCATAT寡核苷酸8GAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT寡核苷酸9ATGTCTCCTCCAGTG寡核苷酸10CTAGACTCCAATCAC寡核苷酸2和4包括GCN4接合位點(diǎn)(在其下畫線表示)，已證明該位點(diǎn)能便利于雙鏈的PCR產(chǎn)物的富積(Lewandkemp，1989)。
寡核苷酸3的命名依據(jù)如下從推測的鱷梨樹細(xì)胞色素P450的血紅素結(jié)合區(qū)得到的氨基酸順序(Bozaketal，1990)和由兩個(gè)矮牽牛屬植物細(xì)胞色素P450同系物pCGP142和pCGP147編碼的相應(yīng)順序的排列為鱷梨樹PFGAGRRGCPGpCGP142PFGAGKRICPGpCGP147PFGSGRRICPG因此，三種植物細(xì)胞色素P450的血紅素結(jié)合區(qū)的共同氨基酸順序可以看成是PFGA(S)GR(K) RI(G)CPG所以，推測出的能編碼存在于三種細(xì)胞色素P450分子的血紅素結(jié)合區(qū)的氨基酸的核苷酸順序有可能的排列為5'-CCX TTT GGX GCX GGX AGX CGX ATX TGT CCX GGX-3'CAGCAAGGCTX表示所有4種核苷酸(A，C，T和G)都能存在的核苷酸位置。寡核苷酸3被設(shè)計(jì)成補(bǔ)充源于三種植物細(xì)胞色素P450的共同順序的一部分順序。當(dāng)堿基簡并性大于3時(shí)，主要存在的是脫氧次黃苷(Ⅰ)。所得的寡核苷酸順序如上所示。
PCR反應(yīng)根據(jù)制造商描述的方法用輔助性噬菌體R408(Stratagene)切割含有從擴(kuò)增的λZAP＃1cDNA庫得到的矮牽牛屬植物cDNA插入物的pBluescript質(zhì)粒噬菌體。用質(zhì)粒噬菌體混合物轉(zhuǎn)染E.coliXL1-Blue，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板上生長出250，000個(gè)菌落。將細(xì)胞垂懸于LB中(Sambrooketal.，1989)，用堿裂解法(Sambrooketal.，1989)分離質(zhì)粒DNA。通過在CsCl密度梯度中分帶進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。該DNA用作PCR中的模板。
用于擴(kuò)增花瓣細(xì)胞色素P450同系物的PCR反應(yīng)含有下列成分5-100ng已切割的DNA，10mM Tris-Hcl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%(w/v)明膠，每種dNTP各0.2mM，各種引物0.4μM和1.25單位Taq聚合酶(Cetus)。反應(yīng)混合物(50μl)在94℃、48℃和72℃各反應(yīng)1分鐘，共循環(huán)30次。擴(kuò)增的產(chǎn)物用Geneclean (Bio 101Inc.)進(jìn)行凝膠純化，重復(fù)擴(kuò)增步驟獲取足夠用于克隆的原料，然后用T4DNA聚合酶進(jìn)行末端修復(fù)。用寡核苷酸1和2進(jìn)行擴(kuò)增和DNA被克隆入pBluescript中之前先用HindⅢ和XhoⅠ酶解。在寡核苷酸3和4間擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物按Holton和Graham(1991)的描述直接克隆到以ddT結(jié)尾的pBluescript載體中。
cDNA庫的篩選將復(fù)制的空斑吸出按下列條件進(jìn)行雜交和洗滌用于檢測同系克隆時(shí)采用高強(qiáng)度條件(雜交50%(v/v)甲酰胺，6×SSC，1%(w/v)SDS，在42℃進(jìn)行16小時(shí);漂洗2×SSC，1%(w/v)SDS65°，15分鐘，2次，然后在0.2×SSC，1%(w/v)SDS，65℃，15分鐘，2次)，在檢測相關(guān)順序時(shí)采用低強(qiáng)度條件(雜交20%(v/v)甲酰胺，6×SSC，1%(w/v)SDS，42℃，16小時(shí);漂洗6×SSC，1%(w/v)SDS，65℃，1小時(shí))。
Northern分析從經(jīng)液氮冷凍并用研缽研成精細(xì)粉末的組織中分離總RNA。將抽提緩沖液(4M異硫氰酸胍，50mMTris-HCl(pH8.0)，20mMEDTA，0.1%(v/v)Sarkosyl)加到組織中，用polytron以最大速度將混合物均化1分鐘。通過Miracloth(Calbiochem)過濾懸浮液，并用JA20轉(zhuǎn)頭以10，000rpm離心10分鐘。收集上清，并加入CsCl(終濃度0.2g/ml)。然后將樣本鋪在裝在10ml5.7MCsCl和50mMEDTA(pH7.0)緩沖物的38.5mlQuick-seal離心管(Beckman)上層，用Ti-70型轉(zhuǎn)頭以42，000rpm于23℃下離心12-16小時(shí)。所得團(tuán)丸垂懸于TE/SDS(10mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA，0.1%(w/v)SDS)溶液中，用經(jīng)10mMEDTA(pH7.5)飽和過的酚∶氯仿∶異戊醇抽提。在用乙醇進(jìn)行沉淀之后，RNA團(tuán)丸垂懸于TE/SDS中。
RNA樣本通過2.2M甲醛/1.2%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳，所用電泳緩沖液含有40mM嗎啉丙烷磺酸(pH7.0)，5mM乙酸鈉，0.1mM EDTA(pH8.0)。按制造商的說明把電泳后的RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N濾膜(Amer-sham)，并用32P標(biāo)記的cDNA片段(108cpm/μg，2×106cpm/ml)進(jìn)行探測。在50%(v/v)甲酰胺，1M NaCl、1%(w/v)SDS和10%(w/v)硫酸葡聚糖中進(jìn)行預(yù)雜交(1小時(shí)，42℃)和雜交(16小時(shí)，42℃)。在雜交步驟中，與32P標(biāo)記的探針一起加入降解的鮭精DNA(100μg/ml)。
濾膜在2×SSC/1%(w/v)SDS中于65℃漂洗1-2小時(shí)，然后在0.2×SSC/1%(w/v)SDS中于65℃再漂洗0.5-1小時(shí)。在-70℃將濾膜暴露于帶增感屏的KodakxAR膠片48小時(shí)。
RFLP分析a.基團(tuán)組DNA的分離基本上按Dellaporta等人(1983)描述的方法從葉組織中分離DNA。所制備的DNA進(jìn)一步用CsCl浮力密度離心純化(Sambrooketal.，1989)。
b.Southern印跡基因組DNA(10μg)用60單位XhaI酶解16小時(shí)，然后用0.7%(w/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為TAE(40mMTris-乙酸，50mMEDTA)。DNA在變性液(1.5MNaCl/0.5MNaOH)中變性處理1-1.5小時(shí)，在0.5MTris-HCl(pH7.5)/1.5MNaCl中中和2-3小時(shí)，然后用20×SSC將DNA轉(zhuǎn)移到HybondN(Amersham)濾膜上。
C.分離chi-A探針通過使用從OGB階段3花瓣RNA制備的cDNA模板和兩個(gè)寡聚核苷酸引物＃9，包括核苷酸6-20和＃10，與已公開的chi-A cDNA序列的核苷酸711-725(van Tunen et al.，1988)互補(bǔ)進(jìn)行PCR合成chi-A的一個(gè)cDNA克隆(van Tunen et al.，1988)。將得到的PCR產(chǎn)物連接到pBluescribe M13-(Stratagene)的SmaI位點(diǎn)，并且測序，證明已克隆的片段與公開的序列相一致。
DNA探針的32P-標(biāo)記使用一個(gè)寡聚物標(biāo)記盒(Bresatec)用50μCi[α32P]-dCTP放射性標(biāo)記DNA片段(50到100ng)。在Sephadex G-50(Fine)柱上色譜分析除去未摻入的[α-32P]-dCTP。
DNA序列分析基本上按照Sanger等人(1977)的方法，使用定序酶(USB，說明2.1)方法完成DNA定序。采用來自不同M13-mp18和mp19(Norrander等人，1983，Yanisch-Perron1985)的亞克隆的匯集的序列確定克隆pCGP602，pCGP176和pCGP175的全部序列，所述的亞克隆是使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法得到的(Sambrook等人，1989)。對于一些區(qū)域，必需合成特異的寡核苷酸引物以獲得重疊序列資料。為了上述目的，合成了下列6個(gè)引物;
5′CGTGCCAATGAGCTAGG3′引物序列15′GATGTTGGTTGTACTGAG3′引物序列25′GGAAACCAGATTTTCTTG3′引物序列35′TTTTTTTTTTTTTTTTT3′引物序列45′GTTTTCCCAGTCACGAC3′引物-405′AACAGCTATGACCATG3′反轉(zhuǎn)引物可以在圖8中見到pCGP602的限制圖譜，該圖中顯示了這些序列中其中幾個(gè)的位置。
使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)完成與Gen-bank，Swiss-PROT和EMBL數(shù)據(jù)庫相對應(yīng)的同源性調(diào)查。
構(gòu)建pCGP293從Ti雙重載體pCGN1559得到表達(dá)型雙重載體pCGP293(McBride和Summerfelt，1990)。用KpnI消化質(zhì)粒pCGN1559，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，1989)用T4DNA聚合酶除去突出的3′末端。然后用XbaI進(jìn)一步消化載體，并使用Klenow片段修復(fù)得到的5′突出末端。然后將該載體再連接得到pCGP67。從pCGP40中分離含Mac啟動(dòng)子，mas終止區(qū)和各種克隆位點(diǎn)(Comai等人，1990)的1.97kb的PstI片段，并將其插入到pCGP67的PstI位點(diǎn)得到pCGP293。
通過除去作為來自pCGN7334的BamHI-SacI片段的GUS基因(Jef-ferson等人)，并用來自pBluescribeM13的包括多克隆位點(diǎn)的BamHI-SacI片段代替上述基因以構(gòu)建質(zhì)粒pCGP40。通過將含Mac-GUS-mas融合基因的片段插入到pCGN7329(Comai等人，1990)的XhoI位點(diǎn)構(gòu)建質(zhì)粒pCGN7334(從CalgeneInc.CA;USA得到)。
構(gòu)建pCGP90通過以有意義方向在pCGP293的Mac啟動(dòng)子(Comai等人，1990)后克隆來自pCGP602的cDNA插入片段而構(gòu)建質(zhì)粒pCGP90。從pCGP602分離含cDNA插入片段的BamHI-KpnI片段并與pCGP293的BamHI/KpnI消化片段連接。通過限制性分析從慶大霉素抗性轉(zhuǎn)化體分離的DNA以確定上述插入片段正確插入pCGP90中。
構(gòu)建酵母表達(dá)型載體pYGA22m用EcoRI和BglⅡ消化M13-mp18，以產(chǎn)生一含多克隆位點(diǎn)的700bp片段。將上述片段與來自pYGA2269(Ashikari等人，1989)的9kbEcoRI-BglⅡ片段連接。所得的構(gòu)建體稱作pYGA22m，含有插入到甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)(
圖11)。
構(gòu)建pCGP618將包含來自pCGP175的整個(gè)cDNA插入片段的1.8kbEcoRI-KpnI片段與來自pYGA22m的9kbEcoRI-KpnI片段連接。所得的質(zhì)粒pCGP618包含以一有意義方向連接在甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子后的pCGP175cDNA片段(
圖11)。
構(gòu)建pCGP620將包含來自pCGP176的全部cDNA插入片段的1.8kbEcoRI-KpnI片段與來自pYGA22m的9KbEcoRI-KpnI片段連接(如構(gòu)建pCGP618一樣)。所得的質(zhì)粒，pCGP620含有以一有意義方向連接在酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子后的pCGP176cDNA片段。
酵母轉(zhuǎn)化按照Ito等人(1983)方法用pCGP618和pCGP620轉(zhuǎn)化酵母菌株G-1315(Matα，trpl)(Ashikari等人，1989)。根據(jù)其將G-1315恢復(fù)到色氨酸原養(yǎng)型的能力選擇轉(zhuǎn)化體。
制備酵母提取物以檢測3′，5-羥化酶活性a.G-1315/pCGP618用在缺乏色氨酸培養(yǎng)基上生長的G-1315/pCGP618和G-1315回復(fù)突變型的單一分離物接種50mL的YNBC[1.2%(w/v)沒有氨基酸的酵母氮(Difco)，2%(w/v)葡萄糖和0.3%(w/v)酪蛋白氨基酸(Difco)]并于30℃振蕩培養(yǎng)2天。通過離心細(xì)胞形成團(tuán)丸，按照Oeda等人(1985)的方法，所不同的是原生質(zhì)球在用于檢測植物組織中3′，5′-羥化酶活性的提取緩沖液中破碎，獲得微球體部分。把微球體團(tuán)丸懸浮于400μl緩沖液A(10mMTris-HCl(pH7.5)，0.65M山梨醇，0.1mMDTT，0.1mMEDTA)，并取100μL樣品檢測3′，5′-羥化酶活性。
b.G-1315/pCGP620將G-1315/pCGP620的單一分離物接種20mlYNBC，隨后在30℃培養(yǎng)2天。通過離心收集細(xì)胞，用TE沖洗一次，用緩沖液A沖洗一次，然后再懸浮于含酶解酶(0.1mg/mL)(Seikagakukogyo，Japan)的緩沖液B(10mMTris-HClCPH7.5)，1.2M山梨醇，0.1mMDTT，0.1mMEDTA)中。隨后在30℃培養(yǎng)1小時(shí)，通過離心細(xì)胞成團(tuán)丸并再懸浮于400μl緩沖液A中。用玻璃珠(直徑＝0.4mm)把細(xì)胞懸浮液形成旋渦2分鐘，取100μl樣品檢測3′，5′-羥化酶活性。
矮牽?；ǖ霓D(zhuǎn)化a.植物材料在1.25%(w/v)的次氯酸鈉中把碧冬茄(SKr4×Sw63和Rp57×Rw14)種子消毒10分鐘并用無菌水沖洗三次。把消毒后的種子在100mg/L赤霉酸(GA3)溶液中浸泡16到20小時(shí)。然后讓它們在用1%(v/v)蔗糖和0，8%(w/v)Difco Bacto瓊脂補(bǔ)充的10%(w/v)MS(Murashige和Skoog，1962)培養(yǎng)基上發(fā)芽2星期。在將幼苗移到Jiffy泥炭顆粒(Jiffy Pro-ducts Ltd，Norway)之前，先將幼苗轉(zhuǎn)移到用3%(w/v)蔗糖補(bǔ)充的MS培養(yǎng)基上生長3星期，在Jiffy泥炭顆粒上保持濕度和照明(135μE。鹵化汞光，22℃)2到3星期。然后將這些幼苗移到生長室中(68μE，冷白熒光，25℃)。為了共培養(yǎng)，收獲幼葉并在1.35%(w/v)的次氯酸鈉中消毒2分鐘，隨后用無菌水沖洗三次。然后把葉組織切成25mm2并在用0.05mg/L激動(dòng)素和1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)補(bǔ)充的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。
b.土壤桿菌和矮牽?；ǖ墓才囵B(yǎng)把含雙重載體pCGP90(
圖14)的根癌土壤桿菌菌株AGLO(Lazo等人，1991)于4℃保持在含100mg/L慶大霉素的MG/L(Garfinkel和Nester，1980)瓊脂平板上。將單個(gè)菌落在含1%(w/v)Bacto-胨，0.5%(w/v)Bacto-酵母提取物和1%(w/v)NaCl液體培養(yǎng)基上生長過夜。第二天，通過用含3%(w/v)蔗糖(BPM)的液體MS培養(yǎng)基稀釋制備成最終濃度為5×108細(xì)胞/mL。在含AGLO/pCGP90的BPM中把葉園片浸5分鐘，然后把葉園片吸干并放在共培養(yǎng)基上4天。該共培養(yǎng)基包括用0.05mg/L激動(dòng)素和1.0mg/L2，4-D補(bǔ)充的SH培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt1972)，并含有鋪散在共培養(yǎng)基上的煙草細(xì)胞懸浮液喂養(yǎng)層，在煙草細(xì)胞懸浮液的上層放一張濾紙。
c.重獲轉(zhuǎn)基因矮牽?；ㄖ参锕才囵B(yǎng)后，把葉園片轉(zhuǎn)移到下列選擇培養(yǎng)基上SKr4×Sw63園片移到用3%(w/v)蔗糖，2mg/Lα-芐氨基嘌呤(BAP)，100mg/L卡那霉素，350mg/L頭胞噻肟，0.3%GelriteGellan樹膠(Schweizerhall)補(bǔ)充的新鮮MS培養(yǎng)基;Rp57×Rw14園片移到同樣的培養(yǎng)基上，但用0.5mg/LBAP和α-萘乙酸(NAA)代替2mg/LBAP.3星期后，將再生的分離塊轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上。分離在卡那霉素選擇下存活的不定芽并轉(zhuǎn)移到含100mg/L卡那霉素和350mg/L頭胞噻肟的BPM上以誘發(fā)根。在23±2℃把全部培養(yǎng)物保持16小時(shí)光照周期(60μE。冷白熒光)。當(dāng)根長到2-3cm長時(shí)，將轉(zhuǎn)基因矮牽牛花小植物轉(zhuǎn)移到8cm試管中經(jīng)高壓消毒的51410/2盆栽混合土。4星期后，將植物再種到使用同樣盆栽混合土的15cm盆中，并保持于23℃，14小時(shí)光照周期300μE，鹵化汞光)。
煙草轉(zhuǎn)化a.植物材料把紅花煙草(cv.Xanthi)原料植物保持在用1mg/L吲哚丁酸(IBA)補(bǔ)充并用0.25%(w/v)的Gelrite固化的MS培養(yǎng)基上。把葉組織切成25mm2并放在含1mg/L BAP和0.5mg/L吲哚乙酸(IAA)的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)。
b.土壤桿菌和煙草組織的共培養(yǎng)按照前述對矮牽?；ǖ拿枋鐾瓿晒才囵B(yǎng)。
c.重獲轉(zhuǎn)基因煙草植物共培養(yǎng)后，將葉圓片轉(zhuǎn)移到用1mg/LBAP，0.5mg/LIAA，100mg/L卡那霉素和350mg/L頭胞噻肟選擇培養(yǎng)基)補(bǔ)充的MS培養(yǎng)基上。2-3星期后，將再生的分離塊轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇培養(yǎng)基上。分離出在卡那霉素選擇下存活的不定芽并將其轉(zhuǎn)移至含1mg/L′IBA，100mg/L卡那霉素和350mg/L頭胞噻肟的MS培養(yǎng)基以誘導(dǎo)根。當(dāng)根長到2-3cm長時(shí)，將轉(zhuǎn)基因煙草小苗移植到如對矮牽?；枋龅耐寥乐?。
花色素分析在HPLC分析前將存在于花瓣提取物中的花色素苷酸水解，從花色素核心除去糖基成分。通過HPLC分析花色素核心分子確定花色素苷色素B環(huán)上的羥基化方式。上述分析所用的HPLC系統(tǒng)是一個(gè)帶多波長檢測器(MWD)的Hewlett-Packard1050。在250mm×4mmID的SpherisorbS5ODS2柱上完成反相層析分離。
a.提取花色素苷和類黃酮用含1%(v/v)6M含水鹽酸的5ml甲醇從花瓣片(Ca.50mg)中提取花色素。用水稀釋提取物(1∶9)并在注射到HPLC系統(tǒng)前進(jìn)行過濾(MillexHV，0.45μ)。
b.花色素苷水解在室溫下，使用干氮?dú)饬?，在PierceReactivials中把上述a中得到的粗甲醇提取物(100μL)蒸發(fā)至干燥。殘余物溶解于200μL2MHCl中，蓋上小瓶并在100℃加熱30分鐘。用水稀釋水解混合物(1∶9)并在HPLC分析前過濾(MillexHV，0.45μ)。
c.層析使用下列系統(tǒng)經(jīng)過梯度洗脫可實(shí)現(xiàn)分離花色素
溶劑A(三乙胺∶conC.H3PO4∶H2O)(3∶2，5∶1000)溶劑B乙腈梯度條件5%B到40%B超過20分鐘流速1ml/min溫度35℃檢測在280，350，和546nm用同步數(shù)據(jù)獲得MWD。
參考已知的標(biāo)準(zhǔn)鑒定花色素的峰值。
2.克隆并分析3′，5′-羥化酶3′，5′-羥化酶的定性a.發(fā)育調(diào)節(jié)分析在上述定義的不同發(fā)育階段從花中收獲的碧冬茄cvOGB花瓣提取物中3′，5′-羥化酶活性。
已發(fā)現(xiàn)在花冠的成熟期間，OGB花瓣中的3′，5′-羥化酶活性受發(fā)育過程調(diào)節(jié)(圖2B)。該發(fā)育圖譜對應(yīng)于類黃酮生物合成中其他基因的表達(dá)。3′，5′-羥化酶活性和苯基苯乙烯酮合酶(CHS)，苯基苯乙烯酮黃烷酮異構(gòu)酶(CHI)，二羥黃烷醇還原酶(DFR)基因的表達(dá)在花發(fā)育的3到4階段達(dá)到峰值。
b.在葉組織中誘導(dǎo)3′，5′-羥化酶活性在葉組織中不能正常表達(dá)類黃酮色素生物合成途徑中的基因。但是，通過在強(qiáng)光下，于2%(W/V)蔗糖溶液中培養(yǎng)可在OGB葉中誘導(dǎo)飛燕草色素的合成。在這些條件下，可在OGB葉組織中檢測到3′，5′-羥化酶活性。已表明在蔗糖/強(qiáng)光處理96小時(shí)后，發(fā)生最大誘導(dǎo)酶活性。在這些條件下，也可將數(shù)個(gè)其它色素生物合成基因的表達(dá)誘導(dǎo)至與在花瓣形成期觀察到的水平相比。從這些結(jié)果得出結(jié)論在蔗糖/強(qiáng)光處理過的葉組織中可誘導(dǎo)Hf1和/或Hf2基因。
c.說明3′，5′-羥化酶屬于酶的細(xì)胞色素P450類的證據(jù)在OGB花瓣中3′，5′-羥化酶活性顯示出與微粒體部分有關(guān)并依賴于NADPH的存在?？梢酝ㄟ^用一氧化碳處理微粒體和利用兩種特異地使細(xì)胞色素P450酶失活的抑制劑tetcyclasis和1-氨基芐三嗪(Taton等人，1988;Matthew等人，1985，Rademacher等人，1987)抑制上述活性。
構(gòu)建富集細(xì)胞色素P450序列的cDNA文庫在膜結(jié)合的多核糖體上發(fā)生細(xì)胞色素P450mRNA轉(zhuǎn)譯(Takemori和Kominami，1989)。因此，為了富集細(xì)胞色素P450序列(包括3′，5′-羥化酶序列)，使用從第3-4花期的OGB花瓣分離的膜結(jié)合的多核糖體RNA構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫。從3-4期花分離花瓣RNA，是因?yàn)橐呀?jīng)表明在該發(fā)育階段3′，5′-羥化酶活性最大(看上述及圖2B)，因此，可確保在該文庫中最大限度地提供3′，5′-羥化酶序列。所得的文庫，稱作cDNA文庫＃1，含250，000初級重組體。
利用PCR擴(kuò)增矮牽牛花花瓣細(xì)胞色素P450cDNA已經(jīng)對來自象脊椎動(dòng)物，真菌，昆蟲，細(xì)菌和植物的有機(jī)體中許多細(xì)胞色素P450進(jìn)行測序(Nebert等人，1991，Bozak等人，1990)。所有這些酶的一個(gè)特征是存在若干小區(qū)域的保守序列，特別是涉及血色素結(jié)合的半胱氨酸殘基周圍。在迄今定序過的幾乎全部微粒體細(xì)胞色素P450的血色素結(jié)合區(qū)域存在氨基酸序列F(G，S)XGXRXCXG，其中，X可以是任何氨基酸(圖3)。使用FASTA程序(Pearson和Lipman，1988)，將上述共同序列與NBRF蛋白基礎(chǔ)數(shù)據(jù)相比，以確定對于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)中全部微粒體細(xì)胞色素P450中這一區(qū)域周圍，氨基酸出現(xiàn)的頻率。這種分析表明，對于血色素結(jié)合區(qū)域周圍每一位置，最共同的氨基酸序列是FMPFGAGXRXCLG設(shè)計(jì)一個(gè)與編碼劃線部分序列和相似序列的基因雜交的寡核苷酸。該寡核苷酸，稱作oligol，表示如下5′-GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG-3′劃線部分是包括一個(gè)HindⅢ識別位點(diǎn)的附加序列;該位點(diǎn)有利于PCR產(chǎn)物的直接克隆。脫氧肌苷(Ⅰ)內(nèi)合物對于密碼子使用具有不同的可能性，其中，兩個(gè)以上的密碼子可編碼同樣的氨基酸。脫氧肌苷堿基對具有與A，T，G和C相似的能力。(Martin等人，1985;Ohtsuka等人，1985)。
用從在材料和方法中描述的cDNA＃1文庫得到的質(zhì)粒DNA作為模板，使用oligos1和2(圖3)擴(kuò)增360bp細(xì)胞色素P450相關(guān)序列。Oligo2相應(yīng)于-20引物(Strategene)在5′末端加一個(gè)GCN4結(jié)合位點(diǎn)(Lew和Kemp，1989)。將PCR片段克隆到pBluescript中，所得的質(zhì)粒稱作pCGP450。pCGP450的5′區(qū)編碼一個(gè)與先前定序的細(xì)胞色素P450分子具顯著同源性的多肽序列。
從矮牽?；ɑò甑腸DNA文庫分離細(xì)胞色素P450的同源物用質(zhì)粒pCGP450篩選cDNA＃1(60，000噬菌斑)的有關(guān)克隆。在高和低強(qiáng)度條件下用兩次連續(xù)雜交檢測pCGP450的同胞克隆和第二組細(xì)胞色素P450cDNA。篩選每一同胞組的cDNA克隆樣品以用于隨后的分析。pCGP450的同胞稱作pCGP142，相應(yīng)的第二組稱作pCGP147。在低強(qiáng)度下，用包括僅有的pCGP147編碼序列的SalI-EcoRI片段從cDNA文庫＃1中再探測16，000個(gè)噬菌斑。給全部20個(gè)與探針雜交的克隆定序，進(jìn)一步鑒定了兩個(gè)細(xì)胞色素P450同源物pCGP158和pCGP160(圖4A)。
通過PCR分離其他的花瓣細(xì)胞色素P450同源物用來自矮牽?；╬CGP142，pCGP147的推測的血紅素結(jié)合區(qū)周圍的序列信息和先前定序的鱷梨細(xì)胞色素P450序列(O′keefe和Leto，1989;BozaKetal，1990)，按照材料和方法中的描述，設(shè)計(jì)一個(gè)覆蓋至少由三個(gè)細(xì)胞色素P450克隆中的兩個(gè)編碼的氨基酸序列的第二簡并寡核苷酸(oligo3)。用cDNA文庫＃1作模板并用oligo4作第二引物(圖3B)進(jìn)行PCR，將該寡聚核苷酸用于擴(kuò)增相關(guān)的序列。按在材料和方法中描述的方法分離大小范圍在250-500bp的反應(yīng)產(chǎn)物并將其克隆到由Holton和Graham(1991)描述的加ddT-尾的pBluescript載體中。將已克隆的PCR片段定序并表明該片段編碼第5種細(xì)胞色素P450同源物。選擇稱作pCGP454的克隆作進(jìn)一步分析。
從cDNA文庫＃1進(jìn)一步分離細(xì)胞色素P450同源物用包括細(xì)胞色素P450同源物pCGP142，pCGP147，pCGP158和pCGP160的編碼序列和來自pCGP454的cDNA插入片段(圖4B到4H)的32p-標(biāo)記的DNA片段混合探針，從cDNA文庫＃1的50，000個(gè)重組體中篩選相關(guān)序列。在低嚴(yán)緊度的雜交和沖洗條件下，探測到總共152個(gè)雜交克隆。通過序列分析來自雜交克隆的DNA鑒定了其它的13個(gè)不同的細(xì)胞色素p450同源物。在這些克隆中分辨出兩種緊密相關(guān)同胞組。在DNA水平上，這兩組中每一組的編碼區(qū)表現(xiàn)出94%的同源性或相似性。選擇一個(gè)同胞組的兩個(gè)代表，pCGP147(圖5A)和pCGP176以及另一同胞組的一個(gè)代表pCGP175(圖5B)作進(jìn)一步研究Northern和RFLP分析細(xì)胞色素P450同源物用Northern和RFLP分析區(qū)別有編碼3′，5′-羥化酶cDNA分子特征的細(xì)胞色素P450同源物。在碧冬茄中有兩個(gè)遺傳位點(diǎn)Hf1和Hf2控制3′，5′-羥化酶活性(de Vlaming等人，1984;Wiering，1974)。Hf1在碧冬茄花的瓣片和合瓣花冠中表達(dá)，并產(chǎn)生比僅在瓣片中表達(dá)的Hf2高很多的3′，5′-羥化酶活性水平。矮牽牛花的3′，5′-羥化酶活性也是隨發(fā)育和空間調(diào)節(jié)的。在正常生長條件下，僅在花瓣組織中可檢測到這種酶，在花發(fā)育的3-4期左右達(dá)到最高水平，然后在全開的花中下降(周期5;見圖2B)。在某種逆境條件下，如上述的蔗糖/強(qiáng)光處理，也可在葉組織中誘導(dǎo)酶活性。因此，期望能編碼3′，5′-羥化酶的cDNA克隆在RNA印跡上有一個(gè)相應(yīng)于酶活性圖譜的表達(dá)概況。也希望把編碼碧冬茄3′，5′-羥化酶的cDNA克隆繪制到Hf1或Hf2位點(diǎn)。已經(jīng)把Hf1繪制在碧冬茄基因組的第一條染色體上并與ph1位點(diǎn)相連(Cornu，1984，Cornu等人，1990)，同時(shí)Hf2緊密連接在第五條染色體上的PO(Wallroth等人，1986)。將從近親系V23(Hf1/Hf1，Hf2/Hf2)和R51(hf1/hf1，hf2/hf2)雜交得到的植物F2群體中分離的DNA進(jìn)行RFLP分析，以獲得各種細(xì)胞色素P450同源物的連鎖資料。規(guī)定在花冠中有3′，5′-羥化酶活性的F2植物是Hf1/-基因型。另外，基于與影響花瓣液泡的pH的ph1基因連鎖也可以給F2群體植物提供Hf1/Hf1基因型(Wiering和de Vlaming，1984)。
V23親本系(Hf1/Hf1)也有導(dǎo)致花瓣勻漿pH約6.2的ph1/ph1基因型。由于ph1/植物的花瓣勻漿pH為5.3，所以通過分析花瓣勻漿的pH，可以區(qū)別在R51×V23F2組群中的ph1/ph1(Hf1/Hf1)。
利用Hf2和po位點(diǎn)之間的連鎖可以區(qū)別需選擇的Hf2克隆。已經(jīng)表明Po位點(diǎn)相應(yīng)于編碼苯基苯乙烯酮黃烷酮異構(gòu)酶的碧冬茄Chi-A基因，(Van Tunen等人，1991)。因此，在RFLP分析中可以用Chi-A的cDNA克隆，以規(guī)定在F2組群中的個(gè)體具有Po或Po基因型。由于V23有基因型Hf2/Hf2，Po/Po，因此，由類似V23和類似R51的RFLP共分離圖譜和由Chi-A探針檢測的Po和Po圖譜可以確定與Hf2位點(diǎn)的連鎖。
用對應(yīng)于細(xì)胞色素P450同源物的3′未轉(zhuǎn)譯區(qū)的cDNA片段，探測從V23×R51 F2組群的個(gè)體植物中分離出的染色體DNA的RNA印跡和Southern印跡。通過這種分析，表明對應(yīng)于cDNA克隆pCGP174和pCGP175的基因以平行于3′，5′-羥化酶活性的方式進(jìn)行表達(dá)。進(jìn)一步地說，相應(yīng)于pCGP174的基因與Hf1位點(diǎn)緊密連接，pCGP175與Hf2位點(diǎn)連接。
a.pCGP174來自克隆pCGP174(圖5A)的330bpHindⅢ-KpnI3′片段與RNA和DNA印跡具有雜交圖譜，圖譜顯示該克隆相應(yīng)于Hf1位點(diǎn)(圖6)。在瓣片和合瓣花冠組織中表達(dá)該基因，且該基因有一個(gè)平行于3′，5′-羥化酶活性的發(fā)育概況，在第3期的花瓣中達(dá)到峰值。在葉中未檢測到它的表達(dá)，但在該組織中，通過蔗糖/強(qiáng)光處理可誘導(dǎo)其表達(dá)。進(jìn)一步說，在hf1/hf1突變系R51或Sw63的花瓣組織中，沒有探測到這種基因的表達(dá)。相反，在Hf1/Hf1系的V23和Th7以及V23×R51雜種中(圖.6A)可檢測到相當(dāng)高水平的表達(dá)。
在用XbaI消化的染色體DNA的Sourthern印跡上，來自pCGP的330即HindⅢ-KpnI3′片段探測到兩個(gè)在V23×R51組群中單獨(dú)分離的RFLP，RFLP＃1相當(dāng)于強(qiáng)雜交DNA帶，RFLP＃2相當(dāng)于弱雜交帶(見圖6B)。具有ph1/ph1基因型的12株植物中有11株具有類似V23的RFLP＃1圖譜，并且在合瓣花冠中有3′，5′-羥化酶活性的49株植物中49株具有或者類似于V23或者類似于VR的RFLP＃1圖譜。另外，對于全部32株植物，V23，VR和R51的chi-A(PO)具有完全共分離的RFLP圖譜，包括相應(yīng)的RFLP＃2圖譜。
該資料提供了有力的證據(jù);pCGP174編碼3′，5′-羥化酶并相當(dāng)于Hf1位點(diǎn)(RFLP＃1)并且3′探到與Hf2位點(diǎn)(RFLP＃2)交叉雜交。
b.pCGP175來自克隆pCGP175(圖5B)的320bpHindⅢ/xhoI3′片段在RNA和DNA印跡上有雜交圖譜，說明該克隆對應(yīng)于Hf2位點(diǎn)(圖7)。Northern分析表明基因以與pCGP174相似的方式受發(fā)育調(diào)節(jié)，在第3期的OGB花瓣瓣片中，得到最大程度的表達(dá)，但在OGB的花冠組織中未檢測到其表達(dá)。該基因在V23(Hf2/Hf2)，Th7(Hf2/Hf2)和V23×R51雜交體(圖7A)的花瓣組織中也表達(dá)。
在Southern印跡上，來自pCGP175的320bpHindⅢ/×hoI片段與同pCGP1743′探針弱雜交(RFLP＃2)的V23和R51染色體DNA由XbaI消化產(chǎn)生的相同基因組片段雜交。通過pCGP1753′探針檢測，有類似V23-，VR-和R51-的RFLP圖譜完全共分離，相應(yīng)于Chi-A(Po)的RFLP圖譜。
隨后的酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)(見下面)證實(shí)pCGP175和pCGP174的一個(gè)同胞(pCGP176)兩者都編碼3′，5′-羥化酶。另外，pCGP174全長模板在hf1/hf1，hf2/hf2矮牽?；ㄍ蛔凅w中的表達(dá)，導(dǎo)致3′，5′-羥化酶活性提高并產(chǎn)生高于在非轉(zhuǎn)基因植物中存在的正常低基礎(chǔ)水平的3′，5′羥化花色素苷。與RFLP結(jié)果歸在一起，從這些數(shù)據(jù)中得出結(jié)論，pCGP174相當(dāng)于Hf1位點(diǎn)，pCGP175相當(dāng)于Hf2位點(diǎn)。
分離全長的Hf1cDNA克隆并序列分析從初步的序列分析表明，pCGP174并不代表一個(gè)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄的全長克隆，但pCGP175包括一個(gè)假設(shè)起始密碼子并且認(rèn)為它是一個(gè)全長的cDNA。序列分析也表明，pCGP176是一個(gè)較長的pCGP174變體并包括從5′末端起的ATG密碼為17bp。但是，單獨(dú)地通過這種分析不可能有把握地預(yù)言pCGP176是否包含該基因的全部編碼區(qū)。因此，篩選cDNA文庫＃2以得到pCGP174/pCGP176同胞組群的較長克隆。從來自cDNA文庫＃2的約1.5×105個(gè)重組體中篩選出與來自pCGP174的0.33KbHindⅢ-KpnI3′片段雜交的克隆。選擇兩個(gè)雜交克隆，稱作pCGP601和pCGP602作進(jìn)一步分析。
pCGP601和pCGP602兩者都包括假設(shè)的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，但是pCGP602編碼一個(gè)較長的5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)。
圖8是pCGP602的限制酶圖譜，顯示對該克隆進(jìn)行序列分析所采用的方法以及獲得重疊序列信息所使用的寡聚核苷酸引物。
在圖9中顯示同胞克隆pCGP176和pCGP602的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。同樣，
圖10表示pCGP175的核苷酸序列和推導(dǎo)出的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物。
使用由LFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)產(chǎn)生的序列，發(fā)現(xiàn)由矮牽?；?′，5′-羥化酶基因編碼的氨基酸序列有94%的位置等同。核苷酸序列是94%等同。根據(jù)細(xì)胞色素P450的分類示意圖，該序列安置了兩個(gè)同一族/亞族的基因。由于3′，5′-羥化酶氨基酸序列與先前鑒定的細(xì)胞素P450總科成員相比具有低于40%的等同，所以相應(yīng)的基因?qū)儆趶钠渌鸓450基因分離的新P450科。
在酵母中表達(dá)pCGP175以一有意義的方向，將來自pCGP175的cDNA插入片段連接在酵母載體pYGA22m的甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子的后面。將所得的稱作pCGP618(
圖11)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到酵母菌株G-1315(AshiKari等人，1989)中。讓一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化體在50mL的YNBC中于30℃生長2天。從這一培養(yǎng)物制備的微粒體部分顯示有3′，5′-羥化酶活性，而從非轉(zhuǎn)化酵母制備的等同部分沒有活性(
圖12)。由此可得出結(jié)論，從pCGP175分離的cDNA插入片段編碼3′，5′-羥化酶。
在酵母中表達(dá)pCGP176cDNA以一有意義的方向，把來自pCGP176的cDNA插入片段連接到酵母載體pYGA22m的甘油醛-3-磷酸脫氫酶后面。把所得的稱作pCGP620的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到酵母菌株G-1315中。從該轉(zhuǎn)化酵母制備的提取物有3′，5′-羥化酶活性，而從非轉(zhuǎn)化酵母制備的等同部分沒有活性(
圖13)。由此得出結(jié)論，來自pCGP176的cDNA插入片段編碼3′，5′-羥化酶。
Hf1cDNA的表達(dá)a.在hf1/hf1，hf2/hf2碧冬茄F1雜交體SKr4×SW63中表達(dá)把pCGP602cDNA插入片段連接在Ti雙重載體pCGp293啟動(dòng)子Mac的后面。把所得的稱作pCGP90的構(gòu)建體，使用土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)入F1矮牽?；s交體SKr4×SW63中。SKr4×SW63的葉圓片與AGLO/pCGPP90共培養(yǎng)，并通過Sourthern分析卡那霉素選擇后得植物證實(shí)，CGP602cDNA插入片段整合到SKr4×SW63基因組中。
轉(zhuǎn)基因植物比非轉(zhuǎn)基因的SKr4×SW63雜交體有顯著高水平的3′，5′-羥化酶活性(
圖15)和3′，5′-羥化的花色素苷(表3A)。雖然SKr4×SW63的Hf1和Hf2是純合隱性的，但這些突變不完全阻斷酶產(chǎn)生，在SKr4×SW63花瓣提取物中(
圖15)可檢測到低水平的3′，5′-羥化酶活性。另外，在酸水解的SKr4×SW63花瓣提取物中檢測到低水平(100μg/gm)的二甲翠雀素(表3A)。Hf1cDNA的導(dǎo)入明顯地提高了花瓣瓣片組織中3′，5′-羥化酶的水平(
圖15)并且來自突變植物花瓣的酸水解提取物中二甲翠雀素的水平是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏械?倍(表3A)。
b.在紅花煙草栽培種xanthi中表達(dá)煙草(紅花煙草cvxanthi)花產(chǎn)生如基底花色素一樣的花色素。用pCGP90轉(zhuǎn)化煙草導(dǎo)致在花中除花色素以外積累顯著高含量的翠雀素(顯示于表3A)。
表3A色素分析在酸水解的花瓣提取物中花色素水平植物二甲翠雀素花色素翠雀素(μg/gm花瓣)(μg/gm花瓣)(μg/gm花瓣)矮牽?；⊿Kr4×SW63100nd'ndSKr4×SW63/pCGP90410ndnd煙草非共培養(yǎng)對照nd272nd轉(zhuǎn)基因煙草nd22936
1未檢測到c.在hf1/hf1，hf2/hf2碧冬茄F1雜交體Rp57×Rw14中表達(dá)用pCGP90和相同于SKr4×SW63所用的方法轉(zhuǎn)化矮牽牛品系Rp57×Rw14。轉(zhuǎn)基因花產(chǎn)生顯著的在非轉(zhuǎn)基因植物檢測不到的3′-甲花翠素和二甲翠雀素(表3B)。3′-甲花翠素和二甲翠雀素都是翠雀素的甲基化衍生物。
表3B高PH系Rp57×RW14的色素分析在酸水解花瓣提取物中存在的花色素百分比植物花色素甲基花青素3-'甲花翠素二甲翠雀素(%)(%)(%)(%)矮牽?；≧p57×RW145.095.000Rp57×RW14/pCGp90045.27.847.0導(dǎo)入的Hf1cDNA在SKr4×SW63雜交體中的表達(dá)對花的顏色有明顯的影響。未轉(zhuǎn)基因花的心皮和雄蕊組織是白色的，而在轉(zhuǎn)基因植物中，這些同樣的組織是蘭/紫色。另外，在SKr4×SW63雜交體中表達(dá)Hf1cDNA使通常為很淡的粉紅色的花冠具有深粉紅色/紫羅蘭色。對于煙草的情況，產(chǎn)生的翠雀素衍生物產(chǎn)生輕微蘭色的成熟中的花。在Rp57×RW14雜交體中表達(dá)Hf1cDNA對花色也有明顯的影響。非轉(zhuǎn)基因的Rp57×RW14花是粉紅色的，其主要存在的花色素是甲基花青素(見表3B)。用Hf1cDNA轉(zhuǎn)化導(dǎo)致花色明顯變蘭。
可依據(jù)來自RoyalHorticulturalSociety′sCoLourChart的數(shù)據(jù)描述觀察到的顏色改變。通常，可把改變描述成從60C/D-65C/D的淡到居中的粉紅色，到由許多而不是全部的70到85之間的顏色面積表示的深蘭/紫色。雖然不希望限制可達(dá)到的可能顏色改變，可以把一些在SKr4×SW63雜交體中觀察到的顏色近近似地描述成從65B(未轉(zhuǎn)化)到70B和到74B(兩者是轉(zhuǎn)化的)的變化。同樣，在Rp57×RW14中的幾個(gè)雜交體可以描述成從64C到72B到77B和到82B的改變。應(yīng)該記住其他生物化學(xué)和生理學(xué)條件也影響個(gè)體結(jié)果并且所得的特殊顏色的例子不應(yīng)被解釋為限制可能的范圍。
在其他植物種中檢測假設(shè)的3′，5′-羥化酶基因序列3′，4′，5′-羥化的類黃酮的存在與3′，5′-羥化酶活性和其3′，5′-羥化酶基因的存在有關(guān)。可以預(yù)料來自其它物種的這些基因在低嚴(yán)緊度的條件下可與矮牽?；?′，5′-羥化酶基因雜交。從一些產(chǎn)生翠雀素的植物分離出RNA(
圖16)和/或DNA(
圖17)，用32P-標(biāo)記的Hf1 cDNA在不同嚴(yán)緊度的條件下探測并洗滌。在每個(gè)樣品中檢測雜交帶。因此，使用矮牽牛花3′，5′-羥化酶基因作為探針從其它產(chǎn)生翠雀素的植物中分離3′，5′-羥化酶基因應(yīng)是可能的。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員懂得本文描述的發(fā)明除那些特別描述外可以進(jìn)行改變和修飾。可以理解本發(fā)明包括全部上述變異和修飾。本發(fā)明也包括在本說明書中單獨(dú)地或共同地涉及或說明的全部步驟，特征，組合物和化合物，以及任何將全部任意兩個(gè)或更多的所述步驟或特征的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種核酸分離物，包含一種核苷酸序列，該序列編碼或互補(bǔ)于一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或部分的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分離物，其中所說的核酸是DNA或cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分離物，其中的酶是一種3′，5′-羥化酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸分離物，其中的酶來源于牽?；?，馬鞭草，飛燕草，葡萄，鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的核酸分離物，其中的酶是來源于牽牛花。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的核酸分離物，該分離物具有一個(gè)核苷酸序列，它包含有基本上全部或部分圖9或10中所示的核苷酸序列，或者與其至少具有40%的相似性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的核酸分離物，所說的分離物是存在于轉(zhuǎn)基因植物中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的核酸分離物，其中的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰、牽?；ā⒕栈?，荷蘭石竹，非洲菊，天竺葵、或alstroemeria
9.根據(jù)權(quán)利要求8的核酸分離物，其中的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰或牽?；?。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或6的核酸分離物，它存在于一種能夠?qū)⑺f核酸分離物轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞或組織中的載體分子中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的核酸分離物，其中所說的轉(zhuǎn)移需要與土壤農(nóng)桿菌一起培養(yǎng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的核酸分離物，其中的載體和核酸分離物是
圖11中所示的pCGP90。
13.一種重組二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或其部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組酶，其中所說的酶是一種3′，5′-羥化酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組酶，其中所說的酶來源于牽牛花、馬鞭草、飛燕草、葡萄、鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的重組酶，其中的酶來源于牽?；ā?br> 17.根據(jù)權(quán)利要求16的重組酶，它所具有的氨基酸序列包含有基本上全部或部分圖9或10中所示的氨基酸序列或具有與其至少40%的同源性。
18.根據(jù)權(quán)利要求13、15、16或17的重組酶，它存在于一種轉(zhuǎn)基因植物中。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組酶，其中所說的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰、牽?；?、菊花、荷蘭石竹或非洲菊。
20.根據(jù)權(quán)利要求19或20的重組酶，其中的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰或牽牛花。
21.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該植物能夠表達(dá)一種重組二氫莰非醇(DHK)羥化酶，或控制一種基本上互補(bǔ)于全部或部分mRNA分子的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，該mRNA分子可被翻譯成DHK羥化酶，所說的方法包括向一種合適的植物細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求1或6的核酸分離物，導(dǎo)入條件允許最終表達(dá)所說的核酸分離物，從細(xì)胞中再產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物，和使所說的轉(zhuǎn)基因植物生長一段時(shí)間，并且導(dǎo)入條件足以允許核酸分離物的表達(dá)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中重組酶是3′，5′-羥化酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中核酸分離物的表達(dá)是隨發(fā)育調(diào)節(jié)的。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中的重組酶來源于牽?；āⅠR鞭草、飛燕草、葡萄、鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
25.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中的重組酶來源于牽?；?。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中的核酸分離物或酶具有一種基本如圖9或10所示的核苷酸或氨基酸序列，或者與其具有至少40%的相似性。
27.根據(jù)權(quán)利要求21、24、25或26的方法，其中的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰、牽?；ā⒕栈?、荷蘭石竹、非洲菊或煙草。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰或牽?；?。
29.一種帶有穩(wěn)定導(dǎo)入的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物，含有一種核苷酸序列編碼或互補(bǔ)于一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶核苷酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的轉(zhuǎn)基因植物，其中的酶是一種3′，5′-羥化酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)基因植物，其中的酶來源于牽?；ǎR鞭草，飛燕草，葡萄，鳶尾，小蒼蘭，繡球花，仙客來，馬鈴薯，三色紫羅蘭或茄子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物，其中的酶來源于牽?；?。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的轉(zhuǎn)基因植物，其中的酶具有一種基本上如圖9或10中所示的氨基酸序列，或與其具有至少40%的相似性。
34.根據(jù)權(quán)利要求29至33的任何一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所說的植物是玫瑰、牽?；ā⒕栈?、荷蘭石竹、非洲菊、鳶尾，郁金香，百合，lisianthus，小蒼蘭，飛燕草，limunium，天竺葵。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，其中的轉(zhuǎn)基因植物是玫瑰或牽?；?。
36.一種克隆核酸分子的方法，該分子含有一種編碼來源于植物的細(xì)胞色素P450分子或類似分子的核苷酸序列或該編碼序列的互補(bǔ)序列，所說的方法包括用一種或幾種寡聚核苷酸引物通過一種或幾種聚合酶鏈反應(yīng)對來源于所說植物細(xì)胞的合適核酸分子制備物中的細(xì)胞色素P450核苷酸序列或互補(bǔ)序列進(jìn)行放大，所說引物具有一種來源于一種或幾種已知微粒體細(xì)胞色素P450分子的一致序列的核苷酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中的一致序列是來源于細(xì)胞色素P450分子的血紅素結(jié)合區(qū)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中的一致序列是F(G，S)XGXRXCXG，其中X是任何氨基酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中的一致序列是FMPFGAGXRXCLG，其中X是任何氨基酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求36、37、38或39的方法，其中的細(xì)胞色素P450分子或類似分子是一種DHK羥化酶。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中的DHK羥化酶是3′，5′-羥化酶。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中克隆的酶具有一種圖9或10中的氨基酸序列或基本是由圖9或10中的核苷酸序列所編碼，或者具有與其40%的相似性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸分離物，它含有一種編碼二氫莰非醇(DHK)羥化酶或其衍生物或部分的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明還涉及到帶有和表達(dá)上述核酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號A01H5/02GK1071456SQ92109770
公開日1993年4月28日 申請日期1992年7月11日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月11日
發(fā)明者T·A·霍爾頓, E·C·科尼什, F·科瓦契奇, Y·特納克, D·R·萊斯特 申請人:同際花卉開發(fā)有限公司