本發(fā)明涉及動物模型，尤其涉及一種m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、面肩肱骨肌營養(yǎng)不良癥(facioscapulohumeral?muscular?dystrophy,fshd)是最常見的遺傳性肌肉疾病之一，通常表現(xiàn)為緩慢的進展，主要影響面部、肩膀和上臂的肌肉，通常呈不對稱的模式。此外，許多患者出現(xiàn)軀干和腿部肌肉無力。大多數(shù)患者在青春期后開始表現(xiàn)出明顯的癥狀，而嚴重的病例可以在10歲之前表現(xiàn)出來。

2、目前普遍認為骨骼肌中dux4的異常表達是fshd的發(fā)病機制。fshd根據(jù)不同的致病機制可分為兩種類型：fshd1和fshd2。fshd1是一種更常見的形式，主要是由染色體4q35的亞端粒區(qū)d4z4重復序列的收縮引起的。健康個體通常有11-100個重復單位，而fshd1患者表現(xiàn)出數(shù)量減少(1-10個重復單位)，并攜帶特定的4qa等位基因。fshd2與涉及smchd1的缺失有關(guān)，smchd1是一種位于18號染色體上的dna甲基化調(diào)節(jié)因子，通常通過高甲基化來維持d4z4的沉默。這兩種類型都是通過表觀遺傳變化導致骨骼肌中dux4表達的去抑制而導致發(fā)病。

3、自從確定了dux4在fshd中的關(guān)鍵作用以來，開發(fā)與dux4相關(guān)的細胞和動物模型已經(jīng)成為研究dux4介導的fshd中的骨骼肌毒性和評估潛在的dux4靶向治療的焦點。然而，構(gòu)建fshd的動物模型具有挑戰(zhàn)性，其中一個主要障礙是dux4在動物模型中表達滲漏的問題。takako?jones等證實了flexdux4轉(zhuǎn)基因在未產(chǎn)生基因重組的情況下在rosa26位點通過反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了有意義的全長dux4(dux4-fl)mrna。目前，包括takako?jones等在內(nèi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員主要以acta1-mcm-flexdux4小鼠作為研究fshd骨骼肌相關(guān)疾病的少數(shù)動物模型之一。他莫昔芬使cre從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核，從而使轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)至正義方向，導致一些dux4下游基因表達差異，并伴隨許多異常生理體征，包括細胞死亡、免疫反應(yīng)、中央核肌纖維等，骨骼肌具有高水平的肌纖維再生和纖維化，受影響最嚴重的小鼠迅速失去了運動能力，因此，該雙轉(zhuǎn)基因小鼠是研究dux4-fl在骨骼肌中表達的一個有意義的動物模型。但是，flexdux4和acta1-mcm轉(zhuǎn)基因都存在滲漏，因此雙轉(zhuǎn)基因鼠與flexdux4單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，在沒有他莫昔芬誘導的情況下，低水平的dux4會在骨骼肌中表達，表現(xiàn)出dux4靶基因激活和輕度骨骼肌表型。linde?f.bouwman等報導了非誘導的acta1-mcm-flexdux4雜合子小鼠從8-10周齡開始發(fā)生輕度骨骼肌病理，并在衰老過程中發(fā)生進展。先前有關(guān)fshd小鼠模型研究涉及使用成年acta1-mcm-flexdux4小鼠誘導dux4爆發(fā)性表達，或使用acta1-mcm-flexdux4小鼠不注射他莫昔芬或dux4低表達的flexdux4單轉(zhuǎn)基因小鼠形成慢性疾病模型。因此，可用于fshd研究的小鼠模型是有局限性的，當前未見任何現(xiàn)有技術(shù)披露dux4在幼年期高表達的動物模型。

4、由于倫理學限制，很多研究無法在人體中進行，為了更深入地研究fshd，需要借助一定的動物模型來模擬人體的情況。因此，豐富fshd動物模型的種類對fshd的機制研究和治療策略研究具有重要的意義，同時，針對嚴重的病例，早期干預(yù)治療的動物模型也十分重要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法；本發(fā)明還有一個目的在于提供所述構(gòu)建方法獲得的雙轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠在fshd早期干預(yù)和治療評價中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供的一種m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括將myf6-creert2小鼠與flexdux4小鼠配繁后獲得雄性個體。

3、其中，作為一種優(yōu)選的實施方式，所述myf6-creer2小鼠為雜合子小鼠，由myf6-creer2轉(zhuǎn)基因小鼠與c57bl/6小鼠配繁后獲得；所述flexdux4小鼠為雜合子小鼠，由flexdux4轉(zhuǎn)基因小鼠與c57bl/6小鼠配繁后獲得。作為其他可選的實施方式，亦可選用myf6-creert2或flexdux4的純合子小鼠與另一種雜合子小鼠配繁，亦可選用myf6-creert2和flexdux4的純合子小鼠配繁獲得。不同于acta1-mcm轉(zhuǎn)基因小鼠是在人acta1啟動子的控制下表達mercremer雙融合蛋白，myf6-creert2小鼠是將creert2-pa插入到小鼠myf6基因起始密碼子處。除特殊說明外，本發(fā)明所述的myf6為肌原因子6(myogenic?factor?6)表達基因；所述肌原因子6是一種參與肌肉發(fā)育的dna結(jié)合蛋白。

4、進一步地，所述myf6-creert2小鼠通過myf6-creert2基因型鑒定相對于野生型c57bl/6小鼠在371bp具有雜合子特征條帶。具體來說，利用引物p1、p2和p4進行pcr反應(yīng)，野生型野生型c57bl/6小鼠只能被鑒定出單一的867bp條帶，而m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠還能被鑒定出在371bp具有雜合子特征條帶。

5、進一步地，所述flexdux4小鼠通過flexdux4基因型鑒定相對于野生型c57bl/6小鼠在415bp具有雜合子特征條帶。具體來說，利用引物21306、26766和oimr9021進行pcr反應(yīng)，野生型c57bl/6小鼠只能被鑒定出單一的198bp條帶，而m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠還能被鑒定出在415bp具有雜合子特征條帶。

6、進一步地，本發(fā)明提供的一種m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法可使用他莫昔芬(tamoxifen,tmx)對不超過6周齡的m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行誘導，誘導后的小鼠骨骼肌表現(xiàn)出類似fshd的病例表現(xiàn)，如肌肉占體重比下降、四肢抓力下降、耐力下降、中央核肌纖維數(shù)量增多、骨骼肌纖維化程度增高、骨骼肌中dux4及其靶基因(wfdc3、agtr2、serpinb6c)表達增高。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的一種m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法優(yōu)選不超過4周齡的m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行誘導。

7、進一步地，本發(fā)明用于誘導的所述他莫昔芬為100～200mg/ml的乙醇溶液，然后加入到溫無菌玉米油中，37℃搖勻備用，最終用于誘導的他莫昔芬濃度為5～10mg/kg。優(yōu)選地，所述最終用于誘導的他莫昔芬濃度為10mg/kg。

8、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述誘導是對3周齡的雄性m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠每周腹腔注射一次5～10mg/kg的他莫昔芬無菌玉米油。

9、利用本發(fā)明提供的一種m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法獲得的m6d4/+雙轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠，具有骨骼肌特異表達cre(cyclization?recombination?enzyme)重組酶時，原本以反義方向插入到26rosa啟動子下的人類dux4基因的3個外顯子和2個內(nèi)含子通過cre進行單向重組，將dux4基因向正義方向轉(zhuǎn)變，然后，rosa26啟動子轉(zhuǎn)錄dux4-fl?mrna，該mrna被dux4第3外顯子的多聚腺苷酸化信號(pas)終止(如圖1所示)的特點；以及myf6-creer2小鼠在他莫昔芬注射后骨骼肌中特異性表達cre重組酶的優(yōu)勢。在該小鼠3周齡時開始他莫昔芬腹腔注射誘導，9周齡時在生理學、病理學和分子學方面對模型進行評估。本發(fā)明得到的雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型在骨骼肌方面出現(xiàn)了類fshd樣改變，豐富了fshd機制研究和治療策略研究的動物模型選擇，同時也為fshd的早期干預(yù)治療提供了寶貴的動物模型。