本發(fā)明屬于植物培育技術領域，具體涉及一種攀枝花塊菌的菌根苗培育方法。

背景技術：

塊菌(t.ruffles)為子囊菌類塊菌目(tuberales)塊菌科(tuberaceae)塊菌屬(tuber)，是世界上最珍貴的共生食用菌，具有奇特的香味和營養(yǎng)價值，因其產量有限，國際市場上價格昂貴，供不應求，被譽為“黑鉆石”。

攀枝花塊菌(t.panzhihuanense)子實體碩大，單個重可達450g以上，有清香味，肉質細膩，口感較好，是國內到現在為止發(fā)現的極具商業(yè)價值和較大商業(yè)開發(fā)潛力的白色塊菌新品種。3cm以上的攀枝花塊菌國內市場價格在1500元·kg^～1～2000元·kg^～1，遠高于印度塊菌(500元·kg^～1～800元·kg^～1)。但攀枝花塊菌產量比較有限，市場供不應求。

為了能夠提高攀枝花塊菌的產量，有效保護現有資源，實現攀枝花塊菌持續(xù)利用，可以通過開展攀枝花塊菌人工栽培。但是攀枝花塊菌人工栽培比較困難，技術含量高。攀枝花塊菌人工栽培的關鍵在于攀枝花塊菌菌根苗的培育，塊菌生長必需與合適的宿主植物根系營共生生活，否則將無法形成子囊果，這就意味著人工栽培塊菌離不開活體宿主植物。塊菌人工栽培成功的關鍵是首先要將塊菌接種到適合的宿主植物根部，塊菌菌絲萌發(fā)并感染植物根系，與植物形成共生關系，得到菌根苗。再將菌根苗種植到適合的環(huán)境中，塊菌的菌絲會隨著植物根生長而生長，當塊菌的菌根長到一定數量后，菌根表面的外延菌絲就會扭結并開始出菇。從接種到出菇的時間通常需要5～8年，出菇后可以每年采收一次，可持續(xù)收獲30～50年。

攀枝花塊菌是最具有商業(yè)前景的白色塊菌新種，目前還沒有成熟的攀枝花塊菌人工栽培方法。現有的印度塊菌和夏塊菌菌根苗培育方法中，通常有固體菌劑和液體菌劑進行接種兩種方法，固體菌劑接種一般先培育無菌裸根苗，接種時更換營養(yǎng)缽，接種后有一段時間的緩苗期，這會導致接種苗死亡率高，影響苗木生長，延緩菌根形成。液體菌劑接種方法接種量不均勻，塊菌孢子有多、有少，接種后形成菌根的質量參差不齊，甚至部分苗木不能感染形成菌根。

美國山核桃[caryaillinoensis(wangenn.)k.koch]，原產美國，是世界上四大堅果之一。美國山核桃殼薄，取仁容易，出仁率50％—70％，含油率70～80％，不飽和脂肪酸含量60％左右，不飽和的脂肪酸和對人體有益的各種氨基酸比油橄欖高。美國山核桃定值后4～5年開始掛果，10年開始盛產，盛產期50～70年，100—250kg/畝，國際市場上6～8美元/kg，國內超市60～120元/kg，是普通核桃的4～6倍，僅按照最低產量和最低價格計算，畝產值可達到6000元。

美國山核桃在年均溫15-20℃,降雨量800～1600mm，1月平均溫5-10℃，7月平均溫20～30℃，無霜期220～330天，土壤ph值6～8的地區(qū)均可種植，是唯一一種適合低海拔栽培的核桃品種，攀枝花中低海拔區(qū)域適合美國山核桃栽培。塊菌在攀枝花海拔1100～2600m的范圍均有分布，根據“適樹適菌”的原則，為實現美國山核桃效益的最大化，需要開展攀枝花塊菌接種美國山核桃菌根苗的培育方法。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的技術問題為：現有技術缺乏攀枝花塊菌進行菌根苗培育的方法的問題。

本發(fā)明解決技術問題的技術方案為：提供一種攀枝花塊菌的菌根苗培育方法。該方法包括以下步驟：

a、攀枝花塊菌菌種的收集和保藏

收集攀枝花塊菌成熟子實體，消毒后粉碎成粉末；

b、攀枝花塊菌菌劑的配比及制備方法

將步驟a制備得到的粉末與石灰石粉、蛭石粉、草炭粉、em酵母菌和枯草芽孢桿菌按重量比30～35﹕8～12﹕20～25﹕10～15﹕1～2﹕1～2進行配比，混合均勻；

c、美國山核桃種子收集和保藏

收集美國山核桃種子，消毒后浸泡5～7d；

d、美國山核桃無菌苗的培育

將浸泡后的山核桃種子播種到裝有滅菌基質的育苗盤中，添加2～3cm滅菌基質覆蓋種子，澆透水，置于大棚中培養(yǎng)；

e、接種

待步驟d的美國山核桃培養(yǎng)進行3個月后，將步驟b配制的菌劑接種入育苗盤中，每株無菌苗接種塊菌菌劑5～8g，再覆蓋2～3cm滅菌基質，澆透水；

f、接種菌根苗的培育

將步驟e接種過塊菌的山核桃植株于大棚中培養(yǎng)4～6個月，得到攀枝花塊菌菌根苗。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟a中所述消毒的具體操作為用70～75％的酒精或雙氧水浸泡3～5min。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟a中所述的粉末直徑≤0.5mm。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟b中所述的石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉的粒度為≤0.5mm。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟c中所述消毒的處理方式為：用0.3～0.5％的高錳酸鉀液浸泡處理3～5h。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟c中所述浸泡為清水浸泡，每天換水1～2次。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述滅菌基質為按重量比草炭土：蛭石：珍珠巖：石灰石粉＝2～3﹕1～2﹕1～2﹕1～1.5混合而成。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述滅菌基質的滅菌過程為在121～126℃下滅菌2～3小時。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述裝入的滅菌基質占育苗盤深度的1/2～2/3。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述育苗盤中裝有4～8根倒根線。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d、e中所述的培養(yǎng)條件為：基質濕度25～35％，大棚溫度20～30℃，大棚濕度60～80％。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供一種攀枝花塊菌接種美國山核桃的菌根苗培育方法，美國山核桃用于攀枝花塊菌的接種彌補了溫度較高區(qū)域栽培經濟果樹塊菌菌根苗的空缺；本發(fā)明特有的菌劑組成和配比，使得菌劑接種后感染率高達90％，采用育苗盤培育，盤中裝有倒根線，使得須根多且生長分布均勻，菌根數量多，接種后不移盤，大大提高苗木成活率，且無緩苗期。本發(fā)明方法操作簡單，感染率高，移栽存活率高，具有顯著的經濟效益。

說明書附圖

附圖1所示為未接種的美國山核桃根；

附圖2所示為實施例1接種后的美國山核桃菌根；

附圖3所示為實施例1接種后菌根苗上的外延菌絲；

附圖4所示為實施例1接種后菌根表層馬蹄狀的哈蒂氏網結。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種攀枝花塊菌的菌根苗培育方法，包括以下步驟：

a、攀枝花塊菌菌種的收集和保藏

收集攀枝花塊菌成熟子實體，用70～75％的酒精或雙氧水浸泡3～5min，粉碎成直徑≤0.5mm的粉末；

b、攀枝花塊菌菌劑的配比及制備方法

將步驟a制備得到的粉末與石灰石粉、蛭石粉、草炭粉、em酵母菌和枯草芽孢桿菌按重量比30～35﹕8～12﹕20～25﹕10～15﹕1～2﹕1～2進行配比，混合均勻；

c、美國山核桃種子收集和保藏

收集美國山核桃種子，消毒后浸泡5～7d；

d、美國山核桃無菌苗的培育

將浸泡后的山核桃種子播種到裝有滅菌基質的育苗盤中，添加2～3cm滅菌基質覆蓋種子，澆透水，置于大棚中培養(yǎng)；

e、接種

待步驟d的美國山核桃培養(yǎng)進行3個月后，將步驟b配制的菌劑接種入育苗盤中，每株無菌苗接種塊菌菌劑5～8g，再覆蓋2～3cm滅菌基質，澆透水；

f、接種菌根苗的培育

將步驟e接種過塊菌的山核桃植株于大棚中培養(yǎng)4～6個月，得到攀枝花塊菌菌根苗。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟b中所述的石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉的粒度為≤0.5mm。

本發(fā)明選擇石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉和em酵母菌與攀枝花塊菌配合使用，石灰石粉末可以使菌種保持干燥，還能提供塊菌生長的鈣質，調節(jié)ph值；蛭石粉可以維持菌劑的疏松度，起填充作用；草炭含有腐殖酸，能夠促進塊菌孢子萌發(fā)，促進植物根系生長；em酵母菌和枯草芽孢桿菌有利于塊菌菌根的合成，能夠調節(jié)土壤中微生物群的平衡，提高塊菌菌根感染率；將上述原料按重量比30～35﹕8～12﹕20～25﹕10～15﹕1～2﹕1～2進行混合，可以使菌根感染率達到90％以上，苗木的成活率98％以上，出苗成活率高。選擇這樣的比例菌種保存時間較長，菌種中孢子的萌發(fā)率高，極易感染苗木形成菌根。

所述的石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉的粒度優(yōu)選為≤0.5mm，能夠使孢子更好地從子囊游離出來，在接種時更容易均勻的分散在樹苗的根部。將三者的比例限定為30～35﹕8～12﹕20～25，可以使菌劑的保存時間更久，更疏松透氣，粘合性好，接種后感染率高。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟c中所述消毒的處理方式為：用0.3～0.5％的高錳酸鉀液浸泡處理3～5h。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟c中所述浸泡為清水浸泡，每天換水一次。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述滅菌基質為按重量比草炭土﹕蛭石﹕珍珠巖﹕石灰石粉＝2～3﹕1～2﹕1～2﹕1～1.5混合而成。草炭含有腐殖酸，能夠促進塊菌孢子萌發(fā)，促進植物根系生長；蛭石可以維持菌劑的疏松度，提供植物生長的各種礦物質；珍珠巖起填充作用，疏松基質，增加基質的透水、透氣性和保水性；石灰石粉能提供塊菌生長的鈣質，調節(jié)基質ph值。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述滅菌基質的滅菌過程為在121～126℃下滅菌2～3小時。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述裝入的滅菌基質占育苗盤深度的1/2～2/3。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d中所述育苗盤中裝有4～8根倒根線。倒根線一方面可以促進須根均勻生長，使須根數量多，且分布均勻，另一方面，可以使根呈輻射狀生長，不會盤旋，移栽成活率高。

其中，上述攀枝花塊菌的菌根苗培育方法中，步驟d、e中所述的培養(yǎng)條件為：基質濕度25～35％，大棚溫度20～30℃，大棚濕度60～80％。

本發(fā)明選擇美國山核桃進行菌根苗的培育，山核桃是一種經濟果樹，適宜在溫度偏高的區(qū)域種植，相比現有的接種塊菌的經濟樹種板栗、榛子等，能適應高溫環(huán)境，并且有利于攀枝花塊菌的菌根接種，接種率高，提高了塊菌種植的效益，填補了溫度較高區(qū)域栽培經濟果樹塊菌菌根苗的空缺。

本發(fā)明培育方法清楚、簡單，且成本低，接種塊菌感染快，菌根感染率高，無緩苗期，無死苗，塊菌菌根苗生長整齊。為實現攀枝花塊菌人工栽培奠定了堅實的基礎，提供了優(yōu)質菌根苗的保障技術，攀枝花塊菌人工栽培成功不僅可以有效保護現有攀枝花塊菌資源，還滿足了人類日益增長的高品質的物質生活需求，具有廣闊的市場前景。

下面通過實施例對本發(fā)明的具體實施方式做進一步的解釋說明，但不表示將本發(fā)明的保護范圍限制在實施例所述范圍內。

本發(fā)明實施例中的em酵母菌購至山西昌泰動物藥業(yè)有限責任公司,執(zhí)行標準為q/scy010-213；枯草芽孢桿菌購至武漢天惠生物工程有限公司，產品標準證號為q/wth05-2012；

攀枝花塊菌購至攀枝花彝人塊菌有限公司。

實施例1用本發(fā)明方法對攀枝花塊菌進行菌根苗培育

攀枝花塊菌菌根苗培育，具體操作步驟如下：

a、攀枝花塊菌菌種的收集和保藏

收集攀枝花塊菌成熟子實體，用70％的酒精或雙氧水浸泡3min后，粉碎成直徑≤0.5mm的粉末；

b、攀枝花塊菌菌劑的配比及制備方法

將步驟a制備得到的塊菌粉末與石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉、em酵母菌和枯草芽孢桿菌按重量比30﹕8﹕20﹕10﹕1﹕1進行配比，混合均勻；所述的石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉的粒度為≤0.5mm；

c、美國山核桃種子收集和保藏

收集優(yōu)質美國山核桃種子，用0.3％的高錳酸鉀液浸泡處理3h進行消毒，消毒后用清水浸泡5d，保持每天換水；

d、美國山核桃無菌苗的培育

將具有8根倒根線的育苗盤中裝入1/2的滅菌基質，所述滅菌基質由重量比草炭土：蛭石：珍珠巖：石灰石粉＝2﹕1﹕1﹕1混合而成，混合后在121℃下滅菌2小時，接種步驟c的山核桃種子，再添加2～3cm滅菌基質覆蓋種子，澆透水，置于大棚中培養(yǎng)，培養(yǎng)時保持基質濕度25％，大棚溫度20℃，大棚濕度60％；

e、接種

待步驟d培養(yǎng)3個月后，將步驟b配制的菌劑接種入育苗盤中，每株無菌苗接種塊菌菌劑4g，再覆蓋2～3cm滅菌基質，澆透水；

f、接種菌根苗的培育

將步驟e接種過塊菌的山核桃植株于大棚中培養(yǎng)，保持基質濕度25％，大棚空氣溫度20℃，大棚空氣濕度60％，4～6個月后得到攀枝花塊菌菌根苗。

實施例2用本發(fā)明方法對攀枝花塊菌進行菌根苗培育

攀枝花塊菌菌根苗培育，具體操作步驟如下：

a、攀枝花塊菌菌種的收集和保藏

收集攀枝花塊菌成熟子實體，用75％的酒精或雙氧水浸泡5min后，粉碎成直徑≤0.5mm的粉末；

b、攀枝花塊菌菌劑的配比及制備方法

將步驟a制備得到的塊菌粉末與石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉、em酵母菌和枯草芽孢桿菌按重量比33﹕10﹕22﹕12﹕1.5﹕1.5進行配比，混合均勻；所述的石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉的粒度為≤0.5mm；

c、美國山核桃種子收集和保藏

收集優(yōu)質美國山核桃種子，用0.5％的高錳酸鉀液浸泡處理5h進行消毒，消毒后用清水浸泡7d，保持每天換水；

d、美國山核桃無菌苗的培育

將具有8根倒根線的育苗盤中裝入2/3的滅菌基質，所述滅菌基質由重量比草炭土：蛭石：珍珠巖：石灰石粉＝3﹕1﹕2﹕1.5混合而成，混合后在126℃下滅菌3小時，接種步驟c的山核桃種子，再添加2～3cm滅菌基質覆蓋種子，澆透水，置于大棚中培養(yǎng)，培養(yǎng)時保持基質濕度35％，大棚溫度35℃，大棚濕度80％；

e、接種

待步驟d培養(yǎng)3個月后，將步驟b配制的菌劑接種入育苗盤中，每株無菌苗接種塊菌菌劑5g，再覆蓋2～3cm滅菌基質，澆透水；

f、接種攀枝花塊菌菌根苗的培育

將步驟e接種過塊菌的山核桃植株于大棚中培養(yǎng)，保持基質濕度30％，大棚空氣溫度30℃，大棚空氣濕度80％，4～6個月后得到攀枝花塊菌菌根苗。

實施例3用本發(fā)明方法對攀枝花塊菌進行根苗培育

攀枝花塊菌根苗培育，具體操作步驟如下：

a、攀枝花塊菌菌種的收集和保藏

收集攀枝花塊菌成熟子實體，用75％的酒精或雙氧水浸泡5min后，粉碎成直徑≤0.5mm的粉末；

b、攀枝花塊菌菌劑的配比及制備方法

將步驟a制備得到的塊菌粉末與石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉、em酵母菌和枯草芽孢桿菌按重量比35﹕12﹕25﹕15﹕2﹕2進行配比，混合均勻；所述的石灰石粉末、蛭石粉、草炭粉的粒度為≤0.5mm；

c、美國山核桃種子收集和保藏

收集優(yōu)質美國山核桃種子，用0.5％的高錳酸鉀液浸泡處理3h進行消毒，消毒后用清水浸泡5d，保持每天換水；

d、美國山核桃無菌苗的培育

將具有8根倒根線的育苗盤中裝入1/2的滅菌基質，所述滅菌基質由重量比草炭土：蛭石：珍珠巖：石灰石粉＝3﹕2﹕2﹕1混合而成，混合后在121℃下滅菌3小時，接種步驟c的山核桃種子，再添加2～3cm滅菌基質覆蓋種子，澆透水，置于大棚中培養(yǎng)，培養(yǎng)時保持基質濕度35％，大棚溫度35℃，大棚濕度80％；

e、接種

待步驟d培養(yǎng)3個月后，將步驟b配制的菌劑接種入育苗盤中，每株無菌苗接種塊菌菌劑6g，再覆蓋2～3cm滅菌基質，澆透水；

f、接種攀枝花塊菌菌根苗的培育

將步驟e接種過塊菌的山核桃植株于大棚中培養(yǎng)，保持基質濕度30％，大棚空氣溫度30℃，大棚空氣濕度80％，4～6個月后得到攀枝花塊菌菌根苗。

對比例1不添加酵母菌和枯草芽孢桿菌進行塊菌菌根苗培育

對比例1中，除攀枝花塊菌菌劑配比中不添加酵母菌和枯草芽孢桿菌外，其余操作同實施例1。

對比例2不設置倒根線進行塊菌菌根苗培育

對比例2中，除步驟d所述的育苗盤中沒有倒根線外，其余操作同實施例1。

對比例3采用現有方法進行塊菌菌根苗培育

對比例3為采用現有方法，先用育苗盤培育無菌苗，接種時取出無菌苗，剪去主根，先在育苗缽中放置2/3的育苗基質，將無菌裸根苗放入育苗缽中，接入塊菌菌劑，再填入1/3的基質土。

對比例4采用現有方法進行苗木培育

對比例4的操作方法除不接入塊菌菌劑外,其余操作同對比例3。

對實施例和對比例接種的菌根苗每隔15天進行一次檢測，6個月時統(tǒng)計成活率，測量菌根感染率、生物量，得到如下表1所示的結果。

表1不同方法進行根苗培育的效果表

由實驗結果可知：采用本發(fā)明方法，塊菌菌根苗形成時間短，45天即可形成塊菌菌根，并且感染率高達85％以上，苗木感染成活率達到98％以上；塊菌菌根苗的苗高、地徑都比現有的方法更高，根系多且分布均勻，質量好，菌根苗的質量高。

對實施例1中的菌根進行顯微觀察，采用十字交叉的抽樣方法抽樣，抽樣強度為5％，統(tǒng)計塊菌菌根的合成情況和生長情況。

由結果可知：未接種攀枝花塊菌的美國山核桃根較細，先端尖銳(見圖1)；實施例1接種攀枝花塊菌形成菌根的美國山核桃根較粗，形態(tài)為棒狀、羽狀結構，菌根初期，端部呈淺黃色，之后顏色逐漸變深呈淺肉色或淺棕色(見圖2)；

在顯微鏡下可清晰看到表面有半透明的外延菌絲結構，外延菌絲直立、不分叉、有序地長在菌根表面(見圖3)；菌根表層形成馬蹄狀的哈蒂氏網層的鞘細胞組織結構(見圖4)。