本發(fā)明屬于花藥培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種快速創(chuàng)制加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法。

背景技術：

目前花藥培養(yǎng)已成為辣椒育種的主要技術。近二十年來已經育成了一些優(yōu)良的辣椒花培品種，如?；ㄈ?李春玲等，1990)、海豐12號(刑永萍等，2002)、海豐26號(刑永萍等，2003)、海豐14號(張樹根等，2003)、海豐25號(張樹根等，2008)、海豐16號(刑永萍等，2014)、海豐1052(張樹根等，2015)和海豐391(張樹根等，2015)等。通過花藥培養(yǎng)技術1～2年即可獲得純合的二倍體材料，可以加快育種進程，縮短育種所需年限(陳曉等，2003；袁麗等，2011)。分子標記輔助選擇(molecular assisted selection，MAS)的準確性高、不受辣椒生育期等的影響，在辣椒育種中得到了廣泛應用。近年來，研究人員利用MAS和花藥培養(yǎng)技術相結合的方法在水稻中制備了一些優(yōu)良育種材料(王興春等，2004；于鳳池等，2010；袁麗等，2011；宋丁丁，2011)。育種實踐中加工型辣椒CMS優(yōu)良恢復系較少，傳統(tǒng)育種選育加工型辣椒CMS恢復系費時費工。因此利用花藥培養(yǎng)和MAS相結合的方法快速創(chuàng)制加工型辣CMS育性恢復材料成為育種工作者需要亟待解決的首要問題，但該方法在加工型辣椒材料創(chuàng)制中尚未相關報道。

綜上所述，育種實踐中加工型辣椒CMS優(yōu)良恢復系較少，傳統(tǒng)育種選育加工型辣椒CMS恢復系費時費工。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速創(chuàng)制加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法，旨在解決育種實踐中加工型辣椒CMS優(yōu)良恢復系較少，傳統(tǒng)育種選育加工型辣椒CMS恢復系費時費工的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種加工型辣椒花藥培養(yǎng)的方法，所述加工型辣椒花藥的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

步驟一，辣椒植株在26.4±0.4℃溫度條件下，進行辣椒花藥培養(yǎng)；

步驟二，辣椒單倍體培養(yǎng)選擇處于單核靠邊期的小孢子用于誘導胚狀體發(fā)生；

步驟三，花蕾在4℃冰箱中低溫預處理1-3d；之后在無菌條件下將供試花蕾在70％酒精中浸泡30s后再0.1％升汞中浸泡7min，用無菌水沖洗3-4次，接種到MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO₃4mg/L+活性炭0.4％的培養(yǎng)基上，pH 5.8；接種密度為直徑100mm培養(yǎng)皿接種8個花蕾；

步驟四，接種花藥到將接種好的花藥置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中處理7d；然后在白天溫度28℃，夜晚溫度為20℃的組培室中繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟五，選擇根尖生長旺盛的植株，從每株取小于2cm的根5-6條，蒸餾水漂洗后，飽和對二氯苯溶液中處理3.5h，卡諾氏固定液固定2h，蒸餾水沖洗3-4次，0.2M鹽酸處理5min，蒸餾水沖洗3-4次，45％冰乙酸溶液處理5min，卡寶染色20min，制片，顯微鏡下觀察，尋找處于細胞分裂中期，染色體分散的細胞，計數；

步驟六，胚狀體在培養(yǎng)基中成苗約4-5cm高時，需要進行移栽，移栽前需對花培植株試管苗進行煉苗。

進一步，所述誘導培養(yǎng)基為：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂+AgNO₃4mg/L+活性炭0.4％的培養(yǎng)基上，pH5.8；生根培養(yǎng)基為：MS+0.2mg/L NAA+蔗糖3％+瓊脂0.7％的培養(yǎng)基上，pH5.8。

進一步，所述煉苗包括：

(1)閉瓶強光煉苗：將花培植株試管苗的培養(yǎng)瓶移到室外進行強光閉瓶煉苗7d；

(2)開瓶強光煉苗：將培養(yǎng)瓶封口膜打開，在自然光下開瓶煉苗5-7d；

(3)花培植株試管苗的移栽：試管苗要用鑷子小心的從培養(yǎng)基中移出，洗干凈根部后移入基質中；蓋上塑料薄膜保持濕度；花培植株先移至自然光下光照，再開瓶適應濕度；

(4)露地條件煉苗：幼苗長出新葉、新根后即可移至露地條件下，進行定植前的適應性鍛煉；長出2-3片新葉時，即可定植。

進一步，所述移栽的基質按照體積比為腐殖質：蛭石＝4:1。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述加工型辣椒花藥培養(yǎng)方法進行辣椒單倍體培養(yǎng)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述加工型辣椒花藥培養(yǎng)技術創(chuàng)制加工型辣椒CMS恢復系材料。

進一步，所述加工型辣椒細胞質雄性不育恢復系的構建方法包括以下步驟：

(1)F₂群體由恢復系812和優(yōu)良親本940雜交配制而成；用分子標記輔助選擇在F₂群體中篩選含有恢復基因Rf的單株進行花藥培養(yǎng)；

(2)利用篩選到的CRF-SCAR標記篩選F₂群體中含恢復基因的單株進行花藥培養(yǎng)，進而用該標記鑒定花培再生株DH系是否含有恢復基因Rf，CRF-SCAR上游引物序列為：5′-GTACACACCACTCGTCGCTCCT-3′，下游引物序列為：5′-TTCTTGGGTCCCTTTCTTCCAA-3′；

(3)辣椒葉片DNA采用CTAB法進行提取；含5×PCR緩沖液4μL、25mmol/LMgCl₂溶液1.2μL、dNTP溶液1.6μL、33ng/μL上下游引物各2.0μL、2U/μLTaq聚合酶0.5μL、ddH₂O 7μL和模板DNA 1.0μL；

(4)在工作臺上用70％酒精浸泡30s，之后用0.1％HgCL₂消毒7min，無菌水漂洗4次，然后放在無菌濾紙上瀝干水；在無菌條件下接種于胚狀體誘導培養(yǎng)基，9mm×9mm培養(yǎng)皿接6個花蕾的花藥，37℃高溫預處理5d。

進一步，所述胚狀體誘導培養(yǎng)基為MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO₃4mg/L+活性炭0.4％。

本發(fā)明提供的快速創(chuàng)制加工型辣椒雄性不育育性恢復新種質的方法，創(chuàng)制加工型辣椒(CMS)恢復系材料，采用優(yōu)勢性狀互補，恢復基因供體加工型辣椒恢復系812和重慶市農科院近年選育的優(yōu)良自交系940作親本，對其F₂進行花藥培養(yǎng)；通過分子標記輔助選擇對花培再生株系進行恢復基因Rf的篩選，利用花藥培養(yǎng)與分子標記輔助選擇將Rf快速導入到自交系940中，加速制備加工型辣椒CMS育性恢復資源；便于辣椒科研工作者更有效地展開辣椒花藥培養(yǎng)工作，掌握取材花蕾形態(tài)指標，減少操作環(huán)節(jié)，保證花藥培養(yǎng)效率。本發(fā)明為快速制備加工型辣椒胞質雄性不育(CMS)恢復系材料，利用分子標記輔助選擇和花藥培養(yǎng)相結合的方法將完全恢復的恢復系812的恢復基因Rf導入自交系940，制備含恢復基因的新種質；對其中含Rf的5個花培二代苗系(DH)與不育系83-3A進行測交，結果表明，測交株系均表現(xiàn)恢復，且測交株系的恢復株率均為100％。本發(fā)明結合花藥培養(yǎng)和分子標記輔助育種可以達到快速有效育種的目的；為快速制備加工型辣椒CMS恢復系材料，利用分子標記輔助選擇和花藥培養(yǎng)相結合的方法將完全恢復的恢復系812的恢復基因Rf導入自交系940，制備含恢復基因的新種質；對其中含Rf的5個花培二代苗系(DH)與不育系83-3A進行測交，結果表明，測交株系均表現(xiàn)恢復，且測交株系的恢復株率均為100％。本發(fā)明說明結合花藥培養(yǎng)和分子標記輔助育種可以達到快速有效地為育種實踐創(chuàng)制優(yōu)異育種資源的目的。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的加工型辣椒花藥培養(yǎng)方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的加工型辣椒F₂群體的分子標記檢測示意圖；

圖中:M:DL5000；1:恢復系812；2:不育系83-3A；3～18:加工型辣椒F2單株。

圖3是本發(fā)明實施例提供的CRF-SCAR標記在加工型辣椒DH系中的擴增示意圖；

圖中:M:DM2000；1:不育系83-3A；2:恢復系812；3～8:DH系編號。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的加工型辣椒花藥的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

S101：辣椒植株在26.4±0.4℃溫度條件下，進行辣椒花藥培養(yǎng)；

S102：辣椒單倍體培養(yǎng)選擇處于單核靠邊期的小孢子用于誘導胚狀體發(fā)生；

S103：花蕾在4℃冰箱中低溫預處理1-3d；之后在無菌條件下將供試花蕾在70％酒精中浸泡30s后再0.1％升汞中浸泡7min，用無菌水沖洗3-4次，接種到MS+BA0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO₃4mg/L+活性炭0.4％，pH5.8；接種密度為直徑100mm培養(yǎng)皿接種8個花蕾；

S104：接種花藥到將接種好的花藥置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中處理7d；然后在白天溫度28℃，夜晚溫度為20℃的組培室中繼續(xù)培養(yǎng)；

S105，選擇根尖生長旺盛的植株，從每株取小于2cm的根5-6條，蒸餾水漂洗后，飽和對二氯苯溶液中處理3.5h，卡諾氏固定液固定2h，蒸餾水沖洗3-4次，0.2M鹽酸處理5min，蒸餾水沖洗3-4次，45％冰乙酸溶液處理5min，卡寶染色20min，制片，顯微鏡下觀察，尋找處于細胞分裂中期，染色體分散的細胞，計數；

S106：胚狀體在培養(yǎng)基中成苗約4-5cm高時，需要進行移栽，移栽前需對花培植株試管苗進行煉苗。

在步驟S106中：

煉苗可分為4歩進行：(1)閉瓶強光煉苗：將花培植株試管苗的培養(yǎng)瓶移到室外進行強光閉瓶煉苗7d；(2)開瓶強光煉苗：將培養(yǎng)瓶封口膜打開，在自然光下開瓶煉苗5-7d。(3)花培植株試管苗的移栽：試管苗要用鑷子小心的從培養(yǎng)基中移出，洗干凈根部后移入基質中。蓋上塑料薄膜保持濕度?；ㄅ嘀仓晗纫浦磷匀还庀乱欢螘r間適應光照，再開瓶適應濕度，可使幼苗根系發(fā)達，移栽成活率達90％以上。(4)露地條件煉苗：幼苗長出新葉、新根后即可移至露地條件下，進行定植前的適應性鍛煉。長出2-3片新葉時，即可定植。

移栽基質為腐殖質：蛭石＝4:1(體積比)，移栽前先將花培植株移至自然光下一段時間適應光照，再開瓶蓋適應濕度，避免在移栽過程中出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，使其逐步長出適應自然環(huán)境的表皮結構、新葉與新根。在溫水中洗凈培養(yǎng)基，移入基質后，澆足定根水。

下面結合具體實施例對本發(fā)明的應用效果作詳細的描述。

實施例1

1結果與分析

1.1花藥培養(yǎng)供體植株的篩選

以加工型辣椒恢復系812為父本，優(yōu)良自交系940為母本，利用分子標記輔助選擇和雜交技術構建F₂群體，然后用分子標記CRF-SCAR篩選含有恢復基因Rf的單株，本試驗共篩選出16個單株含Rf，用其作為花藥培養(yǎng)的供試材料(圖2)。

1.2花培再生植株的獲得與鑒定

2014年5-7月在重慶市農科院生物技術研究中心逆境農業(yè)研究重慶市重點實驗室對含恢復基因Rf的16個單株共接種130皿，約3200枚花藥，獲得胚狀體34個，誘導率1.06％。其中成苗21株，成苗率為61.76％，但是當年加倍后僅有6份收到種子，暫定名為DH-1、DH-2、DH-3、DH-4、DH-5、DH-6，次年按照苗系在重慶市農科院基地種植。

用CRF-SCAR標記對6個DH系植株基因組DNA進行PCR擴增鑒定，除DH-1沒有擴增出特異條帶，表現(xiàn)為條帶缺失，不含恢復基因Rf，其余5個DH系均能擴增出條帶大小為870bp的特異條帶，與恢復系812帶型一致(圖3)。

1.3花培再生植株對83-3A的恢復性

2015年用83-3A不育系作母本，用6個DH系作父本，測交了各組合花培DH系的恢復性。2016年夏季將所得到的測交一代種子種于重慶市農科院基地種植，調查其花粉育性(表1)。除了83-3A×DH-1雜交組合測交株系沒有恢復株系，其余雜交組合的花培后代測交株系均有可恢復株，且測交株系的恢復株率均為100％(表1)。其與分子標記輔助選擇結果一致。

表1測交花培后代對83-3A的恢復性

1.4利用花藥培養(yǎng)技術選育的3個優(yōu)良恢復系

種植于基地的5個花培植株DH系，株系田間表現(xiàn)農藝性狀一致，表明這5份材料已純合穩(wěn)定。進行田間農藝性狀調查和成熟后取樣考種(表2)。綜合田間農藝性狀和分子標記輔助選擇，選育出3個農藝性狀好的DH系恢復材料，均為完全恢復的恢復系。其中DH-3植株的株型緊湊，果面光滑，中早熟；DH-5果實直，果面光滑，抗性強；DH-6植株掛多，果面光滑，較早熟。

表25個恢復系的農藝性狀性狀表現(xiàn)

2在過去的二十多年，花藥培養(yǎng)在辣椒育種中得到較為廣泛的應用。用花藥培養(yǎng)技術制備加工型辣椒優(yōu)良恢復系，可以在2～3年內選育出恢復系，相比較常規(guī)方法的5-7年，節(jié)省了篩選恢復系需要的人力、物力和財力。這與在小麥K型雄性不育恢復系選育上的結果一致。大部分研究中花藥培養(yǎng)供體親本都是選擇F₁代。經花藥培養(yǎng)獲得的再生苗系差異較大，這與需要培育性狀穩(wěn)定的育種目標不符。

在本試驗中，用于構建花培供體親本的F₂群體恢復系親本812為完全恢復的恢復系，且用CRF-SCAR分子標記輔助選擇的方法提前對花培供體親本F₂群體進行恢復基因篩選，所用花培供體親本均為含Rf的植株，分子標記輔助選擇和6個DH系與83-3A的測交后代育性均表明，選育的6個DH系選中有5個DH系為恢復系。結合田間農藝性狀，認為選育出了3個DH系性狀比較優(yōu)良，可以作為育種材料，用于新組合配制。可見，通過分子標記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結合的方法，可以高效地制備新的加工型辣椒恢復系材料。

因此，本發(fā)明認為利用分子標記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結合的方法，既能快速篩選目的基因，又可以使選育的苗系更加符合育種目標。育種工作者可將其作為制備特殊優(yōu)異育種材料的一個重要手段。

3材料與方法

3.1材料與設計

所用F₂群體由恢復系812和優(yōu)良親本940雜交配制而成。812是由重慶市農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所辣椒室多年來制備的優(yōu)良恢復系，果形為長牛角形；940為本發(fā)明室多年選育的優(yōu)良自交系，果形為細牛角形。用分子標記輔助選擇在F₂群體中篩選含有恢復基因Rf的單株進行花藥培養(yǎng)。

3.2分子標記

利用已篩選到的CRF-SCAR標記篩選F₂群體中含恢復基因的單株進行花藥培養(yǎng)，進而用該標記鑒定花培再生株DH系是否含有恢復基因Rf，CRF-SCAR上游引物序列為：5′-GTACACACCACTCGTCGCTCCT-3′，下游引物序列為：5′-TTCTTGGGTCCCTTTCTTCCAA-3′。

3.3分子標記檢測

本發(fā)明中，辣椒葉片DNA采用CTAB法進行提取。含5×PCR緩沖液4μL、25mmol/LMgCl₂溶液1.2μL、dNTP溶液1.6μL、33ng/μL上下游引物各2.0μL、2U/μLTaq聚合酶(鼎國生物)0.5μL、ddH₂O 7μL和模板DNA 1.0μL。

3.4花藥培養(yǎng)方法

2014年春季在重慶市農業(yè)科學院試驗基地，上午9點前在目標單株上取處于單核靠邊期的花蕾置于冰盒中，帶回實驗室。在超凈工作臺上用70％酒精浸泡30s，之后用0.1％HgCL₂消毒7min，無菌水漂洗4次，然后放在無菌濾紙上瀝干水。在無菌條件下接種于胚狀體誘導培養(yǎng)基(MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L+AgNO₃4mg/L+活性炭0.4％)，9mm×9mm培養(yǎng)皿接6個花蕾的花藥，37℃高溫預處理5d。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。