本發(fā)明涉及細胞
技術領域：
，尤其涉及一種凍存液及其應用與凍存脂肪組織的方法。
背景技術：
：脂肪組織(adiposetissue)：主要由大量群集的脂肪細胞構成，聚集成團的脂肪細胞由薄層疏松結締組織分隔成小葉。脂肪組織中的網狀纖維很發(fā)達。黃(白)色脂肪組織呈黃色(在某些哺乳動物呈白色)，即通常所說的脂肪組織。它由大量單泡脂肪細胞集聚而成，脂肪細胞呈圓形或多邊形，細胞中央有一大脂滴，胞質呈薄層，位于細胞周緣，包繞脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡。胞核扁圓形，被脂滴推擠到細胞一側，連同部分胞質呈新月形。黃色脂肪組織主要分布在皮下組織、網膜和腸系膜等處，在成年男子一般約占體重的10％～20％，女人往往更多一些。脂肪組織是人體內最大的“能源庫”。具有貯存脂肪、保持體溫和參與脂肪代謝的功能。參與能量代謝，并具有產生熱量、維持體溫、緩沖保護和支持填充等作用。自體脂肪是一種理想的填充材料，幾乎可用于全身各個部位的軟組織缺損填充。盡管為了提高成活率和減少吸收率，國內外的研究人員進行了大量的研究，但目前移植后脂肪組織體積最終只能保持在移植時的50％左右。因此，臨床上仍需要通過少量、反復、多次移植提高脂肪移植成活率，以達到患者滿意的填充效果。但多次脂肪注射除增加了醫(yī)生的工作量外，對患者造成多次抽脂的痛苦、較高的風險及費用。如果能實現一次抽取足夠的脂肪體外長期冷凍儲存，需要時復溫培養(yǎng)后注射移植，則具有重要的臨床應用價值。目前尚未有專們用于脂肪組織凍存的方法，經典的凍存液配方是FBS+DMSO，主要用在細胞凍存上，但該凍存液對脂肪組織的保存效果并不穩(wěn)定。技術實現要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種凍存液及其應用與凍存脂肪組織的方法，以本發(fā)明提供的凍存液凍存脂肪組織，能夠保護脂肪組織的活性，經復融后脂肪組織中的細胞仍保持良好的分化能力。本發(fā)明提供的凍存液包括：基礎培養(yǎng)液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，NEAA)，包含7種細胞培養(yǎng)所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸。非必需氨基酸的添加能夠增加細胞的繁殖力，延長細胞的生存時間。NEAA可為自行配置也可為市場購得，本發(fā)明對此不做限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明采用的NEAA為購自sigma的100×NEAA。本發(fā)明中，NEAA的體積分數為1％。DMSO：二甲基亞砜，是一種含硫有機化合物，分子式為(CH3)2SO，常溫下為無色無臭的透明液體，是一種吸濕性的可燃液體。DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內外的水和離子平衡，本發(fā)明實施例中，DMSO的體積分數為10％～20％；一個具體實施例中，DMSO的體積分數為20％。丙三醇為無色味甜澄明黏稠液體。無臭，有暖甜味，俗稱甘油。具有保護細胞活性的作用。本發(fā)明實施例中，丙三醇的體積分數為5％～30％。一個具體實施例中，丙三醇的體積分數為15％。1,2-丙二醇的化學式為C3H8O2；其可與水、乙醇及多種有機溶劑混溶，具有保護細胞活性的作用。本發(fā)明實施例中，1,2-丙二醇的體積分數為5％～30％。一個具體實施例中，1,2-丙二醇的體積分數為15％。本發(fā)明實施例中，基礎培養(yǎng)液DMEM/F12。本發(fā)明所用的基礎培養(yǎng)液可為自制也可為購買獲得，本發(fā)明對此不做限定，其實施皆在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明實施例中，基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12。一些具體實施例中，本發(fā)明提供的凍存液包括：一個具體實施例中，本發(fā)明提供的凍存液包括：一個具體實施例中，本發(fā)明提供的凍存液包括：一個具體實施例中，本發(fā)明提供的凍存液包括：本發(fā)明提供的凍存液在脂肪組織凍存中的應用。本發(fā)明實施例中，以本發(fā)明提供的凍存液凍存脂肪組織，3個月后復蘇并進行原代分離培養(yǎng)，結果表明，復蘇后的脂肪組織原代分離獲得脂肪干細胞的成功率為100％。培養(yǎng)至第三代后，誘導脂肪干細胞向脂肪細胞分化。本發(fā)明還提供了一種凍存脂肪組織的方法，以本發(fā)明提供的凍存液與脂肪組織混合后，浸入液氮中。本發(fā)明實施例中，凍存液與脂肪組織的體積比為1：1。本發(fā)明提供了一種凍存液，其中包括基礎培養(yǎng)液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇，其對脂肪組織具有良好的保護作用，以本發(fā)明提供的凍存液對脂肪組織進行凍存后，再經復融的脂肪組織中，細胞活性保持良好。經原代分離培養(yǎng)，獲得脂肪干細胞的成功率為100％。附圖說明圖1示未經凍存的脂肪組織進行原代分離獲得P2代脂肪干細胞的顯微圖；其中，圖1-a示40放大；圖1-b示100倍放大；圖2示經實施例1凍存液保護下經凍存的脂肪組織復蘇后，進行原代分離獲得P2代脂肪干細胞的顯微圖；其中，圖2-a示40放大；圖2-b示100倍放大。具體實施方式本發(fā)明提供了一種凍存液及其應用與凍存脂肪組織的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。本發(fā)明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1～3按照表1配方配制凍存液，然后滅菌：表1實施例1～3NEAA體積分數DMSO丙三醇1,2-丙二醇DMEM/F12實施例110mL200mL150mL150mL490mL實施例210mL100mL300mL300mL290mL實施例310mL200mL50mL50mL690mL采集人脂肪組織30份，隨機分為3組，以等體積生理鹽水清洗2遍后500g離心5min，棄上層油脂層和下層生理鹽水層，用剪刀剪碎后過2mm篩網，然后各組脂肪組織分別以1:1的體積比與實施例1～3的凍存液混合，進入液氮中。保存3個月。對比例1～3按照表2配方配制凍存液，然后滅菌：表2對比例1～3NEAA體積分數DMSO丙三醇1,2-丙二醇DMEM/F12對比例110mL200mL----490mL對比例210mL--150mL150mL490mL對比例3--200mL150mL150mL490mL采集人脂肪組織30份，隨機分為3組，以等體積生理鹽水清洗2遍后500g離心5min，棄上層油脂層和下層生理鹽水層，用剪刀剪碎后過2mm篩網，然后各組脂肪組織分別以1:1的體積比與對比例1～3的凍存液混合，進入液氮中。保存3個月。實施例4取未經凍存的脂肪組織為對照組，進行原代分離，獲得P0代脂肪干細胞，在倒置顯微鏡下觀察。以實施例1～3和對比例1～3配置凍存液凍存后的脂肪組織，經復蘇后，進行原代分離，獲得P2代脂肪干細胞，在倒置顯微鏡下觀察(圖1)。原代分離的方法為：終濃度0.2％的I型膠原酶消化35min后1800RPM-5MIN離心，僅保留底部沉淀，生理鹽水清洗沉淀后接種培養(yǎng)得到P0細胞。統(tǒng)計分離成功率結果如表3：表3分離成功率分離成功率對照組100％實施例1100％實施例246.67％實施例336.67％對比例16.67％對比例20對比例330.00％結果表明，各實施例皆有著良好的分離成功率，其中以實施例1的配方分離成功率最佳，與其他實施例或對比例皆存在顯著性差異，p<0.05。取配方各組第3代細胞，消化后清洗3次，制成細胞懸液，加入抗體，流式細胞儀檢測分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表達情況。結果如表4：表4細胞免疫表型CD73CD90CD105CD11bCD19CD34CD45HLA-DR對照組99.10％100.00％100.00％0.21％1.11％0.00％0.00％0.00％實施例1100.00％99.98％99.65％0.00％0.01％0.00％0.00％0.00％實施例299.98％98.63％99.63％0.10％0.21％0.00％0.00％0.12％實施例399.12％100.00％100.00％0.25％0.36％0.00％0.00％0.23％對比例199.00％99.56％98.28％1.10％1.23％0.00％0.12％0.00％對比例2--------對比例3100.00％99.50％99.65％0.00％0.00％0.12％0.40％1.00％結果表明，采用本專利方案凍存后的脂肪組織復蘇后原代分離得到的細胞與原始組織得到的細胞在表面標記物上無差別。取配方各組第3代細胞，按2.5×104的細胞濃度接種于含有DMEM/F12+20％FBS培養(yǎng)基的24孔板中，至細胞80％融合時，更換為含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰島素、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培養(yǎng)液，每周換液2次，3周后用多聚甲醛固定，油紅O染色。檢測脂肪干細胞向脂肪細胞分化的能力。表5分化結果是否分化對照組是實施例1是實施例2是實施例3是對比例1是對比例2-對比例3是結果表明：采用本專利方案凍存后的脂肪組織復蘇后原代分離得到的細胞與原始組織得到的細胞在分化能力上無差別。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3