本發(fā)明涉及白穗柯無性繁殖技術(shù),尤其是一種白穗柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù):
白穗柯(Lithocarpus craibianus Barn. ),系殼斗科(Fagaceae)柯屬(Lithocarpus)喬木,喬木,高達(dá)20米。當(dāng)年生枝、葉背及雌花序軸均有棕黃色或灰白色蠟鱗層。葉革質(zhì),卵形或卵狀橢圓形,長12-19厘米,有時(shí)較短或更長,寬4-7厘米,稀更寬,頂部長尖,基部短尖至寬楔形,全緣,中脈的下段在葉面厚,葉脈約有8-12條,在葉面常呈裂槽狀凹陷,支脈不顯或隱約可見,嫩葉干后葉面常有油潤光澤,二年生葉則蒼暗;葉柄長1-2.5厘米。雄穗狀花序腋生,稀為圓錐花序,長達(dá)15厘米;雌花序的上部常著生少數(shù)雄花,長達(dá)30厘米,雌花3-5-7朵集生成簇,花柱長1-1.2毫米。殼斗圓球形或略扁,頂端常呈乳頭狀短凸起,徑15-20毫米,全包堅(jiān)果,偶有頂部邊緣開裂并反卷,故堅(jiān)果部分外露,小苞片三角形,鉆尖狀,伏貼于殼壁,覆瓦狀排列,分明,位于殼斗頂部的略狹長且向殼斗口部下彎,被黃棕色、細(xì)片狀、稍緊貼的蠟鱗;堅(jiān)果近圓球形,徑13-18毫米,被甚稀疏的細(xì)伏毛,頂部的毛較密,果臍凸起,占堅(jiān)果面積的1/3?;ㄆ?-9月,果次年同期成熟。產(chǎn)四川西南部、云南南部及西南部各地。生于1 500-2 700米山地雜木林中,多見于較干燥坡地,常因被砍伐,故生成灌木狀,通常為10 米上下的小喬木。老撾、泰國北部也有。
目前,白穗柯資源仍處于野生分布狀態(tài),但隨著保持植物多樣性的需求,規(guī)模化人工栽培白穗柯資源勢在必行。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速無性繁殖技術(shù),選擇白穗柯優(yōu)良家系或者無性系為材料,通過組織培養(yǎng)方法繁殖苗木,既可以滿足生產(chǎn)上的數(shù)量要求,又可保持母本性狀。組織培養(yǎng)過程中,初代培養(yǎng)是制約組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟,其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養(yǎng)基選擇以及培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體褐變、苗木玻璃化等重要問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種能克服芽誘導(dǎo)過程中外植體褐變以及玻璃化等問題,提高芽誘導(dǎo)率,出芽指數(shù)以及萌芽生長狀況,獲取數(shù)量多、質(zhì)量好的萌芽,從而滿足增殖培養(yǎng)的需要,促進(jìn)白穗柯組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立的白穗柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種白穗柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法,采用白穗柯基部萌條為外植體,通過外植體無菌處理后,將外植體接種于優(yōu)質(zhì)初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,置于適宜的溫度、濕度和光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)芽的萌發(fā);其操作步驟為,
(1)外植體選擇:選擇白穗柯基部萌發(fā)的半木質(zhì)化的萌條為外植體;
(2)外植體消毒及接種:將白穗柯萌條經(jīng)過洗潔精清洗,流水沖洗和化學(xué)試劑處理消毒后,剪切成莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中;
(3)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將接種后的外植體置于適宜室內(nèi)條件下培養(yǎng)。
以上所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為:1/3~1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0~2.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。
以上所述的改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為:NH4NO3 810 mg/L,CaCl2·2H2O 192 mg/L,MgSO4·7H20 300 mg/L,KH2PO4 250 mg/L,Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L,KI 0.83 mg/L,H3BO3 6.2 mg/L,MnSO4·H2O 22.4 mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L,CuSO4·5H2O 0.25 mg/L,Na2·EDTA 37.3 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L,肌醇85 mg/L,煙酸1.0 mg/L,鹽酸吡哆醇1.0 mg/L,鹽酸硫胺素2.0 mg/L,甘氨酸2.0 mg/L。
以上所述的萌條是長為6~9cm、直徑0.2~0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條。
以上步驟(2)所述的消毒及接種方法是將白穗柯萌條針葉剪去,置于三角瓶中,加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h,然后用無菌水清洗2次,將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min;再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5~4.0 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每瓶接種2個(gè)莖段。
以上步驟(3)所述的適宜室內(nèi)條件為:暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500~1000 lx,光照8~12h/d;培養(yǎng)溫度20±1℃,濕度為50~55 %。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果如下:
1、本發(fā)明采用1/3~1/2改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基,同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與白穗柯出芽相關(guān)的微量元素和有機(jī)成分,使得培養(yǎng)基更科學(xué),更有針對性,有效的克服了白穗柯組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)過程中易出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象,更易促使白穗柯芽誘導(dǎo)的發(fā)生,促進(jìn)了萌芽的生長速度和健壯度。
2、本發(fā)明以基部長6~9 cm長的半木質(zhì)化粗壯萌條作為外植體,保證了外植體較強(qiáng)的分生能力,促進(jìn)芽的誘導(dǎo);本發(fā)明在外植體采集后進(jìn)行洗凈、消毒,有效降低外植體的污染率,提高了出芽率。
3、本發(fā)明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃,濕度為50~55%,光照由暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到強(qiáng)度為500~1000 lx的室內(nèi)條件下培養(yǎng),溫度和濕度偏低,光照強(qiáng)度也不高的室內(nèi)條件,有利于減少芽誘導(dǎo)過程中玻璃化的發(fā)生。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1:
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為6~7cm、直徑0.2~0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去,置于三角瓶中,加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h,然后用無菌水清洗2次,將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min;再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為:1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為:NH4NO3 810 mg/L,CaCl2·2H2O 192 mg/L,MgSO4·7H20 300 mg/L,KH2PO4 250 mg/L,Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L,KI 0.83 mg/L,H3BO3 6.2 mg/L,MnSO4·H2O 22.4 mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L,CuSO4·5H2O 0.25 mg/L,Na2·EDTA 37.3 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L,肌醇100 mg/L,煙酸1.0 mg/L,鹽酸吡哆醇1.0 mg/L,鹽酸硫胺素2.0 mg/L,甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃,濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500 lx,光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例2:
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為7~8cm、直徑0.2~0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去,置于三角瓶中,加入體積濃度為2%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h,然后用無菌水清洗2次,將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min;再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為:1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為:NH4NO3 810 mg/L,CaCl2·2H2O 192 mg/L,MgSO4·7H20 300 mg/L,KH2PO4 250 mg/L,Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L,KI 0.83 mg/L,H3BO3 6.2 mg/L,MnSO4·H2O 22.4 mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L,CuSO4·5H2O 0.25 mg/L,Na2·EDTA 37.3 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L,肌醇100 mg/L,煙酸1.0 mg/L,鹽酸吡哆醇1.0 mg/L,鹽酸硫胺素2.0 mg/L,甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃,濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500lx,光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例3:
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為7~8cm、直徑0.3~0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去,置于三角瓶中,加入體積濃度為4%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h,然后用無菌水清洗2次,將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min;再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為:1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為:NH4NO3 810 mg/L,CaCl2·2H2O 192 mg/L,MgSO4·7H20 300 mg/L,KH2PO4 250 mg/L,Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L,KI 0.83 mg/L,H3BO3 6.2 mg/L,MnSO4·H2O 22.4 mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L,CuSO4·5H2O 0.25 mg/L,Na2·EDTA 37.3 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L,肌醇100 mg/L,煙酸1.0 mg/L,鹽酸吡哆醇1.0 mg/L,鹽酸硫胺素2.0 mg/L,甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃,濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx,光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例4:
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為8~9cm、直徑0.3~0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去,置于三角瓶中,加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h,然后用無菌水清洗2次,將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min;再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為:1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為:NH4NO3 810 mg/L,CaCl2·2H2O 192 mg/L,MgSO4·7H20 300 mg/L,KH2PO4 250 mg/L,Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L,KI 0.83 mg/L,H3BO3 6.2 mg/L,MnSO4·H2O 22.4 mg/L,ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L,CuSO4·5H2O 0.25 mg/L,Na2·EDTA 37.3 mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L,肌醇100 mg/L,煙酸1.0 mg/L,鹽酸吡哆醇1.0 mg/L,鹽酸硫胺素2.0 mg/L,甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃,濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx,光照8h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。