本發(fā)明涉及白穗柯無性繁殖技術(shù)，尤其是一種白穗柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
白穗柯（Lithocarpus craibianus Barn. ），系殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）喬木，喬木，高達(dá)20米。當(dāng)年生枝、葉背及雌花序軸均有棕黃色或灰白色蠟鱗層。葉革質(zhì)，卵形或卵狀橢圓形，長12-19厘米，有時(shí)較短或更長，寬4-7厘米，稀更寬，頂部長尖，基部短尖至寬楔形，全緣，中脈的下段在葉面厚，葉脈約有8-12條，在葉面常呈裂槽狀凹陷，支脈不顯或隱約可見，嫩葉干后葉面常有油潤光澤，二年生葉則蒼暗；葉柄長1-2.5厘米。雄穗狀花序腋生，稀為圓錐花序，長達(dá)15厘米；雌花序的上部常著生少數(shù)雄花，長達(dá)30厘米，雌花3-5-7朵集生成簇，花柱長1-1.2毫米。殼斗圓球形或略扁，頂端常呈乳頭狀短凸起，徑15-20毫米，全包堅(jiān)果，偶有頂部邊緣開裂并反卷，故堅(jiān)果部分外露，小苞片三角形，鉆尖狀，伏貼于殼壁，覆瓦狀排列，分明，位于殼斗頂部的略狹長且向殼斗口部下彎，被黃棕色、細(xì)片狀、稍緊貼的蠟鱗；堅(jiān)果近圓球形，徑13-18毫米，被甚稀疏的細(xì)伏毛，頂部的毛較密，果臍凸起，占堅(jiān)果面積的1/3?；ㄆ?-9月，果次年同期成熟。產(chǎn)四川西南部、云南南部及西南部各地。生于1 500-2 700米山地雜木林中，多見于較干燥坡地，常因被砍伐，故生成灌木狀，通常為10 米上下的小喬木。老撾、泰國北部也有。
目前，白穗柯資源仍處于野生分布狀態(tài)，但隨著保持植物多樣性的需求，規(guī)模化人工栽培白穗柯資源勢在必行。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速無性繁殖技術(shù)，選擇白穗柯優(yōu)良家系或者無性系為材料，通過組織培養(yǎng)方法繁殖苗木，既可以滿足生產(chǎn)上的數(shù)量要求，又可保持母本性狀。組織培養(yǎng)過程中，初代培養(yǎng)是制約組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟，其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養(yǎng)基選擇以及培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體褐變、苗木玻璃化等重要問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種能克服芽誘導(dǎo)過程中外植體褐變以及玻璃化等問題，提高芽誘導(dǎo)率，出芽指數(shù)以及萌芽生長狀況，獲取數(shù)量多、質(zhì)量好的萌芽，從而滿足增殖培養(yǎng)的需要，促進(jìn)白穗柯組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立的白穗柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種白穗柯初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法，采用白穗柯基部萌條為外植體，通過外植體無菌處理后，將外植體接種于優(yōu)質(zhì)初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于適宜的溫度、濕度和光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)；其操作步驟為，
（1）外植體選擇：選擇白穗柯基部萌發(fā)的半木質(zhì)化的萌條為外植體；
（2）外植體消毒及接種：將白穗柯萌條經(jīng)過洗潔精清洗，流水沖洗和化學(xué)試劑處理消毒后，剪切成莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
（3）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將接種后的外植體置于適宜室內(nèi)條件下培養(yǎng)。
以上所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0～2.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。
以上所述的改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3 810 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
以上所述的萌條是長為6~9cm、直徑0.2～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條。
以上步驟（2）所述的消毒及接種方法是將白穗柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5~4.0 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
以上步驟（3）所述的適宜室內(nèi)條件為：暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培養(yǎng)溫度20±1℃，濕度為50~55 %。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果如下：
1、本發(fā)明采用1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與白穗柯出芽相關(guān)的微量元素和有機(jī)成分，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對性，有效的克服了白穗柯組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)過程中易出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象，更易促使白穗柯芽誘導(dǎo)的發(fā)生，促進(jìn)了萌芽的生長速度和健壯度。
2、本發(fā)明以基部長6~9 cm長的半木質(zhì)化粗壯萌條作為外植體，保證了外植體較強(qiáng)的分生能力，促進(jìn)芽的誘導(dǎo)；本發(fā)明在外植體采集后進(jìn)行洗凈、消毒，有效降低外植體的污染率，提高了出芽率。
3、本發(fā)明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃，濕度為50~55%，光照由暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到強(qiáng)度為500～1000 lx的室內(nèi)條件下培養(yǎng)，溫度和濕度偏低，光照強(qiáng)度也不高的室內(nèi)條件，有利于減少芽誘導(dǎo)過程中玻璃化的發(fā)生。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為6~7cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3 810 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500 lx，光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例2：
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為7~8cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為2%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3 810 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例3：
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為7~8cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為4%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3 810 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。
實(shí)施例4：
選擇白穗柯基部萌發(fā)、長為8~9cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將白穗柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。
所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0mg/L+維生素C10mg/L+乳糖5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH4NO3 810 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照8h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。