一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家禽轉基因【技術領域】，具體涉及一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法。屬于禽蛋接種實驗的一種輔助方法，本發(fā)明的特征在于：將種蛋消毒后水平放置2h，在種蛋赤道面粘貼一塊透明膠帶；用眼科剪在粘貼了膠帶的赤道面剪切開窗，窗口直徑為1-1.2cm，從銳端向鈍端剪切再回到銳端，保留開窗的蛋殼粘連在赤道面靠近銳端處，用眼科鑷去除殼膜；通過窗口進行胚胎操作，再將粘連的蛋殼復原，并粘貼一塊透明膠帶封口，種蛋放回孵化箱孵化和后續(xù)實驗。本發(fā)明提供的種蛋開窗與封口方法，操作簡單，方便快捷，不需要特殊的技術和對儀器設備的依賴，適用于多種不同的胚胎操作，封口嚴密，有效提高了轉基因禽制備的效率。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于家禽轉基因【技術領域】，具體涉及一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封 口方法。實質上屬于家禽轉基因【技術領域】的一種輔助方法。與禽蛋接種實驗相關。

【背景技術】
[0002] 隨著分子生物學技術的發(fā)展及一系列模式生物基因組計劃的相繼完成，生命科學 研宄已取得了重大突破，中國在生命科學領域也做出了巨大的貢獻。目前，多種動物的全基 因組測序工作已完成，然而基因組序列測定的完成僅僅是基因組計劃的第一步，更大的挑 戰(zhàn)在于如何確定基因的功能并闡述其調控的機理。禽類作為科學研宄中的一種模式生物， 其胚胎對于基因功能的研宄有著無法取代的優(yōu)點。隨著新技術的發(fā)展及雞、鴨等禽類基因 組序列的完成，禽類胚胎在發(fā)育生物學、遺傳學、免疫學等研宄領域的重要性日益凸顯，推 動了禽類功能基因研宄工作的開展。利用禽類胚胎模型進行基因功能的研宄，首先要解決 在胚胎中實現外源基因轉移的問題。
[0003] 種蛋開窗是實現外源基因轉移的第一步工作，開窗采用的方法、開窗部位等均嚴 重影響胚胎的存活率及后期的發(fā)育情況。種蛋開窗部位主要包括銳端開窗、鈍端開窗和赤 道面開窗，其中最常用的是赤道面開窗，因為在赤道面開窗，胚胎與眼睛的距離較近，操作 方便，并能保持胚胎氣室的完整性，利于種蛋的孵化和胚胎的發(fā)育。種蛋的開窗方法主要集 中在機械開窗法中機械的選擇，如馬達磨輪、鉆孔器、手術刀片、自制開蛋工具等。但總體來 說，這些機械開窗法操作費時，有些還需要特殊的工具如鉆孔器等，對胚胎的機械損傷大， 且容易破壞蛋殼及殼膜，導致胚胎存活率不高。另外，開窗后封口時，常用蛋殼膜或石蠟封 口，費時費力；用透明膠帶或封口膜封口，密封不嚴，導致種蛋孵化過程中蛋清外溢現象的 出現，嚴重降低存活率。總的來說，目前的方法存在一些缺陷，可利用率不高。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗 封口的方法，該方法適用于在雞、鴨等禽類胚胎中進行基因功能的研宄及轉基因禽的制備， 整個操作過程簡單，無須專門的儀器設備，無須特殊的技術要求，可同時進行批量處理，后 期胚胎存活率顯著提高。
[0005] 具體地，本發(fā)明通過以下技術方案實現：
[0006] 一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗與封口的方法，包括開窗和胚胎操作，其特征 在于：將種蛋消毒后水平放置2h，使胚盤浮于赤道面，在種蛋赤道面粘貼一塊用于開口處 的透明膠帶；用眼科剪在粘貼了膠帶的赤道面剪切開窗，從銳端向鈍端剪切再回到銳端，保 留開窗的蛋殼粘連在赤道面靠近銳端處，用眼科鑷去除殼膜；通過窗口進行胚胎操作，再將 粘連的蛋殼用一塊用于封口處的透明膠帶封口復原，將操作后的種蛋放回孵化箱孵化；
[0007] 用于開口處的透明膠帶長、寬均為3-4cm，粘貼位置在種蛋赤道面。
[0008] 所述剪切開窗的窗口直徑為1-1. 2cm，以便于胚胎操作為宜。
[0009] 所述剪切開窗的剪切方向為：從銳端向鈍端再回到銳端，保留開窗的蛋殼粘連在 赤道面靠近銳端處。
[0010] 所述胚胎操作包括脂質體轉染、電穿孔、病毒感染、卵黃囊血管注射、藥物處理。
[0011] 所述封口是將剪切開窗的蛋殼用透明封口膠帶原位復原。用于封口處的透明膠帶 長、寬均為2-3cm。
[0012] 本發(fā)明的方法適用于雞、鴨、鵝或其它禽類的種蛋的開窗與封口，以方便轉基因禽 制備的種蛋開窗封口。
[0013] 具體地，本發(fā)明的步驟如下所述：
[0014] 一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗、封口方法，包括開窗和胚胎操作，本發(fā)明的要 點在于：將種蛋消毒后水平放置2h，使胚盤浮于赤道面，在種蛋赤道面粘貼一塊透明開口 膠帶；用眼科剪在粘貼了膠帶的赤道面剪切開窗，從銳端向鈍端剪切再回到銳端，保留開窗 的蛋殼粘連在赤道面靠近銳端處，用眼科鑷去除殼膜；通過窗口進行胚胎操作，再將粘連的 蛋殼用一塊透明封口膠帶封口復原，將操作后的種蛋放回孵化箱孵化；
[0015] 其中：用于開口處的透明膠帶長、寬均為3-4cm，粘貼位置在種蛋赤道面。
[0016] 其中：所述剪切開窗的窗口直徑為1-1. 2cm，以便于胚胎操作為宜。
[0017] 所述剪切開窗的剪切方向為：從銳端向鈍端再回到銳端，保留開窗的蛋殼粘連在 赤道面靠近銳端處。
[0018] 所述胚胎操作包括脂質體轉染、電穿孔、病毒感染、卵黃囊血管注射和藥物處理。
[0019] 其中：所述封口是將剪切開窗的蛋殼原位復原。
[0020] 其中：用于封口處的透明膠帶長、寬均為2-3cm。
[0021] 其中：所述種蛋為雞、鴨、鵝或其它禽類的種蛋。
[0022] 本發(fā)明提供的種蛋開窗封口方法，操作簡單，方便快捷，沒有特殊的技術要求；成 本低，對儀器設備工具要求低，只需常用的透明膠帶、眼科剪和眼科鑷即可進行；可以同時 進行批量處理，不同批次之間的處理效果不會產生較大差異；既適用于新鮮種蛋，也可用于 已孵化的種蛋；開窗后可用于不同的胚胎操作，如脂質體轉染、電穿孔、病毒感染、卵黃囊血 管注射、藥物處理等；用眼科剪在粘貼了透明開口膠帶的蛋殼上剪切，可以準確控制開口的 大小，減少其他部位蛋殼裂痕的產生，保證整個蛋殼的完整性，對胚胎的機械損傷小，同時 也保證了切口的平滑性；已粘貼了膠帶的蛋殼再用透明封口膠帶封口時，容易粘貼，且剪切 開窗的蛋殼仍粘連在赤道面靠近銳端處，封口嚴密，降低了胚胎后續(xù)孵化過程中蛋清流出、 水分蒸發(fā)的可能性；直接用膠帶封口，省去了準備封口蛋殼膜的繁瑣過程。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1 :是本發(fā)明提供的種蛋開窗封口方法的步驟圖。圖1中的A、B、C、D、E、F圖依 次展示的是：消毒平放、粘貼膠帶、剪切開窗、去除殼膜、胚胎操作、膠帶封口等8個主要實 驗程序和操作的直觀圖像。

【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[0025] 膠帶剪切法開窗步驟：
[0026] (1)消毒平放：取新鮮種鴨蛋（由武漢市畜牧獸醫(yī)科學研宄所金口育種場提供） 消毒后水平放置2h，使胚盤浮于赤道面；
[0027] (2)粘貼膠帶：在種蛋赤道面粘貼一塊透明膠帶，用于開口粗的透明膠帶長、寬均 為 3_4cm;
[0028] (3)剪切開窗：用眼科剪在赤道面貼膠帶處剪切開窗，窗口直徑為1-1. 2cm，從銳 端向鈍端剪切，再回到銳端，保留開窗的蛋殼粘連在赤道面靠近銳端處；
[0029] (4)去除殼膜：用眼科鑷小心去除殼膜，觀察種蛋受精情況，若為無精蛋，則棄用； [0030] (5)封口孵化：將粘連的蛋殼復原，并粘貼一塊用于封口處的透明膠帶封口，透明 膠帶長、寬均為2-3cm，種蛋放入孵化箱孵化。
[0031] 實施例2
[0032] (1)開窗處理：
[0033] 1)處理組1 :機械開窗+膠帶封口，采用簡單的機械開窗法，用手術刀片在種鴨蛋 (由武漢市畜牧獸醫(yī)科學研宄所金口育種場提供）赤道面刻出直徑為Icm的圓形窗口劃痕， 用眼科剪去除蛋殼，用透明封口膠帶封口，將種蛋進行孵化；
[0034] 2)處理組2 :鹽酸腐蝕開窗+膠帶封口，采用具有揮發(fā)性的濃鹽酸腐蝕蛋殼開窗， 滴加少量濃鹽酸在赤道面至蛋殼被腐蝕，無菌磷酸鹽緩沖液（PBS配制方法：稱取氯化鈉 8g、氯化鉀0. 2g、磷酸二氫鉀0. 24g、十二水磷酸氫二鈉3. 63g溶于800mL雙蒸水中，用鹽酸 調節(jié)pH值至7. 4,加水定容至lOOOmL，高壓滅菌，室溫保存）沖洗，用透明封口膠帶封口，將 種蛋進行孵化；
[0035] 3)處理組3 :膠帶剪切開窗+膠帶封口，采用本發(fā)明提供的膠帶剪切法開窗，用透 明封口膠帶封口，將種蛋進行孵化；
[0036] 4)處理組4 :膠帶剪切開窗+封口膜封口，采用本發(fā)明提供的膠帶剪切法開窗，用 封口膜封口，將種蛋進行孵化；
[0037] 5)對照組：種蛋正常孵化。
[0038] (2)結果分析
[0039] 不同開窗封口方法的比較發(fā)現，膠帶剪切法開窗胚胎成活率較高，在60%以上。 [0040] 表1不同開窗/封口方法對胚胎成活率的影響
[0041]

【權利要求】
1. 一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗、封口方法，包括開窗和胚胎操作，其特征在于： 將種蛋消毒后水平放置2h，使胚盤浮于赤道面，在種蛋赤道面粘貼一塊透明開口膠帶；用 眼科剪在粘貼了膠帶的赤道面剪切開窗，從銳端向鈍端剪切再回到銳端，保留開窗的蛋殼 粘連在赤道面靠近銳端處，用眼科鑷去除殼膜；通過窗口進行胚胎操作，再將粘連的蛋殼用 一塊透明封口膠帶封口復原，將操作后的種蛋放回孵化箱孵化。
2. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于用 于開口處的透明開口膠帶長、寬均為3-4cm，粘貼位置在種蛋赤道面。
3. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于所 述剪切開窗的窗口直徑為1-1. 2cm，以便于胚胎操作為宜。
4. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于所 述剪切開窗的剪切方向為：從銳端向鈍端再回到銳端，保留開窗的蛋殼粘連在赤道面靠近 銳端處。
5. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于所 述胚胎操作包括脂質體轉染、電穿孔、病毒感染、卵黃囊血管注射或藥物處理。
6. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于所 述封口是將剪切開窗的蛋殼原位復原。
7. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于用 于封口處的透明封口膠帶長、寬均為2-3cm。
8. 根據權利要求1所述的一種用于轉基因禽制備的種蛋開窗封口方法，其特征在于所 述種蛋為雞、鴨、鵝或其它禽類的種蛋。
【文檔編號】A01K45/00GK104472397SQ201410827733
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月26日 優(yōu)先權日:2014年12月26日
【發(fā)明者】龔萍, 楊永平, 楊宇, 龔炎長, 葉勝強, 王麗霞, 鄧兵, 喻婷, 童偉文, 劉武, 冉志平 申請人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所