一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，屬于遺傳轉化方法【技術領域】。本發(fā)明通過配制特異的農桿菌感染的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基；將帶有雙元載體質粒pCB4-bar的農桿菌通過真空滲透感染剛萌發(fā)的花粉，再將感染后的花粉授粉于柱頭，通過花粉管途徑將遺傳物質傳遞給子代，獲得轉基因植株。本實驗以抗除草劑基因bar作為目的基因，通過農桿菌轉染花粉法轉化棉花，同時優(yōu)化部分影響轉化的因素，篩選出適合轉化的最適條件，優(yōu)化后的農桿菌感染花粉的轉化率可達1.3％，獲得的轉化后代植株Basta抗性分離符合3:1分離規(guī)律，該方法操作簡單，無設備和儀器的特殊要求，為棉花轉基因育種提供技術支持。
【專利說明】一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種遺傳轉化方法，特別涉及一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化 和篩選方法。

【背景技術】
[0002] 基因工程技術可以突破物種間的遺傳障礙，超越物種間的不親和性，創(chuàng)造出人們 所需要的新品種，大大拓寬棉花遺傳改良的途徑。隨著基因轉化方法的深入和完善，眾多方 法應用于棉花，如農桿菌介導法、花粉管通道法、基因槍法、顯微激光法，以及農桿菌和基因 槍結合轉化方法等?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ俏覈芄庥钕壬?978年提出的一套自花授粉后外源 DNA導入植物的轉基因技術，該方法避開了棉花組織培養(yǎng)的體細胞胚胎體發(fā)生和植株再生 的障礙且操作簡便，所需時間短。但不足是其轉化機理不確定，轉化效率低且不穩(wěn)定。
[0003] 因此，花粉管通道法結合農桿菌介導法，可以既不依賴于植物組織培養(yǎng)和誘導再 生植株再生等人工培養(yǎng)過程，同時又利用農桿菌對植物侵染的高效性優(yōu)勢，在植物基因轉 化中備受研究工作者的青睞。Tjokrokusumo等用農桿菌真空滲透轉染花粉方法成功轉化矮 牽牛。在棉花中，Chen等用農桿菌浸漬柱頭后再進行授粉，得到了 0. 46%?0. 93%的轉化 率；李曉等和張燕紅等分別用農桿菌真空滲透轉化棉花花粉，然后用處理花粉對棉花授粉， 均獲得了轉基因植株；彭珍子通過農桿菌子房注射對棉花進行活體轉化，在不同品種的棉 花中轉基因效率平均達2. 78%。提高農桿菌轉染棉花花粉的轉化效率極其重要。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的缺點與不足，提供一種用農桿菌轉染棉 花花粉的遺傳轉化和篩選方法。通過對轉染方法的改進極大的提高了轉化效率。
[0005] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和 篩選方法，包括以下步驟：
[0006] 1)配制農桿菌感染的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基：花粉萌發(fā)培養(yǎng)基包含的組分為0. 5mMKN03， 2.7禮11^04，1.71111113803,0.511111%50 4.71120，1.511]\16八3，口117.5，質量濃度為40%?45% 的蔗糖；花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配制后高壓滅菌，然后分裝獲得液體培養(yǎng)基，封口膜（parafilm)密 封，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0007] 2)轉化方法：挑取帶有雙元載體質粒pCB4_bar的農桿菌，在YEP液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉速180?220rpm，28°C，振蕩培養(yǎng)過夜；當菌液的0D_值為0. 6? 0. 8時，3000r/min離心lOmin收集菌體，重懸于步驟2)配制好的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中；收集 新鮮的棉花花粉浸泡于該菌液中，花粉濃度為l〇〇g/L，加入1%。體積比的Tween-20 (表面活 性劑）并抽真空，壓力_80Pa，持續(xù)20min ;將浸過農桿菌的花粉用毛筆涂抹于去雄過的棉花 柱頭，然后在柱頭上套上一端封閉的麥管；待棉花種子成熟后，收集棉花種子；
[0008] 3)轉基因棉苗的篩選：將步驟2)獲得的棉花種子播種后，待棉花幼苗進入三片真 葉期時，采用〇.3ml/L濃度的Basta溶液進行涂抹篩選，3d后觀察涂抹葉片未出現(xiàn)壞死斑點 的植株，確認為轉化成功的轉基因棉苗。
[0009] 步驟1)中所述的高壓滅菌優(yōu)選為121°C條件下滅菌20分鐘；
[0010] 步驟2)所述的YEP液體培養(yǎng)基的制備為：取胰蛋白胨10g;酵母提取物lg; MgS0 40. 5g和鹿糖5g定溶至1L水中，用5mmol/L NaOH調pH至7. 0,高壓滅菌。
[0011] 步驟2)中所述的重懸，采用100mL菌液（0D600 = 0? 6?0? 8)在3000r/min離心 lOmin后重新懸浮于100mL花粉培養(yǎng)基。
[0012] 步驟2)中所述的雙元載體質粒pCB4-bar為包括抗除草劑基因bar，CaMV35S啟動 子及NOS終止子的pCB4載體。外源基因bar基因，來源于吸水鏈霉菌（streptomyces hy hygroscopieus)，對除草劑PPT(phosphinothricin)具有抗性。質粒的具體信息參見文獻： 唐微等"轉Bar基因抗除草劑水稻的培育"，湖北農業(yè)科學，2007, 46 (4) :488-490。
[0013] 步驟2)中所述的農桿菌優(yōu)選為農桿菌菌株LBA4404 ;
[0014] 步驟2)中所述的新鮮的棉花花粉優(yōu)選為陸地棉'Coker312'自交品系的花粉；所 述的新鮮的棉花花粉是指將頭天傍晚采集的次日將開花的花蕾，置4°C冰箱中保存，于次日 7?8時取已自然散粉的花粉用于轉化；或當天12?14小時開的新鮮受體材料的花粉。
[0015] 步驟2)中所述的花粉涂抹去雄過的棉花柱頭優(yōu)選在晴朗天氣的上午10 :00? 10:30的時間進行涂抹。
[0016] 步驟3)中所述的Basta的商品名為Finale，有效成份為5. 78 %的草銨膦 (glufosinate-ammonium)〇
[0017] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0018] 本發(fā)明的花粉粒農桿菌轉染法，能巧妙地利用了植物自身的生殖系統(tǒng)--花粉管 通道作為載體，從而克服了多數(shù)轉化系統(tǒng)轉化受體再生難的技術障礙。結果表明，本發(fā)明優(yōu) 化的農桿菌感染花粉的轉化率可達1. 3%，獲得的轉化后代植株Basta抗性分離符合3:1 分離規(guī)律，該方法操作簡單，無設備和儀器的特殊要求?；ǚ哿＾r桿菌轉染法避免了傳統(tǒng)的 棉花子房注射法導致的裸露DNA整合機制不很明確的缺點，所需要的轉化時間與子房注射 DNA法大致相同，重復性強，是一種經濟有效的棉花外源基因轉化的實用方法。
[0019] 本發(fā)明的農桿菌轉染花粉法是用農桿菌真空滲透感染剛萌發(fā)的花粉，再將感染后 的花粉授粉于柱頭，通過花粉管途徑將遺傳物質傳遞給子代，獲得轉基因植株。本實驗以抗 除草劑基因bar作為目的基因，通過農桿菌轉染花粉法轉化棉花，同時優(yōu)化部分影響轉化 的因素，篩選出適合轉化的最適條件，為棉花轉基因育種提供技術支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是質粒pCB4-bar的物理圖譜；
[0021] 圖2是不同蔗糖濃度對花粉生活力的影響圖；
[0022] 圖3是抗除草劑（Basta)涂抹轉化和非轉化植株葉片抗性和敏感反應圖；其中a 為轉bar基因棉；b為對照（Basta涂抹處理后7d);
[0023] 圖4是轉bar基因植株的PCR檢測電泳圖；其中：泳道M:DL2000marker ;泳道P : 陽性對照；泳道CK :陰性對照；泳道1-22 :花粉粒農桿菌轉染法獲得的轉化植株。

【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0025] 農桿菌菌株和受體材料：
[0026] 本研究所用的菌株為帶有雙元載體質粒pCB4_bar的農桿菌菌株LBA4404,該質粒 包括抗除草劑基因bar，CaMV35S啟動子及N0S終止子（質粒結構圖見圖1)。受體材料為 陸地棉'Coker312'自交品系。
[0027] 上述的雙元載體質粒pCB4_bar的外源基因bar基因來源于吸水鏈霉菌 (streptomyceshyhygroscopieus)，對除草劑PPT(phosphinothricin)具有抗性。質粒的 具體信息參見文獻：唐微等轉Bar基因抗除草劑水稻的培育，湖北農業(yè)科學，2007, 46 (4): 488-490。
[0028] BLOCKMD,BOTTERMANJ,VANDEWIELEM,etal.Engineeringherbicide resistanceinplantsbyexpressionofadetoxifyingenzyme[J].EMB0 J. 1987,6:2513-2518.
[0029] THOMPSONCJ,M0VVANR,CRAMERIR,etal.Characterizationofthe herbicide-resistancegeneBarfromstreptomyceshygroscopicus[J].EMB0 J. 1987, 6:2519-2523.
[0030] 實施例1
[0031] 一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，包括以下步驟：
[0032] 1)配制農桿菌感染的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基：花粉萌發(fā)培養(yǎng)基包含的組分為0. 5mMKN03， 2. 7mMMnS04，l. 7mMH3B03,0. 5mMMgS04 ? 7H20，1. 5iiMGA3，pH7. 5,分別加入 7 個不同濃度 的蔗糖處理，即質量濃度為0 %、10 %、25 %、35 %、40 %、45 %和50 %的蔗糖；花粉萌發(fā)培養(yǎng) 基配制后高壓滅菌，然后分裝獲得液體培養(yǎng)基，封口膜（parafilm)密封，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0033] 2)轉化方法：挑取帶有雙元載體質粒pCB4_bar的農桿菌，在YEP液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉速180?220rpm，28°C，振蕩培養(yǎng)過夜；；當菌液的0D_值為0. 6? 0. 8時，3000r/min離心10min收集菌體，重懸于步驟2)配制好的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中；收集 新鮮的棉花花粉浸泡于該菌液中，花粉濃度為l〇〇g/L，加入1%。體積比的Tween-20 (表面活 性劑）并抽真空，壓力_80Pa，持續(xù)20min ;在晴朗天氣的上午10-10:30,將浸過農桿菌的花 粉用毛筆涂抹于去雄過的棉花柱頭，然后在柱頭上套上一端封閉的麥管，各處理300朵花， 重復3次，掛牌標記；
[0034] 3)轉基因棉苗的篩選：將步驟2)獲得的棉花種子播種后，待棉花幼苗進入三片真 葉期時，采用〇.3ml/L濃度的basta溶液進行涂抹篩選，3d后觀察涂抹葉片未出現(xiàn)壞死斑點 的植株，確認為轉化成功的轉基因棉苗。
[0035] 步驟1)所述的高壓滅菌優(yōu)選為121°C條件下滅菌20分鐘；
[0036] 步驟2)所述的YEP液體培養(yǎng)基的制備為：取胰蛋白胨10g;酵母提取物lg; MgS0 40. 5g ;鹿糖5g ;定溶至1L，用5mmol/L NaOH調pH至7. 0,高壓滅菌。
[0037] 步驟2)中所述的重懸，采用100mL菌液（0D600 = 0. 6?0. 8)在3000r/min離心 10min后重新懸浮于100mL花粉培養(yǎng)基。
[0038]步驟2)所述的雙元載體質粒pCB4_bar為包括抗除草劑基因bar，CaMV35S啟動子 及N0S終止子的pCB4載體，結構如圖1所示。
[0039] 步驟2)所述的農桿菌優(yōu)選為農桿菌菌株LBA4404 ;
[0040] 步驟2)中所述的雙元載體質粒pCB4-bar為包括抗除草劑基因bar，CaMV35S啟動 子及NOS終止子的pCB4載體。外源基因bar基因，來源于吸水鏈霉菌（streptomyces hy hygroscopieus)，對除草劑PPT(phosphinothricin)具有抗性。質粒的具體信息參見文獻： 唐微等"轉Bar基因抗除草劑水稻的培育"，湖北農業(yè)科學，2007, 46 (4) :488-490。
[0041] 對步驟1)中7種不同蔗糖的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基，采用聯(lián)苯胺一甲萘酚反應法測定培 養(yǎng)基中花粉生活力，具體檢測步驟為：（1)稱取〇. 2g聯(lián)苯酚溶于100mL50%酒精中，棕色瓶 避光保存；（2)稱0. 15g甲萘酚溶于100mL50%酒精中，
[0042] 棕色瓶避光保存；（3)稱0? 25g Na2C03溶于100mL蒸餾水中。然后按（1) (2) (3) =1:1:1混合搖勻后使用，將上述溶液與H202以2:1的比例混合，將花粉浸泡在該溶液5min 后在顯微鏡下觀察顏色。顏色深且形態(tài)正常的花粉被視為有生活力的花粉，顏色淺、無色或 形態(tài)異常的花粉為弱生活力和無生活力的花粉。
[0043] 然后在顯微鏡下觀察花粉粒萌發(fā)率和破損率，確定最佳蔗糖濃度，檢測結果如圖 2所示，在不含蔗糖的花粉萌發(fā)培養(yǎng)液中，棉花花粉的破損率為48. 6%，隨著蔗糖濃度逐漸 增加，花粉的破損率呈逐漸下降趨勢，直到在50%蔗糖濃度，破損率下降到5. 8%。而花粉 萌發(fā)率在對照無蔗糖培養(yǎng)液中為2. 3%，隨著蔗糖濃度的增加，花粉萌發(fā)率先在蔗糖濃度為 40 %時達到最大值為65. 7 %，后逐漸下降。結果表明，40 %和45 %的蔗糖溶液能保持花粉 滲透壓的動態(tài)平衡，可以最大限度的保存花粉。
[0044] 選取40%和45%蔗糖的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基按照步驟2)進行農桿菌感染花粉，檢測 不同花粉轉染處理的效果，從表1可以看出，處理①獲得的種子數(shù)、結鈴率和轉化率均高于 處理②方式，處理①的轉化率達1. 3%，但與處理②的轉化率1. 1%相比差異不顯著。
[0045] 表1不同花粉感染處理的轉化效果
[0046]

【權利要求】
1. 一種用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 配制農桿菌感染的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基：花粉萌發(fā)培養(yǎng)基包含的組分為0. 5mMKN03， 2.7禮11^04，1.71111113803,0.511111%50 4.71120，1.511]\16八3，口117.5，質量濃度為40%?45% 的蔗糖；花粉萌發(fā)培養(yǎng)基配制后高壓滅菌，然后分裝獲得液體培養(yǎng)基，封口膜密封，4°C保存 備用； 2) 轉化方法：挑取帶有雙元載體質粒pCB4-bar的農桿菌，在YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為搖床轉速180?220rpm，28°C，振蕩培養(yǎng)過夜；當菌液的0D6(I(I值為0? 6?0? 8 時，3000r/min離心lOmin收集菌體，重懸于步驟2)配制好的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中；收集新鮮 的棉花花粉浸泡于該菌液中，花粉濃度為l〇〇g/L，加入1%。體積比的Tween-20并抽真空，壓 力-80Pa，持續(xù)20min ;將浸過農桿菌的花粉用毛筆涂抹于去雄過的棉花柱頭，然后在柱頭 上套上一端封閉的麥管；待棉花種子成熟后，收集棉花種子； 3) 轉基因棉苗的篩選：將步驟2)獲得的棉花種子播種后，待棉花幼苗進入三片真葉期 時，采用〇.3ml/L濃度的Basta溶液進行涂抹篩選，3d后觀察涂抹葉片未出現(xiàn)壞死斑點的植 株，確認為轉化成功的轉基因棉苗。
2. 根據(jù)權利要求1所述的用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，其特征在 于：步驟1)中所述的高壓滅菌為121°C條件下滅菌20分鐘。
3. 根據(jù)權利要求1所述的用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，其特征在 于：步驟2)所述的YEP液體培養(yǎng)基的制備為：取胰蛋白胨10g ;酵母提取物lg ;MgS04 0. 5g 和鹿糖5g定溶至1L水中，用5mmol/L NaOH調pH至7. 0,高壓滅菌。
4. 根據(jù)權利要求1所述的用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，其特征在 于：步驟2)中所述的農桿菌為農桿菌菌株LBA4404。
5. 根據(jù)權利要求1所述的用農桿菌轉染棉花花粉的遺傳轉化和篩選方法，其特征在 于：步驟2)中所述的新鮮的棉花花粉為陸地棉'Coker312'自交品系的花粉。
【文檔編號】A01H5/00GK104450778SQ201410736696
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權日:2014年12月5日
【發(fā)明者】蔣玉蓉, 祝水金 申請人:浙江農林大學