葡聚糖酶Cel16A及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了葡聚糖酶Cel16A及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從特異腐質(zhì)霉中分離到葡聚糖酶Cel16A編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.3所示，其所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No.4所示；本發(fā)明公開了成熟的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了含有所述基因的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明葡聚糖酶最適pH為5.5，在pH 4.0-10.0之間均很穩(wěn)定，最適溫度為55℃；本發(fā)明葡聚糖酶Cel16A穩(wěn)定性好，酶活高，能夠高效降解葡聚糖、地衣多糖或昆布多糖，可應(yīng)用于釀酒、紡織、飼料或能源工業(yè)等領(lǐng)域。
【專利說明】葡聚糖酶Cel16A及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及葡聚糖酶，尤其涉及從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分離的葡 聚糖酶Cell6A，本發(fā)明還涉及該酶的編碼基因及其應(yīng)用，屬于葡聚糖酶的分離及應(yīng)用技術(shù) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素類物質(zhì)包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是自然界中最豐富的可再生資源。 纖維素是由D-吡喃式葡萄糖以0-1，4糖苷鍵連接而成的線性大分子聚合物，是植物細(xì)胞 壁的主要成分。木質(zhì)素是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過碳-碳鍵和醚鍵連接而成的具有三度空 間結(jié)構(gòu)的芳香性高聚物，形成纖維支架，具有強(qiáng)化木質(zhì)纖維的作用。半纖維素由雜聚多糖 組成，根據(jù)主鏈組成占多數(shù)的糖的種類各有不同，可分為葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等 (SchulzeE1891.BerDtschChemGes24, 2277-2287.)。其中 葡聚糖是植物細(xì)胞壁中 的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，富含于單子葉禾本科植物的糊粉層和胚乳細(xì)胞中，如大麥和燕麥胚 乳細(xì)胞壁含有約70?75%的葡聚糖（PhilippeSetal. 2006.Planta224(2),449-461.)。
[0003] e-葡聚糖酶是內(nèi)切e-1，3、e-1，4-葡聚糖酶和外切e-1，3、e-1，4葡聚糖酶 的總稱。它作用于葡聚糖的0-1，3和0-1，4糖苷鍵，使葡聚糖分解成還原糖和 寡糖。在飼料加工業(yè)中，葡聚糖酶通過降解葡聚糖，使其降解為低分子量片段，失 去親水性和粘性。改變單胃動(dòng)物腸道內(nèi)容物的特性，提高內(nèi)源性消化酶活性，改變腸道微生 物環(huán)境，利于動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高生長(zhǎng)性能和飼料的轉(zhuǎn)化率（MathlouthiN etal. 2002.AminRes51,395-406.)在食品和飼料工業(yè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。在啤酒 加工業(yè)中，3 -葡聚糖酶能高效地將麥芽中的3 -葡聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細(xì)胞 壁，使細(xì)胞內(nèi)容物大量地釋放出來，提高麥芽汁得率，降低醪液粘度從而縮短糖化醪過濾時(shí) 間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫均勻持久。因此，將葡聚糖酶用于啤酒糖 化和發(fā)酵過程，可節(jié)約用糧，降低成本，提高糖化過濾設(shè)備的效能，有利于啤酒的質(zhì)量提高 及穩(wěn)定（宮春波等，2002,廣州食品工業(yè)科技）。
[0004] 由于不同工業(yè)對(duì)葡聚糖酶需求的不同，因此，獲得新型具有優(yōu)良特性的葡 聚糖酶仍具有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分 離的葡聚糖酶Cel16A，該酶在pH4?10范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，并且具有較高的葡聚糖 酶活性。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明首先公開了從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分離的葡聚糖酶 Cell6A的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0008] (a)、SEQIDNo.1所示的多核苷酸；或
[0009](b)、編碼SEQIDNo. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0010] (C)、與SEQIDNo.1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；或
[0011] (d)、與SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 1所示的 多核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚 糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源 性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與 SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼 蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少 有98%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的 功能；或
[0012] (e)、在SEQIDNo. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
[0013] 所述編碼基因編碼的成熟的葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0014](a)、SEQIDNo. 2 所示的氨基酸；
[0015] (b)、將SEQIDNo. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
[0016] 本發(fā)明還公開了從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分離的葡聚糖酶Cell6A 的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示：
[0017](a)、SEQIDNo. 3所示的多核苷酸；或
[0018] (b)、編碼SEQIDNo. 4所示氨基酸的多核苷酸；或
[0019](c)、與SEQIDNo. 3的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；或
[0020] (d)、與SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 3所示的 多核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡 聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源 性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與 SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼 蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少 有98%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的 功能；或
[0021] (e)、在SEQIDNo. 3所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
[0022] 所述編碼基因編碼的葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0023](a)、SEQIDNo. 4 所示的氨基酸；
[0024] (b)、將SEQIDNo. 4所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
[0025] 本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本 領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備葡聚糖酶Cell6A的氨基酸序列變體或片段，其 中用于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘 基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的葡聚糖酶Cell6A及其編碼基因包 括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對(duì)于多核苷酸，變體包含 天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和替換。對(duì)于多核 苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸 如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來 源的多核苷酸，例如采用定點(diǎn)誘變所得到的仍編碼SEQIDNo. 2或SEQIDNo. 4所示的氨 基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如DNA改組）。
[0026] 本發(fā)明通過PCR方法分離克隆了葡聚糖酶Cell6A的編碼基因，DNA全序列分析結(jié) 果表明，含有信號(hào)肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列全長(zhǎng)861bp，編碼286個(gè)氨基酸和一 個(gè)終止密碼子，其核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNo. 4所 示；其N端20個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，其氨基酸序列為SEQIDNo. 6所示，信號(hào) 肽的編碼序列為SEQIDNo. 5所示。不含有信號(hào)肽的成熟的葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序 列為SEQIDNo. 2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQIDNo. 1所示。因此，成熟的葡聚糖酶 Cell6A的理論分子量為30. 9kDa。
[0027] 將葡聚糖酶基因的cDNA序列（SEQIDNo. 1所示）及推導(dǎo)出的氨基酸序列（SEQ IDNo.2所不）在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果，該基因與來源于Chaetomiumglobosum CBS148. 51 的hypotheticalproteinCHGG_04043 氨基酸序列一致性為 68%。說明本發(fā) 明分離的葡聚糖酶Cell6A是一種新的葡聚糖酶。
[0028] 本發(fā)明還公開了含有所述葡聚糖酶Cell6A的編碼基因的重組表達(dá)載體，所述重 組表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC_cell6A。
[0029] 將本發(fā)明的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn) 之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施 方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因插入到質(zhì)粒pPIC9上的EcoRI和Not I限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于A0X1啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵 母表達(dá)質(zhì)粒pPIC_cell6A。
[0030] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 3所示的多核苷酸進(jìn)行 優(yōu)化以增強(qiáng)在重組宿主細(xì)胞或重組菌株中的表達(dá)效率。例如，可采用目標(biāo)宿主細(xì)胞的偏愛 密碼子進(jìn)行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強(qiáng)在目標(biāo)宿主細(xì)胞中的表達(dá)效率。
[0031] 本發(fā)明還公開了含有所述的重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞或重組菌株。
[0032] 其中，所述重組宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞；優(yōu)選的，所述重組宿主細(xì)胞為 畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞中的任意一種，優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞；[0033] 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母 菌株中的任意一種；其中，所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
[0034] 將所述多核苷酸或多肽引入重組宿主細(xì)胞的合適方法包括：電轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體 法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法等，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。
[0035] 本發(fā)明還公開了一種制備所述葡聚糖酶Cell6A的方法，包括以下步驟：
[0036] (1)用含有所述葡聚糖酶Cel 16A編碼基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重 組菌株；
[0037] (2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)葡聚糖酶Cell6A表達(dá)；
[0038] (3)回收并純化所表達(dá)的葡聚糖酶Cell6A。
[0039] 本發(fā)明將不含信號(hào)肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列插入到畢赤酵母表達(dá)載體 PPIC9上，使之位于a-因子信號(hào)肽下游，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-cell6A，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/cell6A。測(cè)得葡聚糖酶Cell6A的表達(dá)量為150. 6U/ mL。SDS-PAGE結(jié)果表明，葡聚糖酶Cell6A在畢赤酵母中得到了分泌表達(dá)；重組葡聚糖酶 Cell6A的比活為 693. 3U/mg。
[0040] 葡聚糖酶Cell6A的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果表明，本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A 的最適pH為5. 5,在pH4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性 在50%左右。葡聚糖酶Cell6A的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，葡聚糖酶Cell6A最 適溫度為551：。葡聚糖酶(^1164在501：下溫育111，酶活力仍保留80%左右。葡聚糖酶 Cell6A的&值的測(cè)定結(jié)果表明，以大麥葡聚糖為底物時(shí)的Km值為0.91mg/mL，最大反應(yīng)速 度為1530. 2limol/min?mg。不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)葡聚糖酶Cell6A酶活的影響測(cè) 定結(jié)果表明，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為ImM或者10mM時(shí)葡聚糖酶Cel16A的活力沒 有明顯變化。但是Ag+完全阻斷其活力；Cu2+在ImM時(shí)對(duì)葡聚糖酶Cell6A的酶活力影響不 明顯，而在濃度為10mM時(shí)可強(qiáng)烈抑制其活力。
[0041] 葡聚糖酶Cell6A除可作用于葡聚糖外，對(duì)于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解 作用。其對(duì)地衣多糖的降解能力相對(duì)于大麥葡聚糖的為42. 6%，其對(duì)昆布多糖的降解能力 相對(duì)于大麥葡聚糖的為16. 5%。
[0042] 本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A能有效地降解0 -葡聚糖，對(duì)于地衣多糖，昆布多糖也有 一定的降解作用，易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A或其編碼基因可廣泛應(yīng)用 于釀酒、紡織或能源工業(yè)等。例如在啤酒加工業(yè)中，本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A能高效地將麥 芽中的3 -葡聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物大量地釋放出來，提 高麥芽汁得率，降低醪液粘度從而縮短糖化醪過濾時(shí)間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤 淺，泡沫均勻持久。
[0043] 在飼料加工業(yè)中，本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A通過降解葡聚糖，使其降解為低分 子量片段，失去親水性和粘性，改變單胃動(dòng)物腸道內(nèi)容物的特性，提高內(nèi)源性消化酶活性， 改變腸道微生物環(huán)境，利于動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高生長(zhǎng)性能和飼料的轉(zhuǎn)化率。
[0044] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0045] 本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A的最適pH為5. 5,在pH4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定，并且還 具有較高的葡聚糖酶活性，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在50%左右。葡聚糖酶 Cell6A最適溫度為55°C，在50°C下溫育lh，酶活力仍保留80%左右。葡聚糖酶Cell6A除 可作用于葡聚糖外，對(duì)于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解作用。因此，本發(fā)明葡聚糖酶 Ce116A可廣泛應(yīng)用于釀酒、紡織、飼料或能源工業(yè)等。
[0046] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語定義
[0047] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0048] 術(shù)語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其 包括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除 非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn) 并密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè) 以上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn) 并密碼子取代（Batzer等人，NucleicAcidRes. 19:5081 (1991) ;0htsuka等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和Cassol等人，（1992);Rossolini等人，MolCell.Probes 8:91-98(1994))。
[0049] 術(shù)語"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常， 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更高 (例如超過本底至少2倍）。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同， 較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針 100%互補(bǔ)的祀序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)（Tijssen,Techniquesin BiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes,"Overview ofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays. 1993)〇 更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)（Tm) 約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度（在指 定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下）（因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50% 的探針被占據(jù)）。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件：其中在pH7. 0到8. 3下鹽濃度低于約1. 0M鈉離 子濃度，通常為約〇? 01到1. 0M鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對(duì)于短探針（包括（但 不限于）10到50個(gè)核苷酸）而言為至少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng)探針（包括（但不限于）大于50 個(gè)核苷酸）而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。對(duì) 于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。 例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1%SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC， 1%SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1%SDS中洗滌。所述洗滌可 進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0050] 術(shù)語"重組宿主細(xì)胞株"或"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管 使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0051] 術(shù)語"啟動(dòng)子"意指存在于目的基因編碼序列的上游，提供RNA聚合酶和正確轉(zhuǎn)錄 起始所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)，啟動(dòng)或指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA。
[0052] 術(shù)語"可操作的連接"意指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的 元件可為鄰接或非鄰接的。
[0053] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"意指將異源性DNA序列引入到宿主細(xì)胞或有機(jī)體的方法。
[0054] 術(shù)語"表達(dá)"意指內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0055] 術(shù)語"比活力（性）"是酶純度的量度，意指單位重量的蛋白質(zhì)中所具有酶的活力 單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示；一般來說，酶的比活力越高，酶越純。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0056] 圖1為重組畢赤酵母菌株GS115/cell6A發(fā)酵濕重及酶活測(cè)定；
[0057] 圖2為SDS-PAGE檢測(cè)純化的葡聚糖酶Cell6A，其中，M為蛋白Marker;Cell6A為 葡聚糖酶Cell6A;
[0058] 圖3為葡聚糖酶Cel16A的最適pH測(cè)定結(jié)果；
[0059] 圖4為葡聚糖酶Cel16A的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果；
[0060] 圖5為葡聚糖酶Cel16A的最適溫度測(cè)定結(jié)果；
[0061] 圖6為葡聚糖酶Cel16A的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0063] 1、實(shí)驗(yàn)材料和試劑
[0064] 1. 1菌株及載體
[0065] 特異腐質(zhì)霉（HumicolainsolensY1CGMCC 4573)從中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心分發(fā)，其保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 4573。畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌 株GS115購(gòu)自于Invitrogen公司。
[0066] 1. 2酶類及其它生化試劑
[0067] 內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司，連接酶購(gòu)自NEB公司。大麥葡聚糖購(gòu)自Sigma公司， 其它都為國(guó)產(chǎn)試劑（均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到）。1.3培養(yǎng)基
[0068] (l)Humicolainsolens產(chǎn)抱培養(yǎng)基為馬鈴暮培養(yǎng)基：
[0069] 1000mL 200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH5. 0。
[0070] (2)Humicolainsolens纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：
[0071] 3(^/1麥麩、3(^/1玉米芯粉、58/1(順4)504、18/1腿2?04、0.58/1]\%504.71120、 0? 01g/LFeS04 ? 7H20、0. 2g/LCaCl2。
[0072] (3)大腸桿菌培養(yǎng)基LB:
[0073] 1%蛋白胨、0? 5%酵母提取物、1%NaCl，pH7. 0。
[0074] (4)畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0075]PTM微量鹽：0? 6 %CuS04,0? 008 %Nal2,0? 3 %MnS04,0? 02 %Na2Mo04,0? 002 % H3B03,0. 05%CoC12,2%ZnCl2,6. 5%FeS04,0. 5%硫酸（v/v)。
[0076] 酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（FBSM):
[0077] 0. 5%KH2P04,5%NH4H2P04,1. 48 5%MgS04,1. 82%K2S04,0 . 09 3%CaS04,0. 15% K0H，0. 00011%Biotin，0. 44%PTM微量鹽，2%葡萄糖。
[0078] 酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（FBM):
[0079] 0. 5%KH2P04,5%NH4H2P04,1.485%MgS04,1.82 %K2S04,0 . 093 %CaS04,0. 15% K0H，0. 00011%Biotin，0.44%PTM微量鹽，0? 5%甲醇。
[0080]Na2HP04-檸檬酸緩沖液（0?lmol/LpH5. 2):
[0081] 0? 2mol/L憐酸氫二鈉 536ml，0?lmol/L朽1 樣酸 464ml，混勻后調(diào)pH至 5. 2。
[0082]說明：以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。
[0083] 實(shí)施例1特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)葡聚糖酶編碼基因cell6AcDNA的克 隆
[0084] 提取特異腐質(zhì)霉在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2d時(shí)的菌體的總RNA，將其反轉(zhuǎn) 錄得到cDNA后，以此為模板，利用特異性引物Ce116AF(5 '-GGGGAATTCTGGGACGCCCCCTAT TACCATGGCTG-3' ）和Cell6AR(5'-GCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAATAACTGTAGTA TTGGGCAACATAG-3'），經(jīng)PCR擴(kuò)增得到去除天然信號(hào)肽的葡聚糖酶基因cell6A的cDNA片 段，并克隆至pEASY-Blunt載體，測(cè)序驗(yàn)證。
[0085]DNA全序列分析結(jié)果表明，含有信號(hào)肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列全長(zhǎng) 861bp，編碼286個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，其核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示，其編碼的 氨基酸序列為SEQIDNo. 4所示；其N端20個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，其氨基酸序 列為SEQIDNo. 6所示，信號(hào)肽的編碼序列為SEQIDNo. 5所示。不含有信號(hào)肽的成熟的 葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序列為SEQIDNo. 2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQIDNo. 1 所示。因此，成熟的葡聚糖酶Cell6A的理論分子量為30. 9kDa。
[0086] 將葡聚糖酶基因的cDNA序列（SEQIDNo. 1所示）及推導(dǎo)出的氨基酸序列（SEQ IDNo.2所不）在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果，該基因與來源于Chaetomiumglobosum CBS148. 51 的hypotheticalproteinCHGG_04043 氨基酸序列一致性為 68%。說明本發(fā) 明分離的葡聚糖酶Cell6A是一種新的葡聚糖酶。
[0087] 實(shí)施例2葡聚糖酶Cel16A的制備
[0088] 將不含有信號(hào)肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列（SEQIDNo. 1所示）插入到畢 赤酵母表達(dá)載體PPIC9上，使之位于a-因子信號(hào)肽下游，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-cell6A。
[0089]將表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行雙酶切（EcoRI+NotI)，同時(shí)將實(shí)施例1構(gòu)建的連接有不 含有信號(hào)肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列的克隆載體雙酶切（EcoRI+NotI)，切出目的 片段與表達(dá)載體PPIC9連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC-cell6A并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組 畢赤酵母菌株GS115/cell6A。
[0090] 取含有重組質(zhì)粒的GS115菌株，先經(jīng)FBSM培養(yǎng)基培養(yǎng)使其快速生長(zhǎng)48h后，再經(jīng) FBIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)84h后，取上清，測(cè)定葡聚糖酶的活力。發(fā)酵過程中取樣測(cè)定菌體濕 重及葡聚糖酶的活力，結(jié)果見圖1。葡聚糖酶Cell6A的表達(dá)量為150.6U/mL。發(fā)酵上清用 0. 1Um濾膜過濾雜質(zhì)，然后用賽托利斯10kD濾膜濃縮，濃縮液直接過Akta的His-Trap柱， 收集酶活峰。SDS-PAGE結(jié)果表明，葡聚糖酶Cell6A在畢赤酵母中得到了分泌表達(dá)（圖2)。
[0091] 采用DNS法進(jìn)行葡聚糖酶Cell6A的活性分析：在pH6. 0,60°C條件下，lmL的反應(yīng) 體系包括100yL適當(dāng)?shù)南♂屆敢海▽?shí)施例2制備的葡聚糖酶Cel16A)，900i!L大麥葡聚糖 底物（1 % )，反應(yīng)l〇min，加入1. 5mLDNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測(cè)定0D值。 1個(gè)酶活單位（U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出lymol還原糖的酶量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明，葡聚糖酶Cel16A的比活為693. 3U/mg。
[0092] 實(shí)施例3葡聚糖酶Cel16A的性質(zhì)測(cè)定
[0093] 以實(shí)施例2純化的葡聚糖酶Cell6A為研究對(duì)象，對(duì)該酶的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。
[0094] 1、葡聚糖酶Cell6A的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定
[0095] 將實(shí)施例2純化的葡聚糖酶Cell6A在不同pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。 底物大麥葡聚糖，在不同pH的0. 2mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中55°C下進(jìn)行葡聚糖 酶活力測(cè)定。
[0096] 測(cè)定結(jié)果（圖3)表明，葡聚糖酶Cell6A的最適pH為5. 5。葡聚糖酶Cell6A于上 述各種不同pH的緩沖液中37°C處理60min，再在pH5. 5緩沖液體系中55°C下測(cè)定酶活性， 以研究酶的pH耐性。結(jié)果（圖4)表明，葡聚糖酶Cell6A在pH 4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定， 在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在50%左右。
[0097] 2、葡聚糖酶Cell6A的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定
[0098] 葡聚糖酶的最適溫度的測(cè)定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH5. 5)緩沖液體系 及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為葡聚糖酶在不同溫度（50°C、55°C和60°C)下處 理不同時(shí)間，再在55°C下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果（圖5)表明，葡聚糖 酶Cell6A最適溫度為55°C。酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖6)，葡聚糖酶Cell6A在50°C 下溫育lh，酶活力仍保留80%左右。
[0099] 3、葡聚糖酶Cell6A的I值的測(cè)定
[0100]用不同濃度的葡聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH5. 5)緩沖液體系 中，55 °C下測(cè)定酶活性，計(jì)算出其Km值。
[0101] 經(jīng)測(cè)定，以大麥葡聚糖為底物時(shí)的L值為0. 91mg/mL，最大反應(yīng)速度V_為 1530.2ymol/min?mg〇
[0102] 4、不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)葡聚糖酶Cell6A酶活的影響測(cè)定
[0103] 在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為ImM或者10mM。在55°C、pH5. 5條件下測(cè)定酶活性。
[0104] 結(jié)果表明（表1)，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為ImM或者10mM時(shí)葡聚糖酶 Cell6A的活力沒有明顯變化。但是Ag+完全阻斷其活力；Cu2+在ImM時(shí)對(duì)葡聚糖酶Cell6A 的酶活力影響不明顯，而在濃度為10mM時(shí)可強(qiáng)烈抑制其活力。
[0105] 表1不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)葡聚糖酶Cell6A酶活的影響
[0106]

【權(quán)利要求】
1. 從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因，其特征 在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cel 16A的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多 核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶 Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多 核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì) 仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；或 (e) 、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
2. 權(quán)利要求1所述編碼基因編碼的葡聚糖酶Cell6A，其特征在于，其氨基酸序列為（a) 或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
3. 從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因，其特征 在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cel 16A的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多 核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚 糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源 性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與 SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼 蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少 有98%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的 功能；或 (e) 、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
4. 權(quán)利要求3所述編碼基因編碼的葡聚糖酶Cell6A，其特征在于，其氨基酸序列為（a) 或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 4所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 4所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
5. 含有權(quán)利要求1或3所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
6. 按照權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為 pPIC-cell6A。
7. 含有權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞或重組菌株。
8. 按照權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞或重組菌株，其特征在于：所述重組宿主細(xì)胞 為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞中的任意一種，優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞； 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株 中的任意一種；其中，所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
9. 一種制備權(quán)利要求2或4所述葡聚糖酶Cel 16A的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 用權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌株； (2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)葡聚糖酶Cell6A表達(dá)； (3) 回收并純化所表達(dá)的葡聚糖酶Cell6A。
10. 權(quán)利要求1或3所述編碼基因或者權(quán)利要求2或4所述葡聚糖酶Cel 16A在降解葡 聚糖、地衣多糖或昆布多糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23K1/165GK104328133SQ201410528717
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】張偉, 徐欣欣, 李金陽(yáng), 張宇宏, 劉波 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所