地衣芽孢桿菌在促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生根或生長中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了地衣芽孢桿菌在促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生根或生長中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括：直接以整腸生為原料，經(jīng)細(xì)菌活化后，以地衣芽孢桿菌菌液的形式接種在藍(lán)莓繼代苗上，省去了大量分離、純化、鑒定菌株的步驟，也沒有添加任何外源激素，成本低廉，操作簡單，安全無毒，效果明顯；接種后的藍(lán)莓組培苗生根率顯著提高，株高、葉面積等指標(biāo)也得到改善，并且真菌污染后成活率也大幅度提高，顯著提高了藍(lán)莓組培苗的生根質(zhì)量。
【專利說明】地衣芽孢桿菌在促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生根或生長中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及地衣芽孢桿菌的應(yīng)用，尤其涉及地衣芽孢桿菌在促進(jìn)植物組培苗生根或生長中的應(yīng)用，屬于地衣芽孢桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)莓(Semen Trigonellae)具有軟化人體血管、增強(qiáng)免疫機(jī)能等保健效用，被譽(yù)為“水果之王”，亦被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，市場價(jià)格昂貴。就目前而言，藍(lán)莓產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了國內(nèi)的需求，且藍(lán)莓的各種加工產(chǎn)品在國際市場深受歡迎。但由于其材料來源有限，繁殖系數(shù)低，無法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，組織培養(yǎng)是解決這一問題的重要途徑。然而常規(guī)方法擴(kuò)繁推廣慢，藍(lán)莓試管苗生根困難、生根率低、發(fā)根周期長，制約了優(yōu)良品種的產(chǎn)業(yè)化育苗進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供地衣芽孢桿菌在促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生根或生長中的應(yīng)用。
[0004]所述應(yīng)用是在藍(lán)莓繼代苗上接種地衣芽孢桿菌，進(jìn)行無糖組織培養(yǎng)。
[0005]特別是，所述地衣芽孢桿菌是以整腸生為原料，經(jīng)細(xì)菌活化處理后，以地衣芽孢桿菌菌液的形式接種在藍(lán)莓繼代苗上。 [0006]尤其是，所述細(xì)菌活化處理包括以下步驟:
[0007]將地衣芽孢桿菌干粉，接種于液體培養(yǎng)基后，進(jìn)行第一次振蕩，振蕩時間為2-3小時，設(shè)定溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；
[0008]將完成第一次振蕩的菌液接種到固體培養(yǎng)基上，在28°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時，取單菌落于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次振蕩，振蕩時間為8小時，設(shè)定溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；
[0009]將完成第二次振蕩的菌液進(jìn)行離心處理，棄掉上清液，在_20°C的溫度下，用濃度為10%的甘油凍存。
[0010]其中，所述的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基。
[0011]LB液體培養(yǎng)基的配方為:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，ρΗ6.8-7.2ο
[0012]LB固體培養(yǎng)基的配方為:酵母提取物5g/L,胰蛋白胨IOg g/L,氯化鈉10gg/L,瓊脂 17-20g g/L, ρΗ6.8-7.2。
[0013]特別是，所述地衣芽孢桿菌菌液的濃度為lOOOOOcfu/ml。
[0014]尤其是，所述在藍(lán)莓繼代苗上接種地衣芽孢桿菌包括將切割好的藍(lán)莓繼代苗浸泡于所述地衣芽孢桿菌菌液中，浸泡處理5min。
[0015]特別是，所述無糖組織培養(yǎng)包括:將接種地衣芽孢桿菌的藍(lán)莓繼代苗插入藍(lán)莓無糖組織培養(yǎng)基中，進(jìn)行組織培養(yǎng)。[0016]尤其是，所述藍(lán)莓無糖組織培養(yǎng)基的配方為:硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，硝酸二氫鉀170mg/L,硫酸鎂370mg/L,氯化鈣440mg/L,碘化鉀0.83mg/L,硼酸6.2mg/L,硫酸錳22.3mg/L，硫酸鋅8.6mg/L，鎳酸鈉0.25mg/L，硫酸銅0.25mg/L，氯化鈷0.025mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.25mg/L，硫酸亞鐵27.85mg/L,鹽酸硫胺素lmg/L，瓊脂6g/L，pH=5.8。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益結(jié)果:
[0018]本發(fā)明首次將地衣芽孢桿菌應(yīng)用于促進(jìn)無糖組織培養(yǎng)的藍(lán)莓的生根環(huán)節(jié)，使藍(lán)莓組培苗的生根率顯著提高；
[0019]本發(fā)明所使用的地衣芽孢桿菌直接以整腸生為原料，經(jīng)細(xì)菌活化后，以地衣芽孢桿菌菌液的形式接種在藍(lán)莓繼代苗上，省去了大量分離、純化、鑒定菌株的步驟，也沒有添加任何外源激素，成本低廉，操作簡單，安全無毒，效果明顯。
[0020]按照本發(fā)明所述的技術(shù)方案處理的藍(lán)莓組培苗，株高、葉面積等其他指標(biāo)也得到改善，并且真菌污染后成活率也大幅度提高，顯著提高了藍(lán)莓組培苗的生根質(zhì)量。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步描述本發(fā)明所述技術(shù)方案的有益效果，這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的配方思路、用途范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0022]下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023]下述實(shí)施例中的百分含量，如無特殊說明，均為百分含量。
[0024]下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025]預(yù)備實(shí)施例1地衣芽孢桿菌菌液的制備
[0026]I)打開整腸生(即地衣芽孢桿菌膠囊，生產(chǎn)廠家:東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)的膠囊外殼，用接種環(huán)蘸取其中的地衣芽孢桿菌干粉，接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入搖床進(jìn)行第一次振蕩，振蕩時間為2-3小時，設(shè)定溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分。
[0027]其中，所述LB液體培養(yǎng)基的配方為:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L, pH6.8-7.2。
[0028]2)第一次振蕩完成后，用接種環(huán)蘸取菌液，均勻劃線接種到LB固體培養(yǎng)基上，在280C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時，取單菌落于裝有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入搖床進(jìn)行第二次振蕩，振蕩時間為8小時，設(shè)定溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分。
[0029]其中，所述LB固體培養(yǎng)基的配方為:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨IOg g/L，氯化鈉IOg g/L，瓊脂 17-20g g/L，pH6.8-7.2。
[0030]3)第二次振蕩完成后，對菌液進(jìn)行離心處理，棄掉上清液，在_20°C的溫度下，用濃度為10%的甘油凍存剩余膏狀物，制成地衣芽孢桿菌菌液，備用。
[0031]實(shí)施例1地衣芽孢桿菌在促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生根或生長中的應(yīng)用
[0032]1.接種:
[0033]在直徑35mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，將預(yù)備實(shí)施例1制成的地衣芽孢桿菌菌液用無菌去離子水稀釋至其中地衣芽孢桿菌的濃度為lOOOOOcfu/ml ；[0034]將切割好的藍(lán)莓繼代苗(2_3cm)浸泡于上述培養(yǎng)皿中，浸泡處理5min ；
[0035]2組織培養(yǎng):
[0036]將浸泡處理后的藍(lán)莓繼代苗插入藍(lán)莓無糖組織培養(yǎng)基中，進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為8周，得到藍(lán)莓組培苗。
[0037]其中，所述藍(lán)莓無糖組織培養(yǎng)基的配方為:硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，硝酸二氫鉀170mg/L，硫酸鎂370mg/L，氯化鈣440mg/L，碘化鉀0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸錳 22.3mg/L，硫酸鋅 8.6mg/L，鎳酸鈉 0.25mg/L，硫酸銅 0.25mg/L，氯化鈷 0.025mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.25mg/L，硫酸亞鐵27.85mg/L,鹽酸硫胺素lmg/L，瓊脂6g/L，pH=5.8。
[0038]對照實(shí)施例1
[0039]取與實(shí)施例1中生長狀況一致的藍(lán)莓繼代苗(2-3cm)浸泡于無菌去離子水中5分鐘(與實(shí)施例1中稀釋的地衣芽孢桿菌菌液同體積)，然后接種于藍(lán)莓無糖組織培養(yǎng)基中，進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為8周，得到藍(lán)莓組培苗。
[0040]試驗(yàn)例I生長和生根指標(biāo)測定
[0041]1.1測定方法:
[0042]取實(shí)施例1和對照例I所述藍(lán)莓組培苗各30棵，自培養(yǎng)第3周開始，觀察其生根情況并計(jì)算生根率；培養(yǎng)八周后，開始測量株高、葉面積、根長和根數(shù)四項(xiàng)生長指標(biāo)，并基于以上指標(biāo)，評價(jià)藍(lán)莓組培苗的生根質(zhì)量。 [0043]重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，取平均數(shù)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0044]生根率=已生根的藍(lán)莓組培苗的個數(shù)/藍(lán)莓組培苗總數(shù)X 100% ；
[0045]生根質(zhì)量Q=生根率(第八周)X 50%+根數(shù)X 25%+根長X 25%。
[0046]1.2測定結(jié)果:
[0047]1.2.1 生根率
[0048]對實(shí)施例1和對照例I所述藍(lán)莓組培苗的生根率進(jìn)行觀察和計(jì)算，結(jié)果如表1所示。
[0049]表1不同藍(lán)莓組培苗的生根率
【權(quán)利要求】
1.地衣芽孢桿菌在促進(jìn)藍(lán)莓組培苗生根或生長中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:將藍(lán)莓繼代苗接種地衣芽孢桿菌后進(jìn)行組織培養(yǎng)。
3.按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:將地衣芽孢桿菌種經(jīng)細(xì)菌活化處理后，以地衣芽孢桿菌菌液的形式接種在藍(lán)莓繼代苗上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)菌活化處理包括以下步驟: 將地衣芽孢桿菌干粉，接種于液體培養(yǎng)基后，進(jìn)行第一次振蕩，振蕩時間為2-3小時，溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分； 將完成第一次振蕩的菌液接種到固體培養(yǎng)基上，在28°C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時，取單菌落于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次振蕩，振蕩時間為8小時，設(shè)定溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分； 將完成第二次振蕩的菌液進(jìn)行離心處理，棄掉上清液，在_20°C的溫度下，用濃度為10%的甘油凍存。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述地衣芽孢桿菌菌液的濃度為100000cfu/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的接種包括將切割好的藍(lán)莓繼代苗浸泡于地衣芽孢桿菌菌液中，浸泡處理5min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述組織培養(yǎng)是無糖組織培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述無糖組織培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基的配方為:硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，硝酸二氫鉀170mg/L，硫酸鎂370mg/L，氯化?丐440mg/L,碘化鉀0.83mg/L,硼酸6.2mg/L,硫酸猛22.3mg/L,硫酸鋅8.6mg/L,鎳酸鈉0.25mg/L,硫酸銅0.25mg/L,氯化鈷0.025mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.25mg/L,硫酸亞鐵27.85mg/L,鹽酸硫胺素 lmg/L，瓊脂 6g/L，pH=5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK103828721SQ201410105267
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】姬謙龍, 賈士乾, 王貴禧, 韓素英, 劉悅萍, 于涌鯤, 張喬麗 申請人:北京農(nóng)學(xué)院