專利名稱：影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物(VOCs)的生測(cè)方法，屬生物測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
研究松材線蟲的化學(xué)生態(tài)學(xué)，對(duì)了解松萎蔫病的致病機(jī)理及過程有著重要的意義。其中，生測(cè)手段必不可少。在快速檢測(cè)昆蟲觸角對(duì)氣味的反應(yīng)方面，觸角電位圖(Electroantennogram,EAG)是非常重要的生物測(cè)定方法(趙新成等，2004)。氣相色譜與觸角電位(GC-EAD)連用技術(shù)可以通過昆蟲觸角的化學(xué)感器對(duì)化合物進(jìn)行識(shí)別，檢測(cè)其中的活性組分。受限于目前的手段，線蟲的信息素的研究手段無法像昆蟲的一樣，不能直接用儀器檢測(cè)到線蟲對(duì)活性組分的神經(jīng)電脈沖信號(hào)。因此只有將待分析的VOCs經(jīng)GC-MS分析和鑒定出所有的組分的結(jié)構(gòu)，購買所有有可能的化合物或進(jìn)行合成，再對(duì)線蟲進(jìn)行生測(cè)(Zhao等，2007 ;Kaplan 等，2008 ;Niu 等，2010)。常用松材線蟲的生測(cè)手段一般采用瓊脂平板生測(cè)法，以水瓊脂平板或木段等為基質(zhì)，來研究松材線蟲的移行。具體的方法如下:在培養(yǎng)皿中倒入2%瓊脂水液，待瓊脂凝固后，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿背面劃線，以平板中心為原點(diǎn)，將平板均勻的等分為四個(gè)象限。在第一或第三象限放入處理，一般為真菌小塊或樣品溶液等；在第二或第四象限放入對(duì)照，一般為培養(yǎng)基小塊或溶劑等。然后在平板中心滴入線蟲液，一段時(shí)間后檢測(cè)線蟲的移行情況。Mamiya(Mamiya, 2006)用水瓊脂平板為生測(cè)材料,研究了木材腐生真菌的活菌絲對(duì)松材線蟲的作用。趙莉藺(Zhao等，2007)以0.8%瓊脂平板為基質(zhì)，對(duì)馬尾松和松褐天牛的揮發(fā)物對(duì)線蟲的吸引作用進(jìn)行了研究。龍瑞敏(龍瑞敏，2007)分別以滅菌的淡水沙和水瓊脂平板為基質(zhì)，研究了松材線蟲的移行。談家金(談家金等，2009)在水瓊脂平板和木段上研究了松樹揮發(fā)物對(duì)松材線蟲的吸引作用。上述瓊脂平板生測(cè)法有兩大不足，首先，它對(duì)生測(cè)樣品的量需要量很大，以形成較高濃度梯度，被松材線蟲感覺到；其次，采用了線蟲在瓊脂表面運(yùn)動(dòng)的方法進(jìn)行，由于不同線蟲的在自然界生境不同，存活的介質(zhì)也不同，瓊脂表面并不完全適合線蟲的運(yùn)動(dòng)，特別是絕大多數(shù)線蟲是在介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)，而不是在介質(zhì)表面運(yùn)動(dòng)。因此這些方法影響線蟲的運(yùn)動(dòng)，繼而影響生測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。Ishikawa (Ishikawa M, Shuto Y, Watanabe H.β -Myrcene, a PotentAttractant Component of Pine Wood for the Pine Wood Nematode, Bursaphelenchusxylophilus (Pesticide Chemistry).Agricultural and biological chemistry, 1986，50 (7):1863-1866.)建立了一種生測(cè)方法，用于檢測(cè)供試化合物(5 mg)的揮發(fā)物對(duì)松材線蟲的吸引作用。他使用的生測(cè)裝置是T型玻璃管，內(nèi)含9 ml 1.5 %的瓊脂。該裝置的空腔體約為 π X r2 X h = 3.14 X (5 mm) 2 X 200 mm = 15700 mm3。且T 型管頂部有個(gè)虹吸管，用于向外抽氣。使用該方法，它對(duì)管內(nèi)的樣品的濃度要求很高，即需要的所測(cè)化合物的量很大(毫克mg數(shù)量級(jí))。使用該生測(cè)方法無法檢測(cè)到GC分離得到的對(duì)松材線蟲有生物活性的微量揮發(fā)物(納克ng數(shù)量級(jí)的化合物)。 張?zhí)飯@((張?zhí)飯@，牛秋紅，應(yīng)樹松，劉艷，王敏，王珍珍，過雨晴.細(xì)菌Bacillus sp.NS-3和灰葡萄孢對(duì)松材線蟲的誘引.南陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2011:47-50.)采用“水瓊脂平板移行法”和“玻管法”，研究了松材線蟲拮抗細(xì)菌Bacillussp.NS-3和灰葡萄孢引誘線蟲的能力。其方法為改良的玻管法,參考自Ishikawa的方法。采用玻管并在其上加裝了虹吸管，對(duì)外抽氣。方法中玻管內(nèi)的空腔體積為η X r2 X h =3.14 X (45 mm)2 X 7.5 mm = 47688.75 mm3，該方法同樣對(duì)生測(cè)樣品的量需要量很大，有著很高的要求。此外，目前的生測(cè)方法常結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀進(jìn)行，將收集的VOCs進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀測(cè)定后，將鑒定出來的所有物質(zhì)進(jìn)行合成或購買已知的化合物，然后對(duì)松材線蟲進(jìn)行生測(cè)，最終確定活性組分的結(jié)構(gòu)和含量(Zhao等，2007 ；Kaplan等，2008 ;Niu等，2010)。這種方法不僅復(fù)雜,而且很可能購買不到所有的化合物，使得不能鑒定出所有的具有生物活性的化合物。綜上所述，現(xiàn)有生測(cè)方法對(duì)活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)的濃度有明顯的限制，它要求活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)有一 定的量，以形成較高濃度梯度，被松材線蟲感覺到?，F(xiàn)有采用加裝虹吸管的玻管的生測(cè)方法，對(duì)管內(nèi)的樣品的濃度要求很高，即需要的所測(cè)化合物的量很大(毫克mg數(shù)量級(jí))。對(duì)于活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)微量的樣品，或無法測(cè)出，或雖然能夠檢測(cè)到一定的生物活性，但統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果差異不顯著(p>0.05)。使用現(xiàn)有生測(cè)方法無法檢測(cè)到由GC分離而直接得到的對(duì)松材線蟲有生物活性的微量揮發(fā)物(納克ng數(shù)量級(jí)的化合物)。需要加以改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能測(cè)定出微量的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物(VOCs)的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下:
一種影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物(VOCs)的生測(cè)方法，包括以下步驟:取內(nèi)腔容積在10至500 mm3的細(xì)管，在細(xì)管正中間開一用來滴加蒸餾水和線蟲液的小口，在細(xì)管的一側(cè)放入一個(gè)有產(chǎn)生活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)微生物的培養(yǎng)基小塊，或者含有VOCs的樣品溶液的介質(zhì)，標(biāo)記為處理端；另一側(cè)放入一個(gè)未接種微生物或不含活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)的培養(yǎng)基小塊，標(biāo)記為對(duì)照端，再將細(xì)管兩側(cè)封口，用微量進(jìn)樣器從細(xì)管中間的小口處滴入線蟲液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于10 h，24 h，36 h后分離線蟲，28°C下靜置24 h后鏡檢，統(tǒng)計(jì)分離到的線蟲數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。上述細(xì)管可采用玻璃、金屬、無揮發(fā)物的塑料等材料制成的細(xì)管，優(yōu)選采用透明硅膠管。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明所采用的“硅膠管法”更加靈敏，很小的空腔體積和封閉的環(huán)境確?！肮枘z管法”對(duì)于微量的揮發(fā)物有著非常高的檢測(cè)靈敏度。進(jìn)一步的技術(shù)解決方案為:在管內(nèi)居中放置適合于線蟲運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)，以硅膠管中間的小口處為中心居中放置于硅膠管中，在硅膠管中間的小口處緩慢注入蒸餾水，使介質(zhì)剛好全部濕潤。
在過去已有的生測(cè)方法中絕大多數(shù)采用了線蟲在瓊脂表面運(yùn)動(dòng)的方法進(jìn)行，由于不同線蟲的在自然界生境不同，存活的介質(zhì)也不同，瓊脂表面并不完全適合線蟲的運(yùn)動(dòng)，特別是絕大多數(shù)線蟲是在介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)，而不是在介質(zhì)表面運(yùn)動(dòng)。因此這些方法影響線蟲的運(yùn)動(dòng)，繼而影響生測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明采取了對(duì)特定線蟲使用適合于線蟲運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)，使得線蟲在適合的介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)，提高了生測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。再進(jìn)一步的技術(shù)解決方案為:所述介質(zhì)為經(jīng)滅活的線蟲實(shí)際生活環(huán)境用土壤、木屑，也可以為棉線、濾紙、玻璃毛，優(yōu)選采用直徑為透明硅膠管內(nèi)徑的濾紙棒。上述介質(zhì)是適合于線蟲運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)，濾紙棒易取得和制作。再進(jìn)一步的技術(shù)解決方案為:所述透明硅膠管的內(nèi)徑為1-3 mm，長度為3-5 cm，空腔體積為 23.55 mm3-353.25 mm3。本技術(shù)解決方案使得對(duì)由GC收集口收集到的微量的樣品可以生測(cè)，方法簡(jiǎn)單易行，可找出納克量級(jí)的具有引誘活性的化合物。實(shí)驗(yàn)證明，檢測(cè)靈敏度比常用的生測(cè)方法高出數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，能夠檢測(cè)到小于I ng對(duì)松材線蟲具有生物活性的化合物。再進(jìn)一步的技術(shù)解決方案為:上述含有VOCs的樣品溶液的介質(zhì)為濾紙、培養(yǎng)基、玻璃毛。本發(fā)明建立的生測(cè)方法(以下簡(jiǎn)稱“硅膠管法”)，可結(jié)合GC聯(lián)用，在GC通向檢測(cè)器柱子上加裝分支柱和收集口，并在改變GC色譜柱的分流比的基礎(chǔ)上，從GC收集口收集到微量化合物，并以此微量分離的物質(zhì)能夠進(jìn)行生測(cè)，確定其生物活性，最后通過GC-MS鑒定出活性組分的結(jié)構(gòu)?？捎糜跈z測(cè)微量的VOCs對(duì)松材線蟲的生物活性；鑒定微生物引誘線蟲的活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)，以期為線蟲引起的病害的生物防治和早期檢測(cè)診斷提供一定的理論基礎(chǔ)。


圖1娃膠管法測(cè)定萬.真菌小塊*的VOCs吸引松材線蟲的效果。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合真菌Esteya vermicola CNU 120806引誘線蟲的活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)的生測(cè)的實(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)驗(yàn)I測(cè)試真菌E.vermicola的VOCs吸引松材線蟲的效果及比較“硅膠管法”和“水瓊脂平板法”對(duì)微量物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。1、試驗(yàn)材料:
供試真菌:Esteya vermicola CNU 120806 (簡(jiǎn)稱 Esteya vermicola),韓國忠南大學(xué)
惠贈(zèng)
供試線蟲:松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)
材料與試劑:
透明硅膠管(內(nèi)徑3 mm，外徑6 mm，南京距成化玻有限公司)；
游標(biāo)卡尺 D15TN (Mitutoyo Corporation)；
快速定性濾紙(杭州新華紙業(yè)有限公司)；
手術(shù)刀片(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)；微孔濾膜φ 0.22 Mffl (上海市新亞凈化器件廠)；
封口膜Parafilm (杭州微生物試劑有限公司)；
培養(yǎng)皿(南京金慶祥貿(mào)易有限公司)；
小圓濾紙片(r=0.6 cm,自制)；
新鮮玉米粉(集貿(mào)市場(chǎng)購買)；
蔗糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；
瓊脂粉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；
硫酸鏈霉素(南京生興生物技術(shù)有限公司)；
青霉素鈉(南京生興生物技術(shù)有限公司)；
30%雙氧水(南京化學(xué)試劑有限公司)；
石油醚(沸程60-90°C，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；
無水乙醇(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；
無水乙醇(光譜純，阿拉丁試劑上海有限公司)；
二氯甲烷(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)； α -菔烯(92%，南京林業(yè)大學(xué)化工工程學(xué)院)； β -菔烯(92%，南京林業(yè)大學(xué)化工工`程學(xué)院)
培養(yǎng)基:
馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)；
水瓊脂培養(yǎng)基(2% WA ；0.8% WA)；
弱營養(yǎng)玉米粉培養(yǎng)基(LCMA)；
弱營養(yǎng)玉米粉瓊脂雙抗培養(yǎng)基(雙抗LCMA)；
儀器設(shè)備:
Thermo Finnpipette可調(diào)式移液器(熱電上海儀器有限公司)；
分析天平FA1104N (上海精密儀器科學(xué)有限公司)；
光學(xué)顯微鏡YS2 (日本尼康公司)；
立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50S11 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；
恒溫培養(yǎng)箱MLR - 351 (日本三洋電機(jī)公司);
垂直層流潔凈工作臺(tái)CA-920-2 (上海上凈凈化設(shè)備有限公司)；
恒溫水浴鍋ΗΗ-2數(shù)顯(常州國華電器有限公司)；
SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；
冰箱B⑶-215KC F (青島海爾股份有限公司)；
800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)。2、試驗(yàn)方法。2.1培養(yǎng)和分離松材線蟲。2.2配制馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、水瓊脂培養(yǎng)基(2% WA)、水瓊脂培養(yǎng)基(0.8% WA)、弱營養(yǎng)玉米粉培養(yǎng)基(LCMA)、弱營養(yǎng)玉米粉瓊脂雙抗培養(yǎng)基(雙抗LCMA)。2.3 Ε.vermicola 的純化:
E.的純化方法如下:在無菌條件下,用接種針刮取菌絲培養(yǎng)于Φ 7.5 cm
LCMA平板上，26°C下培養(yǎng)5 d。在新長成的菌落旁滴入10 μ I線蟲液(約含100條線蟲)。2 d后，在光學(xué)顯微鏡下，用細(xì)針挑取被真菌孢子侵染的線蟲至已滅菌的載玻片上，載玻片上事先滴上3滴3 % H2O2和2滴無菌水。將線蟲用3 % H2O2洗3次，每次10 s,再用無菌水洗2次后，轉(zhuǎn)接到新的Φ 7.5 cm雙抗LCMA平板上，以去掉細(xì)菌的污染(李天飛等，2000)，每個(gè)平板接入I條線蟲，平板置于26 °C下培養(yǎng)2 d02d后，在光鏡下可以觀察到，菌絲從被侵染線蟲體內(nèi)長出，營養(yǎng)菌絲匍匐在培養(yǎng)基上，氣生菌絲離開培養(yǎng)基向上生長，粘性孢子著生于氣生菌絲的瓶形分生孢子梗上。粘性孢子為不規(guī)則橢圓形，半月形，向內(nèi)凹陷，分生孢子內(nèi)含一個(gè)類似內(nèi)寄生孢子的結(jié)構(gòu)(李天飛等，2000)。在光鏡下，使用細(xì)針輕輕刮取氣生菌絲，粘性孢子便粘附于針尖，將針頭在新的Φ 9 cm PSA平板上輕輕的劃線，孢子會(huì)隨機(jī)的散落在平板上。在高倍鏡(400倍)下觀察，若找到半月形的單個(gè)孢子，且附近無菌絲和其他孢子，就用記號(hào)筆在平板背面標(biāo)記。將平板置于26°C下培養(yǎng)1-2 d。在高倍鏡(400倍)下觀察，若單孢子已正常萌發(fā)，用無菌刀片將含有單孢子的培養(yǎng)基切下，轉(zhuǎn)接至含PSA的試管中，于26 °C下培養(yǎng)8 d。純化的及起初菌落邊緣呈白色，緊密，外圍有些叢毛狀，但逐漸顏色變灰綠，最終變深綠色。菌落產(chǎn)深棕色的色素。菌絲長好后，將試管置于4°C下保存。2.4制作硅膠管:
取5 cm長的透明娃膠管(內(nèi)徑3 mm,外徑6 mm),用手術(shù)刀片在娃膠管正中間開一小口，小口用來滴加蒸懼水和線蟲液。將快速定性濾紙片制成3 mm的濾紙棒,輕輕塞入娃膠管中，居中放置。用移液槍在硅膠管中間的小口處緩慢注入140 μ I蒸餾水，使濾紙棒全部濕潤，并吸去濾紙棒中多余的流動(dòng)水。2.5生測(cè)用菌塊的準(zhǔn)備
在Φ 9 cm PSA平板上接種萬.F6 r ico7a真菌,于26 °C下培養(yǎng)8 d。用無菌刀片在菌落邊緣切取數(shù)個(gè)小塊，每個(gè)小塊上菌絲的面積約0.1 cm2,菌絲量約為0.05 mg,簡(jiǎn)稱真菌小塊；在未接種真菌的PSA平板上同樣切取相同體積的小塊，簡(jiǎn)稱PSA小塊，作為對(duì)照。2.6生測(cè)實(shí)驗(yàn)
含有濕潤濾紙棒的硅膠管，一側(cè)放入一個(gè)真菌小塊，用記號(hào)筆標(biāo)記為處理端；另一側(cè)放入一個(gè)PSA小塊，標(biāo)記為對(duì)照端。硅膠管兩側(cè)用封口膜Parafilm封口。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用微量進(jìn)樣器從硅膠管中間的小口處滴入10 μ I線蟲液(約300頭線蟲)，靜置片刻，置于28°C的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。2.7分離線蟲
分別于10 h，24 h，36 h后分離線蟲。從硅膠管中分離線蟲的方法如下:
用手術(shù)刀片迅速將硅膠管的處理端和對(duì)照端(均2 cm長)切下。分別將其中的濾紙棒取出，連同相應(yīng)的硅膠管和小塊，置于貝曼漏斗中分離，28°C下靜置24 h后鏡檢，統(tǒng)計(jì)分離到的線蟲數(shù)。2.8結(jié)果分析
同一根硅膠管中，處理端和對(duì)照端分離到的線蟲數(shù)(條)分別記為a和b。處理端比例和對(duì)照端比例的計(jì)算公式如下:
處理端比例(%)=處理端分離到的線蟲數(shù)/ (處理端和對(duì)照端分離到的線蟲數(shù)總和)XlOO = a/(a+b) XlOO處理端比例(%)=對(duì)照端分離到的線蟲數(shù)/(處理端和對(duì)照端分離到的線蟲數(shù)總和)XlOO = a/(a+b) XlOO
使用SPSS 13.0獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，來比較3個(gè)重復(fù)的處理端比例與對(duì)照端比例均值之間的差異，顯著性差異以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的雙尾檢驗(yàn)值(P值)來判斷。如果p>0.05,說明處理端比例與對(duì)照端比例之間無顯著性差異，即E.vermicola的VOCs對(duì)松材線蟲無吸引效果；
p〈0.05，且處理端比例>50%，說明處理端比例與對(duì)照端比例之間有顯著性差異，即厶vermicola菌絲的VOCs對(duì)線蟲的吸引效果跟對(duì)照PSA培養(yǎng)基相比,有顯著性差異；
p〈0.01，且處理端比例>50%，說明處理端比例與對(duì)照端比例之間有極顯著性差異，即疋vermicola菌絲的VOCs對(duì)線蟲有極顯著的吸引效果。3、結(jié)果與分析。1.2.1真菌E.vermicola的VOCs吸引松材線蟲的效果
在娃膠管的一端放入 萬.vermicola真菌小塊,標(biāo)記為處理端；另一端放入PSA小塊,標(biāo)記為對(duì)照端。在硅膠管中間的小口處加入線蟲液，分別于10 h，24 h，36 h后分離線蟲。結(jié)果分析以處理端比例和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的雙尾檢驗(yàn)值(P值)來表示。結(jié)果見表1-1和圖1O從表1-1和圖1可以看出疋的VOCs對(duì)松材線蟲有著非常強(qiáng)的吸引效果，該結(jié)果與王春燕在水瓊脂平板上的生測(cè)結(jié)果一致(Wang等，2010)。真菌小塊置于硅膠管中10 h后，處理端分離到241.33 土 76.59頭線蟲，處理端比例為88.45% 土0.04 > 50%ο獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，p=0.000〈0.01,說明與對(duì)照相比真菌的VOCs有著極顯著的吸引效果。隨著時(shí)間的推移，24 h和36 h分離的結(jié)果顯示，真菌小塊對(duì)松材線蟲依然保持著很高的吸引效果，處理端比例分別是86.55% 土 0.10和85.16% 土0.09(ρ〈0.001)。在透明硅膠管里，真菌小塊的菌絲面積約0.1 cm2，菌絲量約0.05 mg。真菌小塊和PSA小塊并未直接接觸到濾紙棒及其中的線蟲，因此，“硅膠管法”檢測(cè)的是VOCs對(duì)線蟲的作用。E.vermicola菌絲的VOCs在娃膠管的一側(cè)累積,逐漸在濕潤的濾紙棒里形成一定的濃度差，吸引滴加在濾紙棒中間的松材線蟲通過濾紙，向真菌小塊移動(dòng)。之前預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，將疋的菌絲刮成小團(tuán)，放入硅膠管中，對(duì)線蟲同樣有極顯著的吸引效果。24 h后檢測(cè)，處理端分離到174.00 土 31.32頭線蟲，處理端比例為85.02% 土 0.03。p=0.000<0.0l0以上結(jié)果表明萬.vermicola的活體菌絲能夠產(chǎn)生引誘松材線蟲的揮發(fā)性物質(zhì)。表1-1娃膠管法測(cè)定萬.vermicola真菌小塊*的VOCs吸引松材線蟲的效果
時(shí)間|a(條) |b(條)I處理端比例 I對(duì)照端比例|P值#
IOh241.33±76.59 33.00±20.8888.45%±0.04 11.55%±0.040.000
24h 86.67±47.3 ~ 27.33±18.8855%±0.10 _ 13.45%±0.10οΓοοΓ
36h|90.67±60.34 |l2.00±2.65丨85.16%±0.09 |l4.84%±0.09|θ.QoT
注:表中的數(shù)據(jù)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)差，a和b分別表示處理端和對(duì)照端分離到的線蟲數(shù)
*真菌小塊的菌絲面積約0.1cm2,菌絲量約0.05mg
**P值為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的雙尾檢驗(yàn)值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將該生測(cè)方法的線蟲分離時(shí)間設(shè)定為10 h，因?yàn)殡S著真菌小塊放置時(shí)間的延長，吸引效果并沒有出現(xiàn)明顯增長，處理端分離到的線蟲數(shù)呈下降趨勢(shì)。IOh至36h，處理端分離到的線蟲從241.33 土 76.59頭下降為90.67 土 60.34頭。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是，線蟲被真菌小塊的VOCs吸引，逐漸向真菌移動(dòng)，隨著處理時(shí)間的延長，很多線蟲會(huì)被菌絲上的粘性孢子侵染，其運(yùn)動(dòng)性受到影響，難以從貝曼漏斗中分離出來。從分離結(jié)果上看，也有小部分線蟲會(huì)向?qū)φ斩艘苿?dòng)，且真菌的VOCs在對(duì)照端的濃度較弱，因此PSA培養(yǎng)基的VOCs對(duì)線蟲是否有吸引作用尚不能確定，會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中確定。由于每一根硅膠管滴加的供試線蟲數(shù)不能保證一致，因此分離線蟲時(shí)，分別統(tǒng)計(jì)達(dá)到濾紙棒兩側(cè)(均I cm長)的線蟲數(shù)，并用百分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。娃膠管法測(cè)定萬.vermicola真菌小塊*的VOCs吸引松材線蟲的效果(*真菌小塊的菌絲面積約0.1 cm2，菌絲量約0.05 mg)見圖1。實(shí)驗(yàn)2兩種生測(cè)方法靈敏度的比較
通過觀察梯度濃度的樣品溶液對(duì)松材線蟲的吸引效果，來比較“硅膠管法”與“水瓊脂平板法”這兩種生測(cè)方法靈敏度的差別。2.1梯度濃度的樣品溶液的配制
將α -菔烯和β -菔烯按照9:1的質(zhì)量比(Zhao等，2007 ；Zhao等，2009)，配成梯度溶液。取90 μ I α-菔烯和 ο μ I β _菔烯混合，溶解于無水乙醇(光譜純)中，配制成78 mg/ml 的溶液。依次梯度稀釋至 10 mg/ml, I mg/ml, KT1 mg/ml, I(T2 mg/ml, I(T3 mg/ml,10_4 mg/ml, 10_5 mg/ml等七個(gè)濃度的樣品溶液。每個(gè)濃度下的樣品溶液均取5 μ I滴加在小濾紙片(r=0.6 cm)上，對(duì)照為5 μ I的無水乙醇溶劑。分別用兩種生測(cè)方法生測(cè)，檢測(cè)各濃度下的樣品對(duì)松材線蟲的吸引效果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.2 “硅膠管 法”的生測(cè)
生測(cè)方法同1.1.2.5，結(jié)果分析同1.1.2.4.5ο2.3 “水瓊脂平板法”的生測(cè)
0.8%瓊脂平板的制作采用現(xiàn)有的方法。用尺子和記號(hào)筆在培養(yǎng)皿背面劃線，以平板中心為原點(diǎn)，將平板均勻的等分為四個(gè)象限。將各個(gè)濃度下的5 μ I樣品用微量進(jìn)樣器滴在小濾紙片(r=0.6 cm)上。靜置片刻，待溶劑揮發(fā)完，將濾紙片輕輕放在瓊脂平板上的第一或第二象限中，濾紙片離培養(yǎng)皿邊緣I cm;對(duì)照為5 μ I的無水乙醇溶劑，同樣滴在小濾紙片上，待溶劑揮發(fā)完，與處理相對(duì)放置，放在平板的第三或四象限中。立刻將培養(yǎng)皿蓋上蓋子，用Parafilm封口，28°C下避光靜置12 h。12 h后用Φ Icm的打孔器將濾紙和相應(yīng)的瓊脂塊取出，用紗布包好，置于貝曼漏斗中分離，28°C下靜置24 h后鏡檢。滴加樣品的濾紙片連同相應(yīng)Φ Icm的瓊脂塊記為處理端。滴加無水乙醇溶劑的濾紙片連同相應(yīng)Φ Icm的瓊脂塊記做對(duì)照端。結(jié)果分析方法同上。2.4結(jié)果與分析
2.4.1真菌E.vermicola的VOCs吸引松材線蟲的效果
在娃膠管的一端放入萬.vermicola真菌小塊,標(biāo)記為處理端；另一端放入PSA小塊,標(biāo)記為對(duì)照端。在硅膠管中間的小口處加入線蟲液，分別于10 h，24 h，36 h后分離線蟲。結(jié)果分析以處理端比例和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的雙尾檢驗(yàn)值(P值)來表示。結(jié)果見表1-1和圖1 O從表1-1和圖1可以看出疋的VOCs對(duì)松材線蟲有著非常強(qiáng)的吸引效果，該結(jié)果與王春燕在水瓊脂平板上的生測(cè)結(jié)果一致(Wang等，2010)。真菌小塊置于硅膠管中10 h后，處理端分離到241.33 土 76.59頭線蟲，處理端比例為88.45% 土
0.04 > 50%ο獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，p=0.000〈0.01,說明與對(duì)照相比真菌的VOCs有著極顯著的吸引效果。隨著時(shí)間的推移，24 h和36 h分離的結(jié)果顯示，真菌小塊對(duì)松材線蟲依然保持著很高的吸引效果，處理端比例分別是86.55% 土 0.10和85.16% 土
0.09(ρ〈0.001)。在透明硅膠管里，真菌小塊的菌絲面積約0.1 cm2，菌絲量約0.05 mg。真菌小塊和PSA小塊并未直接接觸到濾紙棒及其中的線蟲，因此，“硅膠管法”檢測(cè)的是VOCs對(duì)線蟲的作用。E.vermicola菌絲的VOCs在娃膠管的一側(cè)累積,逐漸在濕潤的濾紙棒里形成一定的濃度差，吸引滴加在濾紙棒中間的松材線蟲通過濾紙，向真菌小塊移動(dòng)。之前預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，將疋的菌絲刮成小團(tuán)，放入硅膠管中，對(duì)線蟲同樣有極顯著的吸引效果。24 h后檢測(cè)，處理端分離到174.00 土 31.32頭線蟲，處理端比例為85.02% 土 0.03。p=0.000<0.0l0以上結(jié)果表明萬.vermicola的活體菌絲能夠產(chǎn)生引誘松材線蟲的揮發(fā)性物質(zhì)。表1-1娃膠管法測(cè)定萬.vermicola真菌小塊*的VOCs吸引松材線蟲的效果
權(quán)利要求
1.一種影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，包括以下步驟:取內(nèi)腔容積在10至500 mm3的細(xì)管，在細(xì)管正中間開一用來滴加蒸餾水和線蟲液的小口，在細(xì)管的一側(cè)放入一個(gè)有產(chǎn)生活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)微生物的培養(yǎng)基小塊，或者含有活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)的樣品溶液的介質(zhì)，標(biāo)記為處理端；另一側(cè)放入一個(gè)未接種微生物或不含活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)的培養(yǎng)基小塊，標(biāo)記為對(duì)照端，再將細(xì)管兩側(cè)封口，用微量進(jìn)樣器從細(xì)管中間的小口處滴入線蟲液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于10 h，24 h，36 h后分離線蟲，28°C下靜置24h后鏡檢，統(tǒng)計(jì)分離到的線蟲數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，其特征在于:所述細(xì)管可采用玻璃、金屬、無揮發(fā)物的塑料等材料制成的細(xì)管。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，其特征在于:所述細(xì)管為透明硅膠管。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，其特征在于:所述在管內(nèi)居中放置適合于線蟲運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)，以硅膠管中間的小口處為中心居中放置于硅膠管中，在硅膠管中間的小口處緩慢注入蒸餾水，使介質(zhì)剛好全部濕潤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，其特征在于:所述介質(zhì)為經(jīng)滅活的線蟲實(shí)際生活環(huán)境`用土壤，木屑，棉線，濾紙棒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，其特征在于:所述透明娃膠管的內(nèi)徑為1-3 mm,長度為3-5 cm,空腔體積為23.55 mm3-353.25mm3 ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，其特征在于:所述含有活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)的樣品溶液的介質(zhì)為濾紙、培養(yǎng)基、玻璃毛。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種影響線蟲趨向行為的微生物揮發(fā)性化合物的生測(cè)方法，包括以下步驟取內(nèi)腔容積在10至500mm3的細(xì)管，在細(xì)管正中間開一用來滴加蒸餾水和線蟲液的小口，在細(xì)管的一側(cè)放入一個(gè)產(chǎn)生活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)的微生物培養(yǎng)基小塊，或者含有VOCs的樣品溶液的介質(zhì)(如濾紙、培養(yǎng)基、玻璃毛)，標(biāo)記為處理端；另一側(cè)放入一個(gè)未接種微生物或不含活性揮發(fā)性代謝物質(zhì)(VOCs)的培養(yǎng)基小塊或介質(zhì)，標(biāo)記為對(duì)照端，再將細(xì)管兩側(cè)封口，用微量進(jìn)樣器從細(xì)管中間的小口處滴入線蟲液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于10h，24h，36h后分離線蟲，28℃下靜置24h后鏡檢，統(tǒng)計(jì)分離到的線蟲數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明可方便地找出微量的甚至納克量級(jí)的具有引誘活性的化合物。
文檔編號(hào)A01K67/033GK103202268SQ20131009702
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者趙博光, 葉兼菱, 林峰, 王華光, 劉秀華 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)