專利名稱：破除南方紅豆杉種子休眠的方法
破除南方紅豆杉種子休眠的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物種子萌發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種破除南方紅豆杉種子休眠的方法。
背景技術(shù)：
南方紅豆杉是紅豆杉科紅豆杉屬植物，廣泛分布在歐洲、北美洲及東亞等北半球地區(qū)，國內(nèi)主要分布在我國長江流域及其以南各省。現(xiàn)代研究表明，其主要含有紫杉醇、10-脫乙酰巴卡亭III等紫杉烷類成分，以及少量的黃酮和多糖類等成分。其中，抗癌活性成分紫杉醇可通過抑制腫瘤細(xì)胞微管解聚而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，因其獨(dú)特的抗癌機(jī)制和顯著的療效而被用于治療肺癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌等惡性腫瘤。但紫杉醇在紅豆杉屬植物中含量普遍很低，其需求量逐年增加，剝皮、挖根、亂采濫伐等對紅豆杉屬植物的生存造成空前的壓力。大量的砍伐不僅對紅豆杉屬植物的物種保護(hù)和地區(qū)分布帶來威脅，而且也會造成資源的枯竭和物種的滅絕。
南方紅豆杉種子具有深休眠，種皮的透性、胚的發(fā)育情況、種子的發(fā)芽抑制物、溫度等影響其萌發(fā)，自然條件下需要兩冬一夏才能萌發(fā)，未經(jīng)特殊處理的形態(tài)成熟種子，一般需一年以上層積催芽方能解除休眠，發(fā)芽率低且不整齊，往往造成有限種子資源的極大浪費(fèi)。南方紅豆杉存在完整種皮時(shí)，種子處于明顯的無氧呼吸狀態(tài)，而高度缺氧條件下，可導(dǎo)致種子內(nèi)抑制物的形成，從而影響種子的生理后熟和萌發(fā)。種子形態(tài)成熟時(shí)，胚基本成熟，離體培養(yǎng)可以生長成苗；但外種皮的不透氣性和胚中的某些抑制物質(zhì)可能是抑制南方紅豆杉種子萌發(fā)的因素。有研究表明南方紅豆杉種子中含有的可能具有發(fā)芽抑制活性的物質(zhì)共有27種，有機(jī)酸類化合物9種，酯類化合物7種，醇類化合物7種，胺類化合物I種，醚類化合物I種，未知物質(zhì)2種。種子種皮效應(yīng)確實(shí)為影響南方紅豆杉種子萌發(fā)的因素之一，主要包括種皮的不透氣性和機(jī)械障礙。
為此，人們進(jìn)行了長期的探索，提出了各種各樣的解決方案。例如，中國專利文獻(xiàn)公開了一種打破南方紅豆杉種子休眠的方法[申請?zhí)?201110113040.3]，其特征在于利用變溫處理南方紅豆杉的種子，包括如下步驟:a、浸泡；b、貯藏；c、播種。通過該方法所實(shí)現(xiàn)了播種當(dāng)年出苗率可達(dá)30%。第二年還能再出苗50%左右，提高了育苗效率。上述方案雖然在一定程度上提高了南方紅豆杉種子萌發(fā)速度和萌發(fā)率，但是仍然存在著操作較為繁瑣，成本較高，發(fā)芽率較低等技術(shù)問題。還有人發(fā)明了一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法[申請?zhí)?201210201360.9]，包括:(I)種子外種皮剝離:利用機(jī)械破殼，手工剝離外種皮；(2)外植體消毒:依次經(jīng)70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用；(3)種子預(yù)處理:用無菌水密封常溫浸種1-5天；(4)分離合子胚；(5)試管苗的離體培養(yǎng):將種胚接種到試管苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，可以獲得99.9%的種子萌發(fā)率。這種方法雖然有效提高了發(fā)芽率，但是需要將種子外種皮剝離，顯然操作操作，種子外種皮剝離過程中容易導(dǎo)致種胚被損壞，整個(gè)過程費(fèi)時(shí)費(fèi) 力。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種易于實(shí)施，成本較低，能夠有效提高南方紅豆杉種子發(fā)芽率的破除南方紅豆杉種子休眠的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:本破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，本方法包括下述步驟:
A、酸蝕處理:將南方紅豆杉種子浸泡于質(zhì)量濃度為55% 65%硫酸的中2 4小時(shí)，取出后用流水沖洗12 36小時(shí)；
B、浸泡處理:將酸蝕后的南方紅豆杉種子浸泡于預(yù)先配置的含有萌發(fā)刺激素和細(xì)胞分裂素的混合溶液中至少3小時(shí)，取出后在清水中浸泡至少3天；
C、層積處理:將浸泡后的南方紅豆杉種子進(jìn)行低溫層積處理或變溫層積處理。
硫酸處理在加快胚形態(tài)后熟方面具有顯著效果，原因在于濃硫酸處理改善種皮透氣性，加快營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化；另外濃硫酸處理過程中所釋放的短暫熱量有可能激活與代謝和呼吸相關(guān)的酶，加快種子完成形態(tài)發(fā)育濃硫酸處理效果明顯，但易受種子個(gè)體發(fā)育差異、處理放熱、處理強(qiáng)度以及處理后沖洗狀況等因素的影響，使得處理時(shí)間難以掌握，過度浸泡有可能腐蝕種子。因此本發(fā)明將濃硫酸稀釋至質(zhì)量濃度為55% 65%后再對種子進(jìn)行酸蝕處理，這樣更容易確定酸蝕時(shí)間。濃硫酸優(yōu)化的質(zhì)量濃度為60%。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟A中，所述的硫酸的質(zhì)量濃度為58%-62%，浸泡時(shí)間為2.5 3.5小時(shí)，流水沖洗時(shí)間為20 28小時(shí)。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為外源生長調(diào)節(jié)劑，該外源生長調(diào)節(jié)劑包括GA3溶液、6-BA溶液和愛多收溶液，且外源生長調(diào)節(jié)劑浸泡時(shí)間為20 28小時(shí)。
GA3是一種萌發(fā)刺激物質(zhì)，在種子萌發(fā)的過程中，它能誘導(dǎo)產(chǎn)生水解酶，使種子中的貯藏物質(zhì)從大分子水解為可溶性的小分子，如淀粉水解為糖，蛋白質(zhì)水解為氨基酸，從而為胚所利用，促進(jìn)胚的生長和種子的萌發(fā)。6-BA屬于細(xì)胞分裂素類，對植物不同生長過程中起著重要作用，它能促進(jìn)細(xì)胞分裂，打破植物休眠。愛多收有效成份是單硝化愈創(chuàng)木酚鈉，是植物細(xì)胞賦活劑，能迅速滲透到植物體內(nèi)，以促進(jìn)細(xì)胞的原生質(zhì)流動，加快植物發(fā)根速度，對植物發(fā)根、生長、生殖及結(jié)果等發(fā)育均有不同程度的促進(jìn)作用。GA3、6-BA和愛多收濃度過高或過低均不利于種子發(fā)芽。GA3溶液的濃度過高會抑制胚的生長。愛多收溶液濃度過高或者過低都不利于葫蘆種子萌發(fā)率的提高。這與愛多收本身的雙重作用有關(guān)，即低濃度促進(jìn)種子萌發(fā)，而濃度過高時(shí)對植物有抑制作用。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的GA3溶液的質(zhì)量濃度為180 220mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的質(zhì)量濃度為4 6mg.I/1 ;所述的愛多收溶液稀釋5800 6200倍。愛多收溶液稀釋5800 6200倍是指愛多收稀釋5800 6200倍。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的GA3溶液的優(yōu)化質(zhì)量濃度為200mg*r1 ;所述的6-BA溶液的優(yōu)化質(zhì)量濃度為5mg -T1 ;所述的愛多收溶液優(yōu)化稀釋倍為6000 倍。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為混合營養(yǎng)液，該混合營養(yǎng)液包括GA3、6-BA、硼酸、檸檬酸、維生素E、維生素D、多效唑、谷氨酸鈉、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸銨、KN 03、PEG，且混合營養(yǎng)液浸泡時(shí)間為3.5 4.5小時(shí)。
混合營養(yǎng)液中GA3、6_BA等可調(diào)節(jié)代謝，誘導(dǎo)種子萌發(fā)酶的生成，促進(jìn)萌發(fā)；維生素E、維生素D、谷氨酸鈉、甘氨酸等可以在種子萌發(fā)過程中提高其所需要的營養(yǎng)成分。ΚΝ03、PEG等具有滲透調(diào)節(jié)作用，可以去除種皮和胚中不透氣的蠟質(zhì)；硼酸、檸檬酸、多效唑、吲哚丁酸、硝酸銨等可促進(jìn)種子萌發(fā)。PEG是一種高分子滲壓劑，可以提高種子的發(fā)芽率、幼苗活力等。鉀是植物體內(nèi)各種重要酶的活化劑，促進(jìn)糖分運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化及氮代謝，激活種子脫氫酶活性和增加呼吸強(qiáng)度，調(diào)節(jié)溶液水勢延緩種子吸水過程，使種子在萌發(fā)前有足夠的時(shí)間進(jìn)行膜系統(tǒng)修復(fù)和重要酶系的活化，改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和代謝狀態(tài)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。KNO3滲調(diào)處理打破休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)有一定的作用。檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸可以刺激植物生長，并可以將其作為生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在種子萌發(fā)的前處理中用有機(jī)酸浸種具有有促進(jìn)種子萌發(fā)、打破休眠、提高種子活力的效應(yīng)。多效唑作為一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，多效唑浸種可顯著提高決明子幼苗的葉綠素和可溶性糖含量，有利于光合產(chǎn)物的積累，增強(qiáng)幼苗根系活力，提高種子的簡易活力指數(shù)。對植物種子用少量硼酸處理，不僅能增強(qiáng)作物的抗旱、抗寒、抗病能力，還可以促進(jìn)種子發(fā)芽。吲哚丁酸是人工合成的生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑，對種子萌發(fā)和幼苗生長有一定的促進(jìn)作用。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的混合營養(yǎng)液的質(zhì)量份數(shù):GA3為0.8 1.2份、6-BA為1.8 2.2份、硼酸為0.8 1.2份、檸檬酸為0.8 1.2份、維生素E為0.8 1.2份、維生素D為0.8 1.2份、多效唑?yàn)?.8 2.2份、谷氨酸鈉為3.5 4.5份、甘氨酸為3.5 4.5份、吲哚丁酸為0.8 1.2份、硝酸銨為0.8 1.2份、KNO3為0.8 1.2份、PEG為4.5 5.5份、余量為水。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，所述的混合營養(yǎng)液的優(yōu)化質(zhì)量份數(shù):GA3為I份、6-BA為2份、硼酸為I份、朽1檬酸為I份、維生素E為I份、維生素D為I份、多效唑?yàn)?份、谷氨酸鈉為4份、甘氨酸為4份、吲哚丁酸為I份、硝酸銨為I份、KNO3為I份、PEG為5份、余量為水。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟C中，所述的低溫層積處理的溫度為2 5°C、沙子濕度為65% 75%、層積時(shí)間為42 48天。
在上述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法中，在上述的步驟C中，所述的變溫層積處理過程如下:放置3. 5 4.5°C冰箱處理38 42天，每隔4 6天翻動檢查一次，保持種子濕潤；然后取出，篩掉沙子，薄層陰干，移至20 24°C恒溫室沙藏48 52天；最后，3.5 4.5°C低溫沙藏28 32天。
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本破除南方紅豆杉種子休眠的方法的優(yōu)點(diǎn)在于:省時(shí)、有效、經(jīng)濟(jì)地破除休眠方法，以解決其休眠深、萌發(fā)難且發(fā)芽率低的問題，并為種子種苗市場流通提供標(biāo)準(zhǔn)，保證種子質(zhì)量。將其運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)栽培中，提高種子資源的利用率，對南方紅豆杉的育種栽培發(fā)展具有重大的意義。
具體實(shí)施方式
本破除南方紅豆杉種子休眠的方法包括下述步驟:
A、酸蝕處理:將南方紅豆杉種子浸泡于質(zhì)量濃度為55% 65%硫酸的中2 4小時(shí)，取出后用流水沖洗12 36小時(shí)；
B、浸泡處理:將酸蝕后的南方紅豆杉種子浸泡于預(yù)先配置的含有萌發(fā)刺激素和細(xì)胞分裂素的混合溶液中至少3小時(shí)，取出后在清水中浸泡至少3天；
C、層積處理:將浸泡后的南方紅豆杉種子進(jìn)行低溫層積處理或變溫層積處理。
在上述的步驟A中，硫酸的質(zhì)量濃度為58%_62%，浸泡時(shí)間為2.5 3.5小時(shí)，流水沖洗時(shí)間為20 28小時(shí)。
在上述的步驟B中，所述的混合溶液為外源生長調(diào)節(jié)劑，該外源生長調(diào)節(jié)劑包括GA3溶液、6-BA溶液和愛多收溶液，且外源生長調(diào)節(jié)劑浸泡時(shí)間為20 28小時(shí)。具體地說，GA3溶液的質(zhì)量濃度為180 220mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的質(zhì)量濃度為4 6mg.Γ1 ;所述的愛多收溶液稀釋5800 6200倍。愛多收溶液稀釋5800 6200倍是指愛多收稀釋5800 6200倍。其中，GA3溶液的優(yōu)化質(zhì)量濃度為200mg.Γ1 ；6-BA溶液的優(yōu)化質(zhì)量濃度為5mg.Γ1 ;愛多收溶液優(yōu)化稀釋倍為6000倍。
作為另一種方案，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為混合營養(yǎng)液，該混合營養(yǎng)液包括GA3、6-BA、硼酸、檸檬酸、維生素E、維生素D、多效唑、谷氨酸鈉、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸銨、KNO3> PEG,且混合營養(yǎng)液浸泡時(shí)間為3.5 4.5小時(shí)。具體地說，混合營養(yǎng)液的質(zhì)量份數(shù):GA3為0.8 1.2份、6-BA為1.8 2.2份、硼酸為0.8 1.2份、檸檬酸為0.8 1.2份、維生素E為0.8 1.2份、維生素D為0.8 1.2份、多效唑?yàn)?.8 2.2份、谷氨酸鈉為3.5 4.5份、甘氨酸為3.5 4.5份、吲哚丁酸為0.8 1.2份、硝酸銨為0.8 1.2份、KNO3為0.8 1.2份、PEG為4.5 5.5份、余量為水。其中，混合營養(yǎng)液的優(yōu)化質(zhì)量份數(shù):GA3為I份、6-BA為2份、硼酸為I份、朽1檬酸為I份、維生素E為I份、維生素D為I份、多效唑?yàn)?份、谷氨酸鈉為4份、甘氨酸為4份、吲哚丁酸為I份、硝酸銨為I份、KNO3為I份、PEG為5份、余量為水。
在上述的步驟C中，所述的低溫層積處理的溫度為2 5°C、沙子濕度為65% 75%、層積時(shí)間為42 48天。
作為另一種方案，在上述的步驟C中，所述的變溫層積處理過程如下:放置3.5 4.5°C冰箱處理38 42天，每隔4 6天翻動檢查一次，保持種子濕潤；然后取出，篩掉沙子，薄層陰干，移至20 24°C恒溫室沙藏48 52天；最后，3.5 4.5°C低溫沙藏28 32天。
實(shí)施例1 (含對比實(shí)施例):
本實(shí)施例所用試劑 如下:GA3:分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號:110418 ；6-芐氨基腺嘌呤(6-BA):分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號:110505 ;愛多收:分析純，旭化學(xué)有限公司，批號:20110701 ;濃硫酸:分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司，批號:20101009 ；NaC10:分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司，批號=20101230 ;無水乙醇:分析純，金華市先科化工廠，批號:110404。
①種子選取和處理
選取飽滿的南方紅豆杉種子，用質(zhì)量濃度60%濃硫酸浸泡3小時(shí)，流水沖洗24小時(shí)，分別配制0、50、200、400mg.L-1的GA3溶液，0、5、10、20mg.L—VBA溶液，將愛多收溶液分別稀釋2000、4000、6000倍。
正交實(shí)驗(yàn)因素水平表和試驗(yàn)安排表分別見表2-1和表2-2。種子浸泡24小時(shí)后，蒸餾水沖洗，然后再將其浸泡于清水中4天。試驗(yàn)重復(fù)3次。
表1-1試驗(yàn)因素和水平表
權(quán)利要求
1.一種破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，本方法包括下述步驟: A、酸蝕處理:將南方紅S.杉種子浸泡于質(zhì)量濃度為55% 65%硫酸的中2 4小時(shí),取出后用流水沖洗12 36小時(shí)； B、浸泡處理:將酸蝕后的南方紅豆杉種子浸泡于預(yù)先配置的含有萌發(fā)刺激素和細(xì)胞分裂素的混合溶液中至少3小時(shí)，取出后在清水中浸泡至少3天； C、層積處理:將浸泡后的南方紅豆杉種子進(jìn)行低溫層積處理或變溫層積處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，在上述的步驟A中， 所述的硫酸的質(zhì)量濃度為58%-62%，浸泡時(shí)間為2.5 3.5小時(shí)，流水沖洗時(shí)間為20 28小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為外源生長調(diào)節(jié)劑，該外源生長調(diào)節(jié)劑包括GA3溶液、6-BA溶液和愛多收溶液，且外源生長調(diào)節(jié)劑浸泡時(shí)間為20 28小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，所述的GA3溶液的質(zhì)量濃度為180 220mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的質(zhì)量濃度為4 6mg.Γ1 ;所述的愛多收溶液稀釋5800 6200倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，所述的GA3溶液的優(yōu)化質(zhì)量濃度為200mg.Γ1 ;所述的6-BA溶液的優(yōu)化質(zhì)量濃度為5mg.Γ1 ;所述的愛多收溶液優(yōu)化稀釋倍為6000倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，在上述的步驟B中，所述的混合溶液為混合營養(yǎng)液，該混合營養(yǎng)液包括GA3、6-BA、硼酸、檸檬酸、維生素E、維生素D、多效唑、谷氨酸鈉、甘氨酸、吲哚丁酸、硝酸銨、KN03、PEG，且混合營養(yǎng)液浸泡時(shí)間為3.5 4.5小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，所述的混合營養(yǎng)液的質(zhì)量份數(shù)=GA3為0.8 1.2份、6-BA為1.8 2.2份、硼酸為0.8 1.2份、檸檬酸為0.8 1.2份、維生素E為0.8 1.2份、維生素D為0.8 1.2份、多效唑?yàn)?.8 2.2份、谷氨酸鈉為3.5 4.5份、甘氨酸為3.5 4.5份、吲哚丁酸為0.8 1.2份、硝酸銨為0.8 1.2份、KNO3為0.8 1.2份、PEG為4.5 5.5份、余量為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，所述的混合營養(yǎng)液的優(yōu)化質(zhì)量份數(shù):GA3為I份、6-BA為2份、硼酸為I份、朽1檬酸為I份、維生素E為I份、維生素D為I份、多效唑?yàn)?份、谷氨酸鈉為4份、甘氨酸為4份、吲哚丁酸為I份、硝酸銨為I份、KNO3為I份、PEG為5份、余量為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，在上述的步驟C中，所述的低溫層積處理的溫度為2 5°C、沙子濕度為65% 75%、層積時(shí)間為42 48天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的破除南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，在上述的步驟C中，所述的變溫層積處理過程如下:放置3.5 4.5°C冰箱處理38 42天，每隔4 6天翻動檢查一次，保持種子濕潤；然后取出，篩掉沙子，薄層陰干，移至20 24°C恒溫室沙藏48 52天；最后，3.5 4.5°C低溫沙藏28 32天。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物種子萌發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種破除南方紅豆杉種子休眠的方法。它解決了現(xiàn)有技術(shù)萌發(fā)速度慢，出芽率低等技術(shù)問題。本方法包括下述步驟A、酸蝕處理將南方紅豆杉種子浸泡于質(zhì)量濃度為55%～65%硫酸的中2～4小時(shí)，取出后用流水沖洗12～36小時(shí)；B、浸泡處理將酸蝕后的南方紅豆杉種子浸泡于預(yù)先配置的混合溶液中至少3小時(shí)，取出后在清水中浸泡至少3天；C、層積處理將浸泡后的南方紅豆杉種子進(jìn)行低溫層積處理或變溫層積處理。其優(yōu)點(diǎn)在于省時(shí)、有效、經(jīng)濟(jì)地破除休眠方法，以解決其休眠深、萌發(fā)難且發(fā)芽率低的問題，并為種子種苗市場流通提供標(biāo)準(zhǔn)，保證種子質(zhì)量，對南方紅豆杉的育種栽培發(fā)展具有重大的意義。
文檔編號A01C1/00GK103202127SQ201310089480
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者張春椿, 熊耀康, 俞冰, 張水利, 李效賢, 蔣劍平 申請人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)