專利名稱：一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶品種的選育方法，更具體地說(shuō)，是涉及一種采用分子標(biāo)記輔助選擇法選育雙限性多絲量家蠶品種的育種方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)蠶繅絲在我國(guó)已經(jīng)有五千多年的歷史，是我國(guó)最具特色的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，也是我國(guó)能夠主導(dǎo)國(guó)際市場(chǎng)的少數(shù)產(chǎn)品之一，目前，我國(guó)的蠶繭和生絲產(chǎn)量均居世界第一，分別占世界總產(chǎn)量的70%左右。蠶絲業(yè)不僅對(duì)增加農(nóng)民收入和擴(kuò)大勞動(dòng)就業(yè)方面具有重要的作用，而且蠶的食物一桑樹(shù)在環(huán)境保護(hù)、退耕還林等方面也具有重要的作用和意義，因此，許多地區(qū)在生態(tài)保護(hù)和退耕還林中，把發(fā)展蠶桑業(yè)作為首選和重點(diǎn)項(xiàng)目。家蠶新品種選育是蠶絲業(yè)科技進(jìn)步的基礎(chǔ)和核心之一，在新中國(guó)成立后，我國(guó)的家蠶品種選育取得了巨大的成就，在全國(guó)范圍內(nèi)先后進(jìn)行了 4-5次蠶品種的更新?lián)Q代，極大地促進(jìn)了蠶絲業(yè)的發(fā)展。然而，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，勞動(dòng)力成本也隨之增加，在蠶種場(chǎng)繁育生產(chǎn)用一代雜交蠶種的過(guò)程中，蛹期的性別鑒定工作量巨大，而采用限性品種時(shí)，在幼蟲(chóng)期即可根據(jù)期斑紋將雌雄性別分開(kāi)，從而大大減少蛹期的工作量，達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的。目前，生產(chǎn)上使用的限性品種主要為中系限性品種，且主要為強(qiáng)健性的夏秋用品種如秋豐、871等，其絲量與春用品種還是有一定的差距。生產(chǎn)中使用的限性日系品種很少。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，本課題組主要成員參與了家蠶SSR分子遺傳連鎖圖的構(gòu)建，其中第的普斑(+P)、素斑(P)等位基因已經(jīng)被定位(Xuexia Miao等，PNAS，2005，102 (45): 16303-16308)，并篩選了家蠶繭絲性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitativetrait locus, QTL)的分子標(biāo)記(Shuai Zhan等,BMC Genomics, 2009Aug21; 10:389 ;王修業(yè)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士論文，2010年)。到目前為止，還沒(méi)有將分子標(biāo)記技術(shù)用于家蠶雙限性多絲量蠶品種選育的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明的目的是為了解決分子標(biāo)記用于家蠶雙限性多絲量蠶品種選育的技術(shù)問(wèn)題，提供一種采用分子標(biāo)記輔助選擇法選育雙限性多絲量家蠶品種的育種方法。技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明的一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，其技術(shù)方案包括如下步驟:(I)以多絲量春用品種“菁松”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個(gè)體為斑紋限性性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個(gè)體與“菁松”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個(gè)體與回交I代中雌性個(gè)體連續(xù)回交，獲得回交8代；對(duì)每一世代在飼育過(guò)程中進(jìn)行農(nóng)藝性 狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇絲量性狀的基因型，獲得遺傳背景與“菁松”相同，且為限性品種的JsQXian ；
(2)以多絲量春用品種“皓月”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個(gè)體為斑紋限性性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個(gè)體與“皓月”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個(gè)體與回交I代中雌性個(gè)體連續(xù)回交，獲得回交8代后自交2代；對(duì)每一世代在飼育過(guò)程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇其斑紋性狀和絲量性狀的基因型，自交后代選擇雌為普通斑，雄為素斑的蛾區(qū)繼代。獲得遺傳背景與“皓月”相同，且為限性品種的HyQXian ；(3)將目標(biāo)材料JsQXian與目標(biāo)材料HyQXian進(jìn)行雜交，獲雜交I代，即為雙限性
多絲量家蠶品種。步驟(I)、(2)所述的連續(xù)回交為至少8次。有益效果:本發(fā)明所提供的一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法與傳統(tǒng)的雜交回交育種技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)存在工作量大，選擇可靠性差，選育周期長(zhǎng)，目前常用的生產(chǎn)用春用多絲量家蠶品種如菁松、皓月、蘇鎮(zhèn)、春光等多為非限性品種或者僅中國(guó)系統(tǒng)為限性品種且主要是強(qiáng)健性，絲量相對(duì)較少的夏秋用蠶品種如秋豐、871等。本發(fā)明通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇輪回親本的遺傳背景和供體親本的目標(biāo)性狀，可在3-4年內(nèi)快速高效培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、繁育過(guò)程中用工省的雙限性多絲量家蠶新品系。本發(fā)明方法育成的品種“JsQXian” ；主要特征為，中系二化性四眠品種，幼蟲(chóng)為限性斑紋，雌為普通斑，雄為素斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā)育整齊，老熟齊涌，體質(zhì)強(qiáng)健，絲量多，與菁松相當(dāng)。催青經(jīng)過(guò)10日，幼蟲(chóng)期經(jīng)過(guò)23-24天，蛹期經(jīng)過(guò)14-15天，繭形橢圓，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.9-2.1g,繭層率24%左右，繭絲長(zhǎng)1350米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好，雌蛾產(chǎn)卵性能良好，單蛾卵數(shù)500-600粒，與HyQXian對(duì)交需推遲2日開(kāi)始飼養(yǎng)。

育成的品種“HyQXian” ；主要特征為，日系二化性四眠品種，幼蟲(chóng)為限性斑紋，雌為普通斑，雄為素斑，蠶體粗壯，食桑旺盛，發(fā)育整齊，老熟較齊，體質(zhì)強(qiáng)健，絲量多，與皓月相當(dāng)。催青經(jīng)過(guò)10日，幼蟲(chóng)期經(jīng)過(guò)24-25天，蛹期經(jīng)過(guò)15-16天，繭形淺束腰，繭色潔白，縮皺中等，全繭量1.8-2.0g,繭層率23.5%左右，繭絲長(zhǎng)1300米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活潑、交配性能好，雌蛾產(chǎn)卵性能良好，單蛾卵數(shù)500-600粒，與JsQXian對(duì)交需提前2日開(kāi)始飼養(yǎng)。


圖1.分子標(biāo)記S0106在HyQXian選育過(guò)程中對(duì)繭絲性狀的選擇的擴(kuò)增效果。L 皓月；2.(755X 皓月)Fl ;3.755 ;4-5.回交 I 代；6-7 ;回交 2 代；8-9.回交 3代；10-11.回交4代；12-13.回交5代；14-15.回交6代；16-17.回交7代；18-19.回交8代；20-24.自交后純合品種；圖2.分子標(biāo)記S0214在HyQXian選育過(guò)程中對(duì)斑紋性狀的選擇的擴(kuò)增效果圖。L 皓月；2.(755Χ 皓月)Fl ;3.755;4-5.回交 I 代；6-7;回交 2 代；8-9.回交 3代；10-11.回交4代；12-13.回交5代；14-15.回交6代；16-17.回交7代；18-19.回交8代；20-24.自交后純合品種
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:一、對(duì)采用材料的說(shuō)明已有的研究結(jié)果表明，家蠶繭絲性狀有多基因控制，目前已經(jīng)篩選到多個(gè)位點(diǎn)的分子標(biāo)記(王修業(yè).家蠶繭絲相關(guān)性狀QTL和無(wú)鱗毛基因nlw的定位.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士論文，2010 年 5 月；Shuai Zhan,等.An integrated genetic linkage map forsilkworms withthree parental combinations and its application to the mapping ofsingle genes and QTL BMCGenomics2009，10:389)。(一)、限性品種資源755(公知公用，《中國(guó)家蠶品種志》農(nóng)業(yè)出版社，1987年5月，第262頁(yè))；1、來(lái)源:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所選育的家蠶品種，目前生產(chǎn)上已經(jīng)不再使用，僅用作育種素材 。2、主要特征特性:中國(guó)系統(tǒng)、二化性，四眠。良卵率90.8%，普通孵化率91.0%，壯蠶體色青白，限性普通斑，雌普通斑，雄素斑，食桑旺盛，行動(dòng)活潑。繭橢圓形，全繭量1.6g，繭層量0.4g，繭絲長(zhǎng)1147m。催青經(jīng)過(guò)10日，幼蟲(chóng)期經(jīng)過(guò)24日7小時(shí)，蛹期經(jīng)過(guò)17日。(二 )、輪回親本菁松、皓月菁松X皓月是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所選育，在我國(guó)使用最為廣泛的一對(duì)家蠶雜交組合，它的產(chǎn)量高、絲質(zhì)優(yōu)、體質(zhì)強(qiáng)健，菁松幼蟲(chóng)為素斑，皓月幼蟲(chóng)為普通斑，是目前蠶業(yè)生產(chǎn)上使用最多的蠶品種。二、具體實(shí)施步驟:(I)、用菁松為輪回親本，755為限性斑紋性狀供體，用755雌與菁松雄進(jìn)行雜交后，得其Fl雌再與菁松雄連續(xù)回交，飼育過(guò)程中對(duì)品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合篩選，采用分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選，獲得遺傳背景與菁松相同，且幼蟲(chóng)為限性斑紋的JsQXian。(2)用皓月為輪回親本，755為限性斑紋性狀供體，用755雌與皓月雄進(jìn)行雜交后，得其Fl雌再與皓月雄連續(xù)回交8代后，自交2代，選擇雌為普通斑，雄為素斑的蛾區(qū)繼代。飼育過(guò)程中對(duì)品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行綜合篩選，采用分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選，獲得遺傳背景與皓月相同，且幼蟲(chóng)為限性斑紋的HyQXian。(3)用JsQXian與HyQXian進(jìn)行雜交，獲得雜交I代，即為雙限性多絲量家蠶品種。三、對(duì) 多絲量及斑紋基因的PCR的檢測(cè)提取待檢測(cè)的家蠶蛾的基因組DNA，取20_50ng作模板，用與繭絲性狀主效QTL連鎖的SSR或STS標(biāo)記C232S1、S0106、S2304、S2324 (4對(duì)引物均為公知公用，分別見(jiàn)文獻(xiàn):王修業(yè).家蠶繭絲相關(guān)性狀QTL和無(wú)鱗毛基因nlw的定位.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士論文，2010 年 5 月；Shuai Zhan, Jianhua Huang, Qiuhong Guo, Yunpo Zhao, WeihuaLi，Xuexia Miao，Marian R Goldsmith，Muwang Li and Yongping Huang.An integratedgeneticlinkage map for silkworms with three parental combinations and itsapplication to the mapping ofsingle genes and QTLBMC Genomics2009，10:389)，用與等位基因普通斑(+P)/素斑(P)連鎖的SSR標(biāo)記S0215和S0214(公知公用，間文獻(xiàn)XuexiaMiao 等，Simple sequencerepeat-based consensus linkage map of Bombyx mor1.PNAS,2005，102 (45): 16303-16308)檢測(cè)日本系統(tǒng)品種中的斑紋基因。
C232S1 引物序列:左端引物序列:5'-GTCCGGTATACGCGAACATT-3'右端引物序列:5'-GGCGATACCGTTGTTTCATT-3'SO106引物序列:左端引物序列:5'-GCATTCAAACCTAAGTCAAATCAAA-3'右端引物序列:5'-TGGCACAGTCTTTATGTTTGGCT-3'S2304引物序列:左端引物序列:5'-ATGACAATACGCTTTATCACCAGG-3'右端引物序列:5'-ATGGGTTAGTTCGCTCGTCG-3'S2324引物序列:左端引物序列:5'-CGTTTATACCATCGCACCGC-3'右端引物序列:5'-TTATGGGTACGCATACAGTCCAA-3'S0214引物序列:左端引物序列:5'-CAGGTCGGTTGATGCCCATT-3'右端引物序列:5'-CATCCGTCATCCACAAGCCT-3'S0215引物序列:左端引物序列:5'-CAGCGTGACCAAGCGGAATG-3'右端引物序列:5'-CCGAAAITTGTAATGTAAAAGAACTCA-3'PCR反應(yīng)程序按照文獻(xiàn)的程序:95°C變性3min，63°C退火40s，72°C延伸Imin ；16個(gè) Touchdown 循環(huán)，94°C、45s，退火溫度依次遞減 0.5°C直到 56°C 40s，72°C Imin ；94°C 40s,56°C 40s, 72°C lmin，24 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物用 eGene 的 HAD-GT12 全自動(dòng)毛細(xì)管核酸分析系統(tǒng)檢測(cè)?；亟贿^(guò)程中BCl代選擇的個(gè)體PCR產(chǎn)物經(jīng)HAD-GT12全自動(dòng)毛細(xì)管核酸分析系統(tǒng)檢測(cè)為2條帶的，為雜合型，為I條帶的為純合型，由于是與菁松、皓月回交，因此，繭絲性狀的標(biāo)記分別選擇與菁松、皓月一致的純合型條帶，淘汰雜合型條帶個(gè)體，從而純合基因。(附圖1為分子標(biāo)記S0106在HyQXian選育過(guò)程中對(duì)繭絲性狀的選擇的擴(kuò)增效果。)斑紋限性的性狀選擇中，由于菁松的素斑相對(duì)普斑為隱性性狀，因此，在菁松回交過(guò)程中，無(wú)需進(jìn)行特別的選擇，只需選擇農(nóng)藝性狀即可。而對(duì)于皓月回交的過(guò)程中，所有個(gè)體的表現(xiàn)型均為普通斑，因此，需要選擇S0214和S0215表現(xiàn)為雜合的個(gè)體繼代，用皓月的雄連續(xù)回交8代后自交后代，選擇S0214和S0215均表現(xiàn)與755 —致的純合型繼代，淘汰雜合型位點(diǎn)的個(gè)體，從而保證第二染色體上的P位點(diǎn)為純合型素斑基因P。(附圖2.分子標(biāo)記S0214在HyQXian選育過(guò)程中對(duì)斑紋性狀的選擇的擴(kuò)增效果圖。)SEQUENCE LISTING〈110〉江蘇科技大學(xué)〈120〉一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法〈130〉

<160>12<170>PatentIn version3.3<210>權(quán)利要求
1.一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以多絲量春用品種“菁松”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個(gè)體為斑紋限性性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個(gè)體與“菁松”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個(gè)體與回交I代中雌性個(gè)體連續(xù)回交，獲得回交8代；對(duì)每一世代在飼育過(guò)程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇絲量性狀的基因型，獲得遺傳背景與“菁松”相同，且為限性品種的JsQXian ； (2)以多絲量春用品種“皓月”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個(gè)體為斑紋限性性狀供體親本進(jìn)行雜交，得雜交I代；再用雜交I代的雌性個(gè)體與“皓月”回交，獲得回交I代；之后用輪回親本雄性個(gè)體與回交I代中雌性個(gè)體連續(xù)回交，獲得回交8代后自交2代；對(duì)每一世代在飼育過(guò)程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，留種個(gè)體采用分子標(biāo)記選擇其斑紋性狀和絲量性狀的基因型，自交后代選擇雌為普通斑，雄為素斑的蛾區(qū)繼代，獲得遺傳背景與“皓月”相同，且為限性品種的HyQXian ； (3)將目標(biāo)材料JsQXian與目標(biāo)材料HyQXian進(jìn)行雜交，獲雜交I代，即為雙限性多絲量家蠶品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，其特征在于:步驟(I)、(2)所述的連續(xù)回交為 至少8次。
全文摘要
一種雙限性多絲量家蠶品種的選育方法，包括如下步驟以多絲量春用品種“菁松”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個(gè)體為斑紋限性性狀供體親本進(jìn)行雜交，獲得限性品種的JsQXian；以多絲量春用品種“皓月”為輪回親本，資源保存的限性品種“755”雌性個(gè)體為斑紋限性性狀供體親本進(jìn)行雜交對(duì)每一世代在飼育過(guò)程中進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，獲得限性品種的HyQXian；將目標(biāo)材料JsQXian與目標(biāo)材料HyQXian進(jìn)行雜交，即為雙限性多絲量家蠶品種。本發(fā)明通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇輪回親本的遺傳背景和供體親本的目標(biāo)性狀，可在3-4年內(nèi)快速高效培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、繁育過(guò)程中用工省的雙限性多絲量家蠶新品系。
文檔編號(hào)A01K69/04GK103081872SQ20131004273
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者李木旺, 侯成香, 譚安江, 黃勇平 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)