專利名稱：大花金雞菊葉中β-谷甾醇的提取方法及其新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是提供一種大花金雞菊中β-谷留醇的提取方法及其用途。
背景技術(shù)：
大花金雞菊((Sbreop1Si1S grandiflora Hogg.)又名劍葉波斯菊、狹葉金雞菊和劍葉金雞菊，是菊科金雞菊屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)美洲，1938年作為觀賞植物傳入我國(guó)，是外來(lái)雜草之一。該草耐貧瘠，抗污染，繁殖力強(qiáng)，因此在我國(guó)許多地區(qū)大量種植，并逃逸為野生雜草，資源豐富。已有研究表明，該植物根莖葉的揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌等均具有抑制作用(李希紅，陳榮，紀(jì)付江.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,37(23):10996，10998.)，從該植物花中分離得到的KPY-78-菊黃色素被用于食品添加劑(李鴻英，陸長(zhǎng)根，李秀華.植物學(xué)報(bào).1981,23(6) :511-514.);而根、莖、葉三種器官的水浸提液能不同程度的抑制白菜、Brassica pekinensi5·入胡蘿卜iDaucus caro ia入狗牙根iCynodon dactylon)^ 翦股穎 iAgrostis infirma)、結(jié)縷草iZoysia japonica)、二月蘭(Orychophragmus violaceus)>{Dianthus和雞冠花cristata)等植物的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)(曾建軍，楊麗英，孫敏.西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，31 (6) :88-91 ;郭榮群，趙宏，張柯，江征，楊振美，聞啟.北方園藝，2010(4) :45-48 ;杜明利，高巖，張汝民，等·浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(I) : 109-114)。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)大花金雞菊的根、莖、葉、葉柄、花、萼片及種子粉末對(duì)生菜、反枝莧、黃瓜、苘麻、小麥和稗等受體植物幼苗的生長(zhǎng)均具有很高的抑制活性(趙妹，羅小勇，儀銘，孟昭禮.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,36(3) :369-372)。在對(duì)大花金雞菊葉中有效成分的進(jìn)一步研究中，首次從中分離到β -谷甾醇(β -sitosterol),并首次發(fā)現(xiàn)其具有高除草活性，從而完成了本發(fā)明。盡管此前，已經(jīng)從天癸(吳雪平.貴州大學(xué)，2004)、大葉兔尾草(陳艷.廣西中醫(yī)學(xué)院，2005)、大三葉升麻(劉彥儒.第二軍醫(yī)大學(xué)，2011)、花木藍(lán)(李春 正.天津大學(xué)，2006)、綠舒筋(徐滿珍.華中科技大學(xué)，2007)、燈心草(李紅霞.中南民族大學(xué)，2007)、三椏苦(刁遠(yuǎn)明.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2005，)、枇杷花(李琪，四川師范大學(xué)，2009)、紅藥(王滿元，中國(guó)中醫(yī)研究院，2002)、紫花地丁 (楊鵬鵬，聞福林，梁一兵，等.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25 (2) : 185-187)、天葵子(藍(lán)華英.天津大學(xué)，2006)、無(wú)花果(徐?？?，胡疆，柳潤(rùn)輝，等.藥學(xué)服務(wù)與研究，2005，5(2):138-140)和白頭翁(丁秀娟.蘇州大學(xué)，2010)等多種植物中被分離到，但尚未見其農(nóng)用除草活性的任何報(bào)道。而且，本發(fā)明中所述的提取分離方法，系采用活性追蹤法一步步探索而成，它非常適合于大花金雞菊中該物質(zhì)的提取分離，提取分離的過(guò)程及方法不同于上述植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于從大花金雞菊中分離出活性物質(zhì)谷甾醇。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供所述化合物的提取方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述化合物的農(nóng)藥用途，更進(jìn)一步的是提供該化合物的除草用途。具體的，一種大花金雞菊中谷留醇的提取方法,包括如下步驟
取大花金雞菊葉干粉，用體積比100%乙醇浸泡提取5 - 7次，每次時(shí)間為2 — 4d，提取液合并后經(jīng)真空抽濾和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得乙醇提取浸膏，將乙醇提取浸膏加入10-20倍重量蒸餾水混懸后，加入等量石油醚萃取7 — 9次，回收溶劑后得石油醚萃取物浸膏，取石油醚萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，依次用石油醚+乙酸乙酯，以及乙酸乙酯+甲醇進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)獲得的餾分再用石油醚+丙酮進(jìn)行梯度洗脫得到β-谷甾醇。優(yōu)選的，用濃度為100%乙醇提取6次，每次時(shí)間為3d，用石油醚萃取8次，取石油醚相繼續(xù)分離。
具體實(shí)施方式
·本發(fā)明所述的化合物具有下列結(jié)構(gòu)式
該化合物是從大花金雞菊的干葉中提取。具體的，將植物大花金雞菊干燥葉的粗粉用100%乙醇提取，提取液減壓回收溶齊U，得乙醇提取浸膏；取浸膏加20倍量蒸餾水混懸后，加入石油醚萃??；回收溶劑后得石油醚萃取物；石油醚萃取物經(jīng)娃膠柱色譜，依次用(100 — O) : (O — 100)或表不為100 0 —O :100體積比的石油醚+乙酸乙酯、(50 - O) : I或表示為50 :1 — O 1的乙酸乙酯+甲醇進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)獲得的懼分再用體積比(20 — 1)(1 — O)或表不為20 :1 — I 0的石油醚+丙酮進(jìn)行梯度洗脫得到本發(fā)明的活性物質(zhì)。本發(fā)明所述化合物具有較強(qiáng)的抑制植物幼苗生長(zhǎng)的活性。具體來(lái)說(shuō)本發(fā)明所分離的化合物對(duì)夏至草幼苗胚根和胚軸的生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，可用于直接開發(fā)植物源除草劑或作為先導(dǎo)化合物開發(fā)仿生除草劑。
通過(guò)實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例I化合物谷甾醇的提取
取5000g大花金雞菊葉干粉末，用100%乙醇溶液(8000mL)浸泡提取6次，時(shí)間為每次3d。期間每隔6小時(shí)攪拌一次。提取液合并后經(jīng)真空抽濾和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到乙醇提取浸膏495g ;將乙醇提取浸膏480g加入20倍量蒸餾水混懸后，加入等容量石油醚萃取8次，回收溶劑后得石油醚萃取物浸膏135g ;取石油醚萃取物50g經(jīng)硅膠柱色譜，依次用100:0、100:1、100:2、100:4、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1 和 0:100 體積比的石油醚 + 乙酸乙酯混合溶劑和50:1、10:1、5:1和0:1體積比的乙酸乙酯+甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到ΑΓΑ8共8個(gè)餾分；對(duì)A5餾分用體積比20:1、10:1、5:1和I: O的石油醚+丙酮混合溶劑進(jìn)行進(jìn)一步的分離，得到β_谷甾醇，為無(wú)色針狀結(jié)晶。對(duì)上述分離的化合物β -谷留醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，所得波譜數(shù)據(jù)如下
1H-NMR (500 MHz，CDCl3) 5 :5. 35 (1Η, s)，3. 50 (1Η, m)。13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 5:37.2 (C-1)，31. 5 (C-2)，78. 3 (C-3)，39. 7 (C-4)，140. 7 (C-5)，121. 6 (C-6), 31. 8 (C-7) ,31.8 (C-8), 50. O (C-9), 36. 4 (C-10), 21. O (C-Il)，39. 7 (C-12)，42. 2 (C—13)，56. 7 (C—14)，23. O (C-15)，28. 2 (C—16)，56. O (C—17)，11. 8 (C-18)，19. O (C-19)，36. I (C-20)，18. 7 (C—21)，25. 9 (C-22)，23. O (C-23)，45. 7 (C-24)，29. O (C—25)，19. 3 (C—26)，19. 8 (C—27)，33. 8 (C—28)，11. 9 (C—29)。實(shí)驗(yàn)例2 β -谷留醇及其每個(gè)提取階段的除草活性 O實(shí)驗(yàn)材料
生菜、小麥、夏至草、稗 2)實(shí)驗(yàn)方法
瓊脂法將受體植物種子經(jīng)O. 2%次氯酸鈉溶液浸泡15min后，用自來(lái)水沖洗數(shù)次并置流水下浸泡吸水3 5h左右，而后用蒸餾水洗滌數(shù)次，均勻擺放在帶蓋方盤內(nèi)的吸水紙上，滴加蒸餾水至種子不漂浮，遮光置于全智能人工氣候箱(HP1000GS-B型，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)內(nèi)發(fā)芽，待胚根(或種子根)達(dá)3 5mm時(shí)移植至混有各階段提取物的O. 5%瓊脂凝膠(事先配制IOOmL,并均勻分注至3個(gè)小燒杯中)上，各提取物的浸膏需事先分別用O. 5ml DMSO溶解后再加入至瓊脂溶液中配制含毒基質(zhì)，各處理(含空白對(duì)照)中DMSO最高濃度為O. 5%，且在配置后待瓊脂凝固后再進(jìn)行處理，在該濃度下對(duì)受體植物的生長(zhǎng)沒有不良影響。以不含提取物的O. 5%瓊脂凝膠(含O. 5% DMS0)為空白對(duì)照。移植時(shí)先用尖嘴鑷子在已凝固的瓊脂表面插5個(gè)小孔，之后分別夾取胚根長(zhǎng)度基本一致的預(yù)萌發(fā)受體植物種子，將胚根(或種子根)垂直由小口輕輕植入瓊脂凝膠中。每燒杯5粒，重復(fù)3次。為防止光照對(duì)化合物及植物幼根生長(zhǎng)的影響，將各燒杯放入人工氣候箱遮光培養(yǎng)3 4d。其中，生菜和小麥均培養(yǎng)2d,夏至草和稗均培養(yǎng)4d。人工氣候箱設(shè)置為14h (25°C )和IOh(20°C)的自動(dòng)循環(huán)，箱內(nèi)相對(duì)濕度為60%。待處理結(jié)束后，用電子游標(biāo)卡尺分別測(cè)量受體植物幼苗胚根(或種子根)和胚軸(或胚芽鞘)的長(zhǎng)度，以各植物胚根(種子根)和胚軸(胚芽鞘)的實(shí)際生長(zhǎng)量計(jì)算有效中量(EC5Q)。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從大花金雞菊葉中提取分離谷留醇共分為乙醇提取、石油醚萃取、柱色譜分離等階段。每個(gè)階段的除草活性見表f 3。
表I大花金雞菊葉乙醇提取物抑制夏至草和稗植物幼苗的EC5tl
一置信區(qū)間
受體植物 -
_胚根(種子根) 胚軸(胚芽鞘)
個(gè):I·,'I: 0.159/(!. 12-0.21(!.595/0.46-0.76
稗(1.489/().39-(1.613.426/2.450.26
表2大花金雞菊葉乙醇提取物的石油醚相對(duì)生菜、小麥、夏至草和稗幼苗生長(zhǎng)的抑制
權(quán)利要求
1.一種大花金雞菊葉中β-谷留醇的提取方法，其特征在于包括如下步驟 取大花金雞菊葉干粉，用體積比100%乙醇浸泡提取5 - 7次，每次時(shí)間為2 — 4d，提取液合并后經(jīng)真空抽濾和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得乙醇提取浸膏，將乙醇提取浸膏加入10-20倍重量蒸餾水混懸后，加入等量石油醚萃取7 — 9次，回收溶劑后得石油醚萃取物浸膏，取石油醚萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，依次用石油醚+乙酸乙酯，以及乙酸乙酯+甲醇進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)獲得的餾分再用石油醚+丙酮進(jìn)行梯度洗脫得到β-谷甾醇。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于石油醚萃取物經(jīng)硅膠柱色譜，依次用1000~0100體積比的石油醚+乙酸乙酯、50 :1 O :1的乙酸乙酯+甲醇進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)獲得的餾分再用體積比20 :1 I :0的石油醚+丙酮進(jìn)行梯度洗脫。
3.如權(quán)利要求I一 2任一所述的方法，其特征在于用濃度為100%乙醇提取6次，時(shí)間分別為3d，用石油醚萃取8次，并對(duì)石油醚萃取物進(jìn)行柱色譜分離。
4.β_谷留醇的除草用途，所述的β_谷留醇是按權(quán)利要求I 一 2任一所述的方法提取的。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學(xué)與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是提供一種大花金雞菊葉中β-谷甾醇的提取方法，包括取大花金雞菊葉干粉，用乙醇提取、石油醚萃取，經(jīng)硅膠柱色譜，依次用石油醚+乙酸乙酯，乙酸乙酯+甲醇進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)獲得的餾分用石油醚+丙酮進(jìn)行二級(jí)梯度洗脫得到β-谷甾醇。本發(fā)明進(jìn)一步提供β-谷甾醇的除草新用途。
文檔編號(hào)A01N45/00GK102911236SQ201210326940
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者羅小勇, 郭鳳 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)