專利名稱：一種薄荷節(jié)間莖段高效再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種薄荷節(jié)間莖段高效再生的方法建立
背景技術(shù)：
薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)的莖、葉中富含揮發(fā)油,被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、香料、煙草等工業(yè)。薄荷全草入藥，用于治療風(fēng)熱感冒、風(fēng)溫初起、頭痛、目赤、喉痹、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙痛、蕁麻疹、風(fēng)疹等。薄荷是我國重要的香料和藥用植物之一，在江蘇、安徽、江西等地廣為栽培，已成為當(dāng)?shù)刂匾霓r(nóng)業(yè)特種經(jīng)濟(jì)作物。但是在薄荷生產(chǎn)中出現(xiàn)的品種單一、品種退化現(xiàn)象，使薄荷的育種工作越來越引人注目。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育薄荷優(yōu)良新品種，具有目的基因來源廣，可定向改變目標(biāo)性狀的優(yōu)點(diǎn)。建立一種高效的組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)并最終將其建立成轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)是獲得轉(zhuǎn)基因育種成功的關(guān)鍵。目前針對國內(nèi)薄荷品種的快速繁殖系統(tǒng)主要以莖尖為再生材料，但該方法莖尖繁殖時(shí)間短適合于薄荷品種的大規(guī)模擴(kuò)繁并不適用于遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立。因此，為了便于更好的開展國內(nèi)中藥薄荷品種的遺傳轉(zhuǎn)化研究，必須建立一種完善的的中藥薄荷主栽品種的遺傳轉(zhuǎn)化受體·系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種中藥薄荷品種的高效再生遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。本發(fā)明以國內(nèi)薄荷栽培品種為對象，建立了高再生率、穩(wěn)定、重復(fù)性好的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，為利用基因工程技術(shù)進(jìn)行遺傳育種奠定基礎(chǔ)。對我國薄荷種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良等方面具有積極作用和現(xiàn)實(shí)意義具體內(nèi)容I、本發(fā)明提供一種薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)莖段組織培養(yǎng)快繁新方法，按以下次序的幾個(gè)步驟進(jìn)行(I)外植體的采集和無菌體系的建立3 6月份采集薄荷頂芽，洗衣粉溶液浸泡15min后，流水沖洗30min。接種前用75% (V/V)酒精消毒30s，再用0. 2% (m/V)HgC12溶液浸泡15min，無菌水沖洗3次。吸干表面水份后，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成0. 5cm長的莖尖，接種在下列培養(yǎng)基中
6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.5- 2.0 mg-L'1
萘乙酸(NAA)0_1 0.3 mg.L-1
I
蔗糖25 35 g-L'1
瓊脂5.0 6.0 g-L'1
pH5.6- 6.0在溫度25±3°C，光照度1500 30001x，光照時(shí)間10 12h/d，培養(yǎng)25 45d后繼代于相同培養(yǎng)基上30d后獲得無菌苗材料。(2)、節(jié)間莖段不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)在無菌條件下，將無菌材料第2，3，4節(jié)間莖段接種到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。MS基本培養(yǎng)基
噻苯隆(TDZ)2.0-4.0 mg-L'1
吲哚乙酸(IAA)0.2- 0.5 mg-L'1
椰汁(CW)20%~25% mg-L'1·蔗糖25 35 g-L'1
瓊脂5.0~ 6.0 g-L'1
pH5.6 6.0在溫度25 ± 3°C，暗培養(yǎng)40 50d，節(jié)間莖段不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)90 %以上。(3)、不定芽繼代生長培養(yǎng)將步驟(2)獲得的不定芽剪下，接種到下列培養(yǎng)基中。MS基本培養(yǎng)液
6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.5- 1.0 mg-L—1
萘乙酸(NAA)0.1~0.5mg.L-1
蔗糖25 35 g-L'1
瓊脂5.0~ 6.0 g-L-1
pH5.6- 6.0在溫度25±3°C，光照度1500 30001x，光照時(shí)間10 12h/d，培養(yǎng)30d;(4)、壯苗培養(yǎng)為進(jìn)一步提高移栽成活率的在生根前需進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。將步驟
(3)獲得的不定芽轉(zhuǎn)入下列壯苗培養(yǎng)基中。MS基本培養(yǎng)液
6-節(jié)基氨基嘌呤(6-BA)0.5~1.0 mg-L"1
萘乙酸(NAA)0.3- O.Smg-L"1
蔗糖20~ 30 g-L'1
瓊脂5_0 6.0 g-L'1
pH5.6- 6.0在溫度25±3°C，光照度1000 20001x，光照時(shí)間10 12h/d。培養(yǎng)20 35d。(5)、生根培養(yǎng)將步驟(4)獲得株高5. 0 8. Ocm的無菌苗，轉(zhuǎn)入下列生根培養(yǎng)基中。1/2MS基本培養(yǎng)基
6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.1 0.5 mg.!；1
萘乙酸(NAA)0.5 1.0 mg-L4
蔗糖20~ 30 g-L_1
瓊脂5.0~ 6.0 g-L'1
pH5.6 6.0在溫度25±3°C，光照度1000 20001x，光照時(shí)間10 12h/d。培養(yǎng)15 20d后，生根率可達(dá)90%以上，葉色濃綠，生長健壯。有益效果本發(fā)明通過節(jié)間莖段不定芽再生體系的成功構(gòu)建，完成了外植體的選取、誘導(dǎo)分化、壯苗、生根等關(guān)鍵技術(shù)。這種再生體系不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)95%，高效穩(wěn)定、重復(fù)性好，不定芽再生周期短，適用于作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但實(shí)施例僅是示例性的，對本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，而這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例一薄荷品種‘738’節(jié)間莖段不定芽再生，按以下次序的幾個(gè)步驟進(jìn)行I、外植體的采集和無菌體系的建立3 6月份采集薄荷頂芽，洗衣粉溶液浸泡15min后，流水沖洗30min。接種前用75% (V/V)酒精消毒30s，再用0.2% (m/V)HgC12溶液浸泡15min，無菌水沖洗3次。吸干表面水份后，剝?nèi)ネ鈱尤~片，切成0. 5cm長的莖尖，接種在含I. Omg .L-1BA和0. 2mg .L-INAA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含5. 6g L-I瓊脂、30g L-I蔗糖，pH5. 5 5. 8，121°C滅菌20min。培養(yǎng)溫度為25°C，光照時(shí)間8 10h，光照強(qiáng)度1500 20001x。培養(yǎng)三周后選健康無菌的植株接種于相同培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)30d。2、節(jié)間莖段不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)選擇經(jīng)初代培養(yǎng)的無菌薄荷苗形態(tài)學(xué)第2，3，4位置不帶節(jié)莖段作為誘導(dǎo)不定芽的材料。將鱗片下部接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+CW25%+TDZ3. Omg L-1+IAA0. 2mg L-I+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 5. 6g/L，pH5. 8)中進(jìn)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25 ± 3°C，暗培養(yǎng)40d。不定芽分化率可達(dá)95 %以上。3、不定芽伸長培養(yǎng)將分化出的不定芽接種在含I. Omg -L^1BA和0. 2mg -U1MA的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含5. 6g .L—1瓊脂、30g .L—1蔗糖，pH5. 5 5. 8，121。。滅菌20min。培養(yǎng)溫度為25±3°C，光照時(shí)間8 10h，光照強(qiáng)度1500 20001x。

4、壯苗培養(yǎng)將步驟4所獲得離體植株，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(MS+6-BA1. Omg I^+NAAO. 5mg I71+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 8g/L，pH5. 8)中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25±3°C，光照度15001x，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)30d后，再生植株葉色濃綠，生長健壯。5、生根培養(yǎng)將步驟4所獲得5 8cm小苗接種到生根培養(yǎng)基(MS+6-BA0. 2mg +NAAO. 5mg .171+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 8g/L，pH5. 8)中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。培養(yǎng)30d后生根率達(dá)95%以上，生根數(shù)5-10條。所有上述實(shí)驗(yàn)過程中所用到的試劑，均可購自Sigma和上海生工生物工程有限公
司?！?br> 權(quán)利要求
1.一種薄荷節(jié)間莖段高效再生的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)外植體的選取與消毒取薄荷莖尖作為外植體，沖洗干凈后，進(jìn)行消毒； (2)節(jié)間莖段不定芽的誘導(dǎo)取步驟(I)中得到的無菌苗節(jié)間作為外植體，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25±3°C，暗培養(yǎng)40天；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基并添加激素TDZ、IAA ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中TDZ濃度為2. 0-4. Omg · L-I, IAA濃度為O.2-0. 5mg · L-I ； (3)不定芽繼代生長將步驟(2)中誘導(dǎo)出的不定芽剪下接入不定芽繼代生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，所述所述繼代生長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和NAA ;所述繼代生長培養(yǎng)基中6-BA濃度為O. 5-1. Omg · L_\ NAA濃度為O. 1-0. 5mg · Γ1 ;所述正常培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25±3°C，光照時(shí)間8-10h，光照強(qiáng)度1500-20001x ； (4)無菌苗的壯苗培養(yǎng)將步驟(3)中的到的無菌苗接種于壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-35天，所述所述繼代生長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和NAA ;所述繼代生長培養(yǎng)基中6-BA濃度為O. 5-1. Omg · L_\ NAA濃度為O. 3-0. 5mg · Γ1 ;所述正常培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25±3°C，光照時(shí)間 8-10h，光照強(qiáng)度 1500-20001x ； (5)生根培養(yǎng)將步驟(4)獲得的無菌苗接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和NAA ;所述繼代生長培養(yǎng)基中6-BA濃度為O.1-0. 5mg · L-1，NAA濃度為O. 5-1. Omg · L-1 ;所述正常培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25±3°C，光照時(shí)間8-10h，光照強(qiáng)度1500-20001x ； 上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中均含有瓊脂5. 5-7. Og/L、蔗糖 25-35g/L，且 pH 值為 5. 6-5. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述薄荷節(jié)間莖段不定芽誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟(2)中的節(jié)間外植體為(I)步驟所得無菌苗第2，3，4節(jié)節(jié)間莖段。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述薄荷節(jié)間莖段不定芽誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟(2)中還含有椰汁，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中椰汁濃度為20% -25%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述薄荷節(jié)間莖段不定芽遇到方法，其特征在于所訴步驟(2)中的正常培養(yǎng)時(shí)間為40天；所述步驟(3)中繼代生長培養(yǎng)時(shí)間為30天；所述步驟(4)中的壯苗生長時(shí)間為20-35天；所述步驟(5)中生根培養(yǎng)時(shí)間為15-20天。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一所述薄荷不節(jié)間莖段不定芽誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟(I)中莖尖外植體取材于3 6月份；所述步驟(I)中進(jìn)行消毒的過程為將外植體用洗衣粉溶液浸泡15分鐘后，流水沖洗20-30min。于無菌操作臺(tái)上75%乙醇消毒30秒，再用O. 2% HgCl2溶液浸泡15分鐘，無菌水沖洗3次。
所述節(jié)間莖段材料為無菌苗形態(tài)學(xué)第2，3，4節(jié)間莖段。
所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
所述一定濃度的植物激素為TDZ2. O 4. Omg · Γ1和ΙΑΑ0. 2 O. 5mg · L' 所述添加劑為20% 25%椰汁。
將誘導(dǎo)40天后分化出的不定芽接種于芽伸長生長培養(yǎng)基上。所述壯苗培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +0. 5 I. Omg · L ^-BA+O. 3 I. Omg · L ^ΑΑ+δ. 5g · L 1 瓊脂 +30g · L 1 鹿糖，pH5. 5 5. 8 ;培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時(shí)間8 10h，光照強(qiáng)度1500 20001x ;培養(yǎng)20d，轉(zhuǎn)接增殖2次；所述生根 培養(yǎng)基為 1/2MS+0. I O. 5mg · L ^-BA+O. 3 I. Omg · L ^ΑΑ+δ. 5g · L 1 的瓊脂+30g噸―1蔗糖，pH5. 5 5. 8 ;培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時(shí)間8 10h，光照強(qiáng)度1500 20001x ;培養(yǎng) 20d。
全文摘要
一種薄荷節(jié)間莖段高效再生體系的方法涉及薄荷節(jié)間莖段高效再生體系的方法，以薄荷無菌苗形太學(xué)第2，3，4節(jié)間莖段為材料，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過誘導(dǎo)、伸長生長、繼代增殖、壯苗、生根等關(guān)鍵技術(shù)的研究，最終建立了這種節(jié)間莖段再生的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)不定芽再生率高達(dá)95％，并且穩(wěn)定性好，操作簡單，再生周期短，可用于作為農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102783419SQ20121030182
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者于盱, 劉艷, 李維林, 梁呈元, 王海棠 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所