專(zhuān)利名稱(chēng)：氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物制劑，具體的涉及氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物種類(lèi)繁多，包括原核微生物(如細(xì)菌)、真核微生物(如真菌、藻類(lèi)和原蟲(chóng))和無(wú)細(xì)胞生物(如病毒)三大類(lèi)，它們個(gè)體微小，卻與人類(lèi)生活、生產(chǎn)、生存息息相關(guān)，廣泛涉及健康、食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。其中，病原性微生物尤其是細(xì)菌的感染給養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)健康帶來(lái)了極大的危害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有關(guān)抗菌方面的研究和實(shí)際應(yīng)用歷來(lái)受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)意義上的抗菌試劑包括抗生素和化學(xué)消毒劑(如游離氯，氯胺，臭氧等)?？股刈詥?wèn)世以來(lái)就以其高效快速的殺菌效果在醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)得到大量應(yīng)用，在保護(hù)人類(lèi)健康方面發(fā)揮了極其重要的作用。然而由于抗生素的濫用，細(xì)菌抗藥性問(wèn)題變得日趨嚴(yán)重和突出，如研究發(fā)現(xiàn)對(duì)青霉素G耐藥的金黃色葡萄球菌高達(dá)85%以上?；瘜W(xué)消毒劑可實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)，但其毒性問(wèn)題限制了其在臨床中的應(yīng)用?；谝陨蠁?wèn)題，研究出一種新型安全高效的抗菌材料具有極其重要的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，納米科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展對(duì)各個(gè)領(lǐng)域都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，納米材料憑借其獨(dú)特的性質(zhì)在諸多領(lǐng)域如工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等顯示出極大的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)一些納米材料具有良好的抗菌活性且不易產(chǎn)生耐藥性，如金納米顆粒、銀納米顆粒、氧化鋅納米顆粒、銅及其氧化物納米顆粒等。其中，銀自古以來(lái)就被公認(rèn)為具有抗菌性能，銀納米顆粒則顯示出更加理想的抗菌活性，同時(shí)具有良好的生物安全性，因此銀納米顆粒在食品包裝、水質(zhì)凈化和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，研究發(fā)現(xiàn)以單/多壁碳納米管、活性炭、石墨烯等納 米材料作為基底和支持物來(lái)生長(zhǎng)其他納米顆粒，不僅可以解決納米顆粒的溶解性和穩(wěn)定性問(wèn)題，還可以使得兩者的機(jī)能協(xié)同作用，這樣得到的納米復(fù)合物在許多方面被大量研究應(yīng)用。目前，相對(duì)于其他納米抗菌材料，氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物(GO-Ag)由于其特殊性質(zhì)和顯著增強(qiáng)的抗菌活性被廣泛研究。氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備原理是將銀離子還原成為銀納米顆粒，從而生長(zhǎng)在氧化石墨烯基底上，具體方法包括一步還原法，苯-水兩步反應(yīng)法和銀鏡反應(yīng)法等，所涉及的還原劑包括甲醛，氫氧化鉀，PVP，對(duì)苯二酚，硼氫酸鈉等。鑒于已有制備方法大多使用的還原劑為化學(xué)有機(jī)試劑，毒性較大，危害人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境，本發(fā)明旨在提供一種氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的新型制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用，是一種高效安全的抗菌材料。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
步驟I)用改進(jìn)的Hummers方法制備氧化石墨烯水溶液:
將Ig膨脹石墨和約30倍重量的氯化鈉固體研磨至無(wú)明顯可見(jiàn)顆粒狀物，加水抽濾，洗去氯化鈉，將研細(xì)的石墨烘干備用；
在燒瓶中加入約30mL濃度為98.3%的濃硫酸，放入已烘干的研細(xì)石墨，室溫下攪拌8小時(shí)，然后將混合物置于冰浴中，加入約3g高錳酸鉀，緩慢升溫至115°C，緩慢加入約150mL水，之后加入約10mL30%過(guò)氧化氫并攪拌，離心除去上層水溶液，反復(fù)水洗至溶液不再出現(xiàn)沉淀為止；
將5mL濃度為3mg/mL的氧化石墨烯懸池液超聲30min得到澄清的氧化石墨烯水溶膠，然后按終濃度0.12 g/mL加入NaOH固體并在50°C水浴中攪拌4小時(shí)，之后加入濃鹽酸調(diào)整溶液PH值接近I，不再加氫氧根離子，用蒸餾水反復(fù)進(jìn)行沖洗和離心純化，得到水溶性良好的未堿化的氧化石墨烯水溶液；
步驟2)在所述氧化石墨烯溶液中加入硝酸銀固體粉末，煮沸；
步驟3)加入檸檬酸三鈉作為還原劑和穩(wěn)定劑，接著再100°C煮沸l(wèi)h，超濾管洗脫三次，去除未結(jié)合的銀顆粒及其他中間產(chǎn)物，即可得到氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物。進(jìn)一步的，所述氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物在抗菌方面的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明的方法反應(yīng)簡(jiǎn)單，條件溫和，制備快速；· 2、本發(fā)明中所使用的還原劑屬于綠色環(huán)保型，毒性低，無(wú)污染；
3、本發(fā)明生成的氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物穩(wěn)定性高，水溶性好，安全性強(qiáng)，并且無(wú)需后續(xù)表面功能化修飾，即產(chǎn)即用；
4、氧化石墨烯/銀顆粒復(fù)合物對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌都具有顯著的抗菌活性，對(duì)大腸桿菌的抗菌作用較強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。


圖1為銀顆粒與氧化石墨烯摩爾比值為0.65的GO-Ag納米復(fù)合物的透射電鏡圖(TEM)；
圖2為銀顆粒與氧化石墨烯摩爾比值為I的GO-Ag納米復(fù)合物的透射電鏡圖(TEM)； 圖3為銀顆粒與氧化石墨烯摩爾比值為2的GO-Ag納米復(fù)合物的透射電鏡圖(TEM)； 圖4為三種不同比值的GO-Ag對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)活性的影響；
圖5為三種不同比值的GO-Ag對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)活性的影響；
圖6為不同濃度GO-Ag下大腸桿菌菌落數(shù)的變化；
圖7為不同濃度的GO-Ag下金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的變化；
圖8為GO-Ag納米復(fù)合物在終濃度為2.5，5，10ug/ml時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。
具體實(shí)施例方式下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1
制備抗菌材料氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物(GO-Ag)。
用Ig膨脹石墨做最初始的原料，加入約30倍重量的氯化鈉固體研磨至無(wú)明顯可見(jiàn)顆粒狀物，加水抽濾，洗去氯化鈉，將研細(xì)的石墨烘干備用。在燒瓶中加入約30mL濃硫酸(98.3%)，放入已烘干的研細(xì)石墨，室溫下攪拌8小時(shí)，然后將混合物置于冰浴中，加入約3g高錳酸鉀，緩慢升溫至115°C，緩慢加入約150mL水，之后加入約10mL30%過(guò)氧化氫并攪拌，離心除去上層水溶液,反復(fù)水洗至溶液不再出現(xiàn)沉淀為止。將5mL濃度為3mg/mL的氧化石墨烯懸濁液超聲30min得到澄清的氧化石墨烯水溶膠，然后按終濃度0.12 g/mL加入NaOH固體并在50°C水浴中攪拌4小時(shí)，之后加入濃鹽酸調(diào)整溶液pH值接近I，不再加氫氧根離子，用蒸餾水反復(fù)進(jìn)行沖洗和離心純化，得到水溶性良好的未堿化的氧化石墨烯水溶液。加入硝酸銀固體粉末(分別18mg, 36mg, 54mg)至氧化石墨烯水溶液(濃度為0.5mg/ml)中，添加超純水至總體積為100ml,混勻煮沸，再加入朽1檬酸三鈉固體(分別20mg, 40mg,60mg)作為還原劑和穩(wěn)定劑，100°C煮沸l(wèi)h，然后通過(guò)IOkDa的超濾柱水洗脫三次，去除未結(jié)合的銀顆粒及其他中間產(chǎn)物，即可得到氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物。通過(guò)絡(luò)合滴定法計(jì)算出三種不同硝酸銀投料所得的復(fù)合物中銀顆粒與氧化石墨烯的摩爾比值分別為0.65，1，2。對(duì)上述氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物進(jìn)行透射電鏡分析，從圖1、圖2、圖3可知:結(jié)合在氧化石墨烯片層上的銀納米顆粒為球形，不同比值情況下結(jié)合的銀顆粒數(shù)量不同，但尺寸均介于IOnnTlOOnm左右。實(shí)施例2
研究實(shí)施例1所得氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物(GO-Ag)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)活性的影響。將實(shí)施例1所得氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物與細(xì)菌懸濁液混合培養(yǎng)，2.5h后通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)菌活性。具體方法為:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u窗中培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期(0D_為0.5左右)時(shí)取200 μ I重新接種于2ml新培養(yǎng)基，加入不同體積的GO-Ag納米復(fù)合物，使得三種不同比值的復(fù)合物終濃度分別為
2.5,5,10 μ g/ml，放入恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，取該懸濁液以每孔100 μ I加入96孔板，再加入20μ1 ΜΤΤ，將96孔板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中4h，吸除上清，再加入150μ I 二甲基亞砜充分溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀在在570nm波長(zhǎng)處測(cè)其光吸收值。參見(jiàn)圖4、圖5所示:細(xì)菌的生長(zhǎng)活性呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，材料濃度越高，細(xì)菌活性越低；比較三種不同比值的復(fù)合物，比值為I的復(fù)合物表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌性能，當(dāng)其濃度為10 μ g/ml時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性百分?jǐn)?shù)只有20%和30%左右，比值為2的復(fù)合物抗菌性能居中而比值為0.65的復(fù)合物幾乎不具備顯著抗菌性能。因此，上述比值為I的氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物可用作高效的抗菌材料。實(shí)施例3
研究實(shí)施例1所得氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物(GO-Ag)對(duì)細(xì)菌數(shù)目的影響。將實(shí)施例1所得氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物與細(xì)菌懸濁液混合培養(yǎng)，2.5h后均勻涂于固體LB瓊脂平板上，通過(guò)統(tǒng)計(jì)所得菌落數(shù)目(CFU)分析材料的抗菌活性。具體方法為:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基,在恒溫?fù)u窗中培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期(OD6tltl為0.5左右)時(shí)取200 μ I重新接種于2ml新培養(yǎng)基，加入比值為I的GO-Ag納米復(fù)合物，使其終濃度分別為2.5,5,10 μ g/ml，放入恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，梯度濃度稀釋之后均勻涂于固 體LB瓊脂平板上，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14h，然后記錄各個(gè)平板表面的菌落數(shù)目，統(tǒng)計(jì)作圖分析。
結(jié)果如圖6、圖7所示:與實(shí)驗(yàn)組相比，材料處理過(guò)的平板長(zhǎng)出的菌落數(shù)明顯減少，說(shuō)明該復(fù)合物能顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。再比較大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)當(dāng)復(fù)合物濃度為10 μ g/ml時(shí)，大腸桿菌幾乎全部死亡，平板上并未有明顯菌落形成，而金黃色葡萄球菌則有少量但明顯可見(jiàn)的菌落形成，表明該氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌。實(shí)施例4
研究實(shí)施例1所得氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物對(duì)細(xì)胞活性的影響。將實(shí)施例1所得氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物與Hela細(xì)胞混合培養(yǎng)，24h后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。具體方法為:在96孔板中每孔加入100微升的細(xì)胞培養(yǎng)液(3*104個(gè)/毫升)，培養(yǎng)12小時(shí)。再加入25微升不同濃度的三種氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物，培養(yǎng)24小時(shí)。然后根據(jù)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。參見(jiàn)圖8所示:相對(duì)于比值為0.65的復(fù)合物對(duì)細(xì)胞活性無(wú)任何影響，比值為I和2的該復(fù)合物對(duì)細(xì)胞有一定影響，當(dāng)材料濃度為10ug/ml時(shí)，仍然有60%左右的細(xì)胞保持其生長(zhǎng)活性，與其高效的抗菌效果比較，可以認(rèn)為該復(fù)合物對(duì)細(xì)胞活性基本無(wú)顯著影響，說(shuō)明上述方法制備的氧化 石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物生物安全性較高。
權(quán)利要求
1.氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I)用改進(jìn)的Hmnmers方法制備氧化石墨烯水溶液,將Ig膨脹石墨和約30倍重量的氯化鈉固體研磨至無(wú)明顯可見(jiàn)顆粒狀物，加水抽濾，洗去氯化鈉，將研細(xì)的石墨烘干備用； 在燒瓶中加入約30mL濃度為98. 3%的濃硫酸，放入已烘干的研細(xì)石墨，室溫下攪拌8小時(shí)，然后將混合物置于冰浴中，加入約3g高錳酸鉀，緩慢升溫至115°C，緩慢加入約150mL水，之后加入約10mL30%過(guò)氧化氫并攪拌，離心除去上層水溶液，反復(fù)水洗至溶液不再出現(xiàn)沉淀為止； 將5mL濃度為3mg/mL的氧化石墨烯懸池液超聲30min得到澄清的氧化石墨烯水溶膠，然后按終濃度O. 12 g/mL加入NaOH固體并在50°C水浴中攪拌4小時(shí)，之后加入濃鹽酸調(diào)整溶液PH值接近I，不再加氫氧根離子，用蒸餾水反復(fù)進(jìn)行沖洗和離心純化，得到水溶性良好的未堿化的氧化石墨烯水溶液，步驟2)在所述氧化石墨烯水溶液中加入硝酸銀固體粉末煮沸，所述硝酸銀與氧化石墨烯的投料質(zhì)量比介于7. 2^21. 6之間，步驟3)加入檸檬酸三鈉作為還原劑和穩(wěn)定劑，接著再100°C煮沸l(wèi)h，超濾管洗脫三次，去除未結(jié)合的銀顆粒及其他中間產(chǎn)物，即可得到氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的應(yīng)用，其特征在于該納米復(fù)合物可用于抗菌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種氧化石墨烯/銀顆粒納米復(fù)合物的制備方法及應(yīng)用，用改進(jìn)的Hummers方法制備氧化石墨烯水溶液，加入硝酸銀固體粉末煮沸，再加入檸檬酸三鈉作為還原劑和穩(wěn)定劑，繼續(xù)煮沸1h，超濾管洗脫三次。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單快速，所制備的納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，水溶性好，具有良好的抗菌活性，可用做高效安全的抗菌材料。
文檔編號(hào)A01N59/16GK103250739SQ20121029541
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者劉莊, 彭睿, 唐佳, 陳倩, 張帥, 許利耕 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)