專利名稱：優(yōu)質多花黃精試管苗快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域，特別是優(yōu)質多花黃精試管苗快速繁殖方法。
背景技術：
多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)系百合科黃精屬藥用植物，其根莖作中藥黃精用，含多糖、氨基酸、蒽醌類化合物等成分，具有抗菌、降壓、抗衰老及治療風濕痛等作用。在我國南方的一些地區(qū)有栽培，其主要靠根莖的無性生殖和種子進行繁殖，但由于繁殖系數(shù)低和種子繁殖周期長速度慢，無法提供大量種苗，因而大面積種植受到限制。此外， 長期無性生殖易造成種質性狀退化，影響著品種的遺傳穩(wěn)定性。利用組織培養(yǎng)方法繁殖多花黃精，可有效地提高其品性，增加繁殖系數(shù)，縮短培育周期。目前，有關多花黃精的組織培養(yǎng)和快速繁殖的報道多是基于芽體進行的，且組培體系的方法步驟為外植體的選取、預處理和消毒一誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)一增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)一增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)一生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。對于外植體的選取、消毒，徐忠傳等2006先將取回的野生黃精根莖在清水中洗掉泥土后，再用洗衣粉浸泡30min，自來水沖洗，再在無菌操作臺上用0. 15%升汞消毒lOmin， 滅菌去離子水洗滌4次，切去切口后接到誘導培養(yǎng)基上。劉紅梅等2010是將黃精根莖從土中挖出后，洗去泥土，用刀切取帶芽根莖于洗潔精水溶液中浸泡30min，之后洗凈，用75 % 乙醇擦洗，再用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗；再在無菌操作臺上采用重復2. 5%次氯酸鈉 5min，滅菌去離子水刷洗2次過程三次進行，最后用無菌濾紙吸干水分，用刀切去傷口壞死部分接種誘導培養(yǎng)基。對于之后的誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，前人研究主要集中在培養(yǎng)基成分的不同上，徐忠傳等2006采用的誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA4. 0mg/L+NAA0. ang/L，劉紅梅等2010認為2，4-D比NAA更有利于多花黃精的不定芽誘導，楊玉紅2011認為6-BA對誘導黃精愈傷組織生長效果顯著，2，4-D、NAA和KT效果不顯著。在無菌操作臺上用0. 15%升汞消毒lOmin，滅菌去離子水洗滌4次或在無菌操作臺上采用重復2. 5%次氯酸鈉5min，滅菌去離子水刷洗2次過程三次進行目前皆作為常規(guī)的消毒技術。對于增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，徐忠傳等2006是將誘導所得叢芽切成2-3株一叢(即2_3 個芽體)后，接種于系列增殖培養(yǎng)基進行增殖的，培養(yǎng)基成分上，徐紅梅等2003認為激素組合TDZ 1. 5mg/L+2，4-D1. 0mg/L對黃精根莖芽增殖最有利，徐忠傳等2006認為激素組合 6-BA4. 0mg/L+NAA0. 2mg/L不僅能使芽快速增殖，且不定芽增殖的綜合質量好，無畸形葉片產生。對于壯苗生根培養(yǎng)階段，徐忠傳等2006是將分化叢芽接種培養(yǎng)基MS+6-BA1. Omg/ L+NAA0. 2mg/L, 30d后將叢芽分開，取健壯單個根莖芽，再接種于MS+NAA0. 5mg/L生根培養(yǎng)基上。總之，現(xiàn)有研究只局限于利用芽體培養(yǎng)，對于后期種苗的生長速度較慢，無法滿足優(yōu)質黃精種苗的規(guī)模化生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的基于上述技術背景，采用了消毒前的預處理，結合研究了培養(yǎng)基中糖分濃度和生長調節(jié)劑多效唑濃度對多花黃精塊根部分和芽體部分增殖的影響，以提供多花黃精塊根增殖的培養(yǎng)基組合物配方及其應用，進一步提供優(yōu)質多花黃精試管苗快速繁殖方法。滿足優(yōu)質黃精種苗的規(guī)?；a。本發(fā)明解決其技術問題采取的技術方案包括培養(yǎng)基的配制；繁殖方法的步驟為外植體的選取、預處理和消毒一誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)一增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)一增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)一生根培養(yǎng)基培養(yǎng)；各組培階段的培養(yǎng)條件是溫度25士2°C、光照時間12h/d，誘導階段采用散射光，增殖、壯苗和生根階段光照強度2000IX ；其特征在于(一 )培養(yǎng)基的配制各種培養(yǎng)基配方為(I)誘導培養(yǎng)基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA ；(II)帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 糖 60g/L ；(III)芽體部分增殖培養(yǎng)基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4_D+ 糖 60g/L ；(IV) ±夬根部分增殖壯苗培養(yǎng)基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 多效唑 0_50mg/ L+ 糖 60g/L ；(V)塊根部分生根培養(yǎng)基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+0. 5%活性炭；以上 I-V 號培養(yǎng)基PH均介于5. 6-5. 7之間；(二)繁殖方法的步驟為①外植體的選取、預處理和消毒材料選取當年的9、10月份，于晴天選取多花黃精帶芽的塊根，將其清洗干凈后，置于1/700濃度的甲基托布津中浸泡30min取出，置于常溫條件晾干，之后用常規(guī)的消毒技術對帶芽的塊根進行消毒，最后用無菌濾紙將無菌水吸干備用；②誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)將已消毒處理過的帶芽的塊根用解剖刀剖去塊根部分表層， 只留主芽加0. 8-1. 2cm3的塊根，接入(I)號誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，40-50天后，誘導出新的幼芽，塊根部分膨大；③增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)(a)、將已誘導出新芽的塊根轉接(II)號帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)， 30-40天后，塊根部分膨大，新的芽體冒出；(b)、將已增殖的帶芽的塊根切成塊根部分和芽體部分，塊根部分轉接(II)號帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基上，30-40天后，再次膨大，新的芽體再次冒出；生長出的新的增殖帶芽的塊根，新的增殖帶芽的塊根重復循環(huán)本(b)分步驟上述過程增殖培養(yǎng)3-6代產生末代終產物帶芽體的塊根及中間產物分切下來的芽體，末代終產物帶芽體的塊根即可進入已增殖塊根部分后續(xù)的增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟；(c)、將(b)分步驟中循環(huán)步驟切分下來的中間產物芽體部分轉接(III)號芽體部分增殖培養(yǎng)基上，30-40天后，芽體部分基部塊根膨大，而后再返回(b)分步驟與(c)分步驟上述過程進行3-6代復合循環(huán)增殖，最后產生末代終產物帶芽體的塊根；④增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)將經過(b)分步驟循環(huán)及經過(b) (C)分步驟復合循環(huán)增殖培養(yǎng)產生的末代終產物帶芽體塊根的塊根部分轉接(IV)號塊根部分增殖壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，30-40天后，塊根再次膨大，新的芽體冒出；
⑤生根培養(yǎng)基培養(yǎng)將經步驟④壯苗的塊根部分接種到(V)號塊根部分生根培養(yǎng)基上，20-30天后，塊根部分基部長出根系即可進行組培苗的馴化和移栽。本發(fā)明的優(yōu)點在于1、提出的多花黃精試管苗培養(yǎng)為新的芽與塊根分切循環(huán)培養(yǎng)過程；最后得到的多花黃精塊根肥大質量俱佳，生根率達到100%，利于后續(xù)的大田栽培，有效縮短生長周期。2、方法由于帶芽的塊根進行了 1/700濃度的甲基托布津的預處理，在誘導培養(yǎng)階段采用散光培養(yǎng)，有效地降低誘導的消毒污染率，促進組培苗的分化和生長。3、提出的多花黃精試管苗MS培養(yǎng)基添加60g/L濃度的糖分和MS培養(yǎng)基添加一定濃度的多效唑能夠有效促進多花黃精的塊根增殖生長，解決了多花黃精增殖培養(yǎng)過程中營養(yǎng)分配的問題，此外，一定濃度的多效唑還能夠促進芽的形成。


附圖為本發(fā)明培養(yǎng)流程示意圖。
具體實施例方式在步驟③增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的(C)分步驟的復合循環(huán)增殖中，由(III)號芽體部分增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)出的各代帶芽體的塊根，除末代帶芽體塊根直接作為末代終產品外，其余上幾代皆進入(b) (C)分步驟循環(huán)。實施例1 本實施例1中的這種多花黃精組培快速繁殖方法，按如下步驟進行(1)培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基配方(1)誘導培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA;(II)帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+糖60g/L ； (III)芽體部分增殖培養(yǎng)基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4-D+糖 60g/L ； (IV)塊根部分增殖壯苗培養(yǎng)基 MS+1. Omg/ L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 多效唑 0_50mg/L+ 糖 60g/L ； (V) ±夬根部分生根培養(yǎng)基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L ΝΑΑ+0. 5%活性炭；以上I-V號培養(yǎng)基pH均介于5. 6-5. 7之間。(3)多花黃精帶芽的塊根誘導培養(yǎng)將以消毒處理過的帶芽的塊根用解剖刀剖去塊根部分表層，只留主芽加0.8-1. 2cm3的塊根，接入(I)號誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)， 40-50天后，誘導出新的幼芽，塊根部分膨大；(4)多花黃精已誘導出新芽的塊根的增殖培養(yǎng)(a)將已誘導出新芽的塊根轉接 (II)號增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，30-40天，塊根部分膨大，新的芽體冒出。(b)將已增殖的帶芽的塊根切成塊根部分和帶芽的芽體部分，塊根部分轉接(II)號增殖培養(yǎng)基，30-40天， 塊根部分塊塊根再次膨大，新的芽體再次冒出。新的增殖帶芽的塊根部分循環(huán)(b)過程增殖培養(yǎng)3-6代即可進行已增殖塊根部分的壯苗培養(yǎng)。(5)多花黃精已增殖分離的塊根部分的壯苗培養(yǎng)將已循環(huán)增殖3-6代的新膨大帶芽的塊根部分轉接(IV)號培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，30-40天后，塊根再次膨大，新的芽體冒
出ο(6)多花黃精塊根部分的生根培養(yǎng)將經步驟( 壯苗的塊根部分部分接種到(V) 號生根培養(yǎng)基上，20-30天后，塊根部分基部長出根系即可進行組培苗的馴化和移栽。各組培階段的培養(yǎng)條件是溫度25士2°C、光照時間12h/d，誘導階段采用散射光，增殖、壯苗和生根階段光照強度2000Ix。實施例2 本實施例2中的這種多花黃精組培快速繁殖方法，按如下步驟進行(1)培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基配方⑴誘導培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA;(II)帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+糖60g/L ； (III)芽體部分增殖培養(yǎng)基 MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4-D+糖 60g/L ； (IV)塊根部分增殖壯苗培養(yǎng)基 MS+1. Omg/ L 6-BA+O. 5mg/L NAA+ 多效唑 0_50mg/L+ 糖 60g/L ； (V) ±夬根部分生根培養(yǎng)基 MS+0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+0. 5%活性炭；以上I-V號培養(yǎng)基pH均介于5. 6-5. 7之間。(2)外植體的選取、預處理和消毒材料選取來年的9、10月份，于晴天選取多花黃精帶芽的塊根，將其清洗干凈后，置于1/700濃度的甲基托布津中浸泡30min，取出，置于常溫條件，晾干，之后用常規(guī)的技術對帶芽的塊根進行消毒，最后用無菌濾紙將無菌水吸干備用。(3)多花黃精帶芽的塊根誘導培養(yǎng)將以消毒處理過的帶芽的塊根用解剖刀剖去塊根部分表層，只留主芽加0.8-1. 2cm3的塊根，接入(I)號誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)， 40-50天后，誘導出新的幼芽，塊根部分膨大；(4)多花黃精已誘導出新芽的塊根的增殖培養(yǎng)(a)將已誘導出新芽的塊根轉接 (II)號增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，30-40天后，塊根部分膨大，新的芽體冒出。(b)將已增殖的帶芽的塊根切成塊根部分和芽體部分，塊根部分轉接(II)號增殖培養(yǎng)基上，30-40天后， 再次膨大，新的芽體再次冒出。新的增殖帶芽的塊根部分循環(huán)(b)過程增殖培養(yǎng)3-6代即可進行已增殖塊根部分的壯苗培養(yǎng)；(c)芽體部分轉接(III)號芽體增殖培養(yǎng)基上，30-40 天后，芽體部分基部塊根膨大，將膨大帶芽的塊根再次轉接(II)號增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，30-40天后，塊根部分膨大，新的芽體冒出。(d)將已增殖的帶芽的塊根切成塊根部分和帶芽的芽體部分，塊根部分轉接(II)號增殖培養(yǎng)基上，30-40天后，再次膨大，新的芽體再次冒出。(e)新的增殖帶芽的塊根部分循環(huán)(d)過程增殖培養(yǎng)3-6代即可進行已增殖塊根部分的壯苗培養(yǎng)。而新分離的芽體部分循環(huán)(c) (d) (e)過程培養(yǎng)3-6代，新的已增殖塊根部分進行后續(xù)壯苗培養(yǎng)，新的芽體部分采用常規(guī)方法進行壯苗生根。(5)多花黃精已增殖分離的塊根部分和芽體部分的壯苗培養(yǎng)將已循環(huán)增殖3-6 代的新膨大帶芽的塊根部分轉接(IV)號培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，30-40天后，塊根再次膨大， 新的芽體冒出。(6)多花黃精塊根部分的生根培養(yǎng)將經步驟( 壯苗的塊根部分部分接種到(V) 號生根培養(yǎng)基上，20-30天后，塊根部分基部長出根系即可進行組培苗的馴化和移栽。各組培階段的培養(yǎng)條件是溫度25士2C、光照時間12h/d，誘導階段采用散射光， 增殖、壯苗和生根階段光照強度2000Ix。本申請人研究發(fā)現(xiàn)用于誘導的多花黃精外植體由于長期處于地表下，其根莖外覆蓋泥土，菌類滋生，若直接進行消毒誘導，可致組培過程中污染嚴重，因此外植體消毒前處理至關重要。同時，研究還發(fā)現(xiàn)多花黃精增殖試管苗的塊根大小和質量是后期大田栽培的關鍵影響因子，因此在前人研究基礎上，實驗對多花黃精的增殖加以探討，主要研究了培養(yǎng)基中多糖濃度和生長調節(jié)劑多效唑對多花黃精增殖的影響。多糖作為組織培養(yǎng)中碳源的重要供應物，在組織培養(yǎng)中充當著提供能源和穩(wěn)定滲透壓的作用，其在培養(yǎng)基中的添加濃度尤為重要。生長調節(jié)劑多效唑是80年代研制成功的三唑類植物生長調節(jié)劑，能夠抑制內源赤霉素合成，具有延緩植物生長，抑制莖桿伸長，縮短節(jié)間、促進植物分蘗、促進花芽分化， 增加植物抗逆性能，提高產量等效果。其近幾年在多種植物組織培養(yǎng)上有系列報道應用，席夢利等2000認為在非洲菊增殖培養(yǎng)基交替添加多效唑0和0. ang/L，可使芽體增殖系數(shù)高且增殖芽健壯。陳傳紅等2006認為在生姜試管苗擴繁培養(yǎng)基中，附加1. 5mg/L多效唑可使試管苗增殖與壯苗同步進行，大大提高移栽成活率，且在MS+8. 0-10. Omg/L多效唑的培養(yǎng)基中，生姜試管苗的種質保存期可延長至4-5個月。薛寒青2007，劉華夏2009報道在切花百合組培培養(yǎng)基中添加多效唑，可以促進切花百合組培的生殖生長，促進芽增殖、不定胚發(fā)生、花芽形成和球莖形成，增強百合抗逆性、提高原生質體耐冷性等。
權利要求
1.優(yōu)質多花黃精試管苗快速繁殖方法，包括培養(yǎng)基的配制；繁殖方法的步驟為外植體的選取、預處理和消毒一誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)一增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)一增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)一生根培養(yǎng)基培養(yǎng)；各組培階段的培養(yǎng)條件是溫度25士2°C、光照時間12h/d，誘導階段采用散射光，增殖、壯苗和生根階段光照強度2000IX ；其特征在于(一)培養(yǎng)基的配制各種培養(yǎng)基配方為(I)誘導培養(yǎng)基MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA ；(II)帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+糖 60g/L ；(III)芽體部分增殖培養(yǎng)基MS+1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L 2，4_D+糖 60g/L ;(IV)塊根部分增殖壯苗培養(yǎng)基MS+1.Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+多效唑0_50mg/L+糖 60g/L ；(V)塊根部分生根培養(yǎng)基MS+0.5mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+0. 5%活性炭；以上I_V號培養(yǎng)基pH均介于5. 6-5. 7之間；(二)繁殖方法的步驟為①外植體的選取、預處理和消毒材料選取當年的9、10月份，于晴天選取多花黃精帶芽的塊根，將其清洗干凈后，置于1/700濃度的甲基托布津中浸泡30min取出，置于常溫條件晾干，之后用常規(guī)的消毒技術對帶芽的塊根進行消毒，最后用無菌濾紙將無菌水吸干備用；②誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)將已消毒處理過的帶芽的塊根用解剖刀剖去塊根部分表層，只留主芽加0.8-1. 2cm3的塊根，接入(I)號誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，40-50天后，誘導出新的幼芽，塊根部分膨大；③增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)(a)、將已誘導出新芽的塊根轉接(II)號帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，30-40 天后，塊根部分膨大，新的芽體冒出；(b)、將已增殖的帶芽的塊根切成塊根部分和芽體部分，塊根部分轉接(II)號帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基上，30-40天后，再次膨大，新的芽體再次冒出；生長出的新的增殖帶芽的塊根，新的增殖帶芽的塊根重復循環(huán)本(b)分步驟上述過程增殖培養(yǎng)3-6代產生末代終產物帶芽體的塊根及中間產物分切下來的芽體，末代終產物帶芽體的塊根即可進入已增殖塊根部分后續(xù)的增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟；(c)、將(b)分步驟中循環(huán)步驟切分下來的中間產物芽體部分轉接(III)號芽體部分增殖培養(yǎng)基上，30-40天后，芽體部分基部塊根膨大，而后再返回(b)分步驟與(c)分步驟上述過程進行3-6代復合循環(huán)增殖，最后產生末代終產物帶芽體的塊根；④增殖壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)將經過(b)分步驟循環(huán)及經過(b)(c)分步驟復合循環(huán)增殖培養(yǎng)產生的末代終產物帶芽體塊根的塊根部分轉接(IV)號塊根部分增殖壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，30-40天后，塊根再次膨大，新的芽體冒出；⑤生根培養(yǎng)基培養(yǎng)將經步驟④壯苗的塊根部分接種到(V)號塊根部分生根培養(yǎng)基上，20-30天后，塊根部分基部長出根系即可進行組培苗的馴化和移栽。
全文摘要
優(yōu)質多花黃精試管苗快速繁殖方法，涉及植物組培技術，培養(yǎng)基配方為誘導培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；帶芽塊根的增殖培養(yǎng)基MS+10mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+糖60g/L；芽體部分增殖培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L 2，4-D+糖60g/L；塊根部分增殖壯苗培養(yǎng)基MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+多效唑0-50mg/L+糖60g/L；塊根部分生根培養(yǎng)基MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5％活性炭；步驟為將已消毒處理過的帶芽的塊根剖去塊根部分表層，誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)后切成塊根和芽體，塊根轉接增殖培養(yǎng)、循環(huán)增殖培養(yǎng)3-6代，芽體轉接芽體部分增殖培養(yǎng)、進行3-6代復合循環(huán)增殖、末代終產物帶芽的塊根增殖壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)。快速繁殖規(guī)?；a。
文檔編號A01H4/00GK102550413SQ20111046108
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權日2011年12月26日
發(fā)明者葉榕妹, 周輝明, 尚偉, 林輝鋒, 王雪鳳, 賀佩珍 申請人:福建省三明市農業(yè)科學研究所