專利名稱：一種分離羊肚菌菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用菌柄內(nèi)側(cè)環(huán)割法分離羊肚菌菌種的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羊肚菌隸屬真菌界(Kingdom Fungi)子囊菌門(mén)(Ascomycota)盤(pán)菌綱(Discomycetes)盤(pán)菌目(Peziales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella),—種珍貴的野生食藥兼用大型真菌，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味奇鮮，是食用菌中的佳品，被認(rèn)為是僅次于塊菌的美味食用菌，深受人們的喜愛(ài)。
羊肚菌最早記載于《本草綱目》，中醫(yī)認(rèn)為“性平、味甘，具有益腸胃、消化助食、化痰理氣、補(bǔ)腎、壯陽(yáng)、補(bǔ)腦、提神之功能，對(duì)脾胃虛弱、消化不良、痰多氣短、頭暈失眠有良好的治療作用。羊肚菌有機(jī)鍺含量較高，具有強(qiáng)健身體、預(yù)防感冒、增強(qiáng)人體免疫力的功效。羊肚菌含有大量人體必需的礦質(zhì)元素，每百克干樣鉀、磷含量是冬蟲(chóng)夏草的7倍和4倍，鋅的含量是香菇的4. 3倍、猴頭的4倍；鐵的含量是香菇的31倍、猴頭的12倍等”。除富含蛋白質(zhì)、多糖、核酸、各種微量元素和維生素等活性物質(zhì)外，還含有豐富的脂肪酸，故其在食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品、化工、紡織等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究又表明，羊肚菌能增強(qiáng)人體免疫力、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞，并且能夠減輕癌癥患者放療、化療引起的毒副作用。由于羊肚菌藥食同源，需求量大，價(jià)位高，對(duì)其進(jìn)行研究很有必要。野生羊肚菌資源分布較廣，我國(guó)陜西、甘肅、青海、四川、云南、河北、內(nèi)蒙、吉林、黑龍江等20多個(gè)省份均有分布，但近年來(lái)羊肚菌自然采收量越來(lái)越少。十多年前，羊肚菌國(guó)外有栽培成功報(bào)道，已申請(qǐng)技術(shù)專利，國(guó)內(nèi)也有栽培成功的報(bào)道，但基本處于試驗(yàn)性階段。羊肚菌目前報(bào)道的分離菌種的方法主要有以下幾種黃保敬對(duì)采用羊肚菌茵柄基部土壌分離羊肚菌菌種的方法進(jìn)行了初探，對(duì)土壤中菌絲量大，濕度保持較好的成功率較大。董雪采用單孢分離得到了 60株黑脈羊肚菌菌株，趙丹丹等在尖頂羊肚菌孢子懸液分離到了菌種。還有ー種為陳吉岳等將子實(shí)體掰開(kāi)，用刀尖輕輕挑取內(nèi)表面約大小的菌塊接入平板培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)多次純化獲得分離菌株。王仲勇用無(wú)菌刀片把子實(shí)體切成緑豆大小的組織塊在O. 1%的升汞溶液消毒后分離到了菌種。任桂梅等則用陜北野生羊肚菌子實(shí)體進(jìn)行了的組織和孢子母種分離研究，證明組織分離成功率高于孢子分離。而他采用的組織分離方法則是用無(wú)菌眼科剪分別剪取菌盂和菌柄內(nèi)帶無(wú)菌組織(如緑豆)，但這樣的前提是柄基部沒(méi)有孔口和裂縫。孢子分離法由于變異因素的影響，單核菌絲即使雙核化，仍然對(duì)后續(xù)栽培結(jié)實(shí)不可預(yù)測(cè)。大多數(shù)科技工作者仍然以組織分離的方法獲得菌種。但是，羊肚菌與其他大型真菌的子實(shí)體在結(jié)構(gòu)上有ー些特殊地方，子實(shí)體中空，菌肉比較薄，分離時(shí)污染率較高。另外，羊肚菌對(duì)消毒液具有較強(qiáng)的吸附作用，一旦吸附了消毒剤，萌發(fā)就會(huì)困難，甚至對(duì)羊肚菌的菌絲有致死作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種不用消毒剤，既容易萌發(fā)，同時(shí)也能降低污染，并能較順利的分離到羊肚菌菌種的分離羊肚菌菌種方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 ー種分離羊肚菌菌種的方法，包括以下步驟將膠帶封閉的羊肚菌用75%消毒酒精均勻擦拭后，用燒灼的刀具從菌柄頂端在火焰上方切割掉子實(shí)體頭部，露出的新鮮菌柄橫切面，在火焰上輕快過(guò)2-4下，用刀具在新鮮菌柄內(nèi)側(cè)環(huán)割菌柄新鮮菌肉組織并送入抗生素平板培養(yǎng)基上，于20-30°C的溫度下培養(yǎng)，待萌發(fā)出菌絲后，及時(shí)轉(zhuǎn)接。所述的刀具為手術(shù)刀片。羊肚菌子實(shí)體在切割前要基部菌柄完整，用透明膠把羊肚菌整個(gè)纏繞密封，中間不留空隙。 所述的抗生素平板培養(yǎng)基為馬鈴薯400g，草炭100g，葡萄糖20g，磷酸ニ氫鉀lg，硫酸鎂O. 5g，酵母膏50g，瓊脂20g、水IOOOmL,鏈霉素30U/mL，青霉素30U/mL，pH6. 5。所述抗生素平板培養(yǎng)基的制作方法為土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min,過(guò)濾取2000mL，加入草炭，小火浸煮20min，過(guò)濾取濾液IOOOmL,在此濾液中加入葡萄糖、酵母膏、瓊脂、磷酸ニ氫鉀、硫酸鎂，小火煮至瓊脂溶解，定容至IOOOmL,分裝于三角瓶，在高溫121°C _126°C、高壓0. 1-0. 14MPa滅菌30min。待冷卻至50°C左右加入青霉素鈉、硫酸鏈霉素復(fù)合抗生素母液，使抗生素終濃度在30U/mL左右，將配好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中或直接冷卻成固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的分離方法，先是對(duì)羊肚菌進(jìn)行封閉式消毒，防止消毒酒精浸入菌組織，有利分離成功。另外，割掉子實(shí)體頭部后，露出的菌柄內(nèi)側(cè)為無(wú)菌組織，環(huán)割取內(nèi)側(cè)菌肉組織防雜效果較好。采用抗生素培養(yǎng)基也有利于防止雜菌污染，培養(yǎng)基的組分營(yíng)養(yǎng)非常全面，特別是加入草炭和酵母膏，為羊肚菌菌絲生長(zhǎng)提供了保證。本發(fā)明的整個(gè)操作過(guò)程不用消毒液，全用火焰消毒，萌發(fā)率較高，既保證了容易萌發(fā)，同時(shí)也能降低污染，井能較順利的分離到羊肚菌菌種。


圖I為本發(fā)明的羊肚菌菌柄內(nèi)側(cè)環(huán)割取組織片示意圖。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例的分離羊肚菌菌種的方法，包括以下步驟將膠帶封閉的羊肚菌用75%消毒酒精均勻擦拭后，用燒灼的手木刀片從菌柄頂端在火焰上方切割掉子實(shí)體頭部，見(jiàn)圖I中2，露出的新鮮菌柄橫切面，在火焰上輕快過(guò)兩下。用手木刀在新鮮菌柄內(nèi)側(cè)環(huán)割菌柄新鮮菌肉組織送入抗生素平板培養(yǎng)基上，見(jiàn)圖I中I所示，25°C培養(yǎng)，待萌發(fā)出菌絲后，及時(shí)轉(zhuǎn)接?？股仄桨迮囵B(yǎng)基為馬鈴薯400g，草炭100g，葡萄糖20g，磷酸ニ氫鉀lg，硫酸鎂0. 5g，酵母膏50g，瓊脂20g、水IOOOmL,鏈霉素30U/mL，青霉素30U/mL，pH6. 5，其制作方法為土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min,過(guò)濾取2000mL,加入草炭,小火浸煮20min,過(guò)濾取濾液IOOOmL,在此濾液中加入葡萄糖、酵母膏、瓊脂、磷酸ニ氫鉀、硫酸鎂，小火煮至瓊脂溶解，定容至IOOOmL,分裝于三角瓶，在高溫121°C _126°C、高壓0. 1-0. 14MPa滅菌30min。待冷卻至50°C左右加入青霉素鈉、硫酸鏈霉素復(fù)合抗生素母液，使抗生素終濃度在30U/mL左右，將配好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中或直接冷卻成固體培養(yǎng)基。 其中，羊肚菌子實(shí)體在切割前要基部菌柄完整，用透明膠把羊肚菌整個(gè)纏繞密封，中間不留空隙。
權(quán)利要求
1.一種分離羊肚菌菌種的方法，其特征在于包括以下步驟將膠帶封閉的羊肚菌用75%消毒酒精均勻擦拭后，用燒灼的刀具從菌柄頂端在火焰上方切割掉子實(shí)體頭部，露出的新鮮菌柄橫切面，在火焰上輕快過(guò)2-4下，用刀具在新鮮菌柄內(nèi)側(cè)環(huán)割菌柄新鮮菌肉組織并送入抗生素平板培養(yǎng)基上，于20-30°C的溫度下培養(yǎng)，待萌發(fā)出菌絲后，及時(shí)轉(zhuǎn)接。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離羊肚菌菌種的方法，其特征在于所述的刀具為手術(shù)刀片。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離羊肚菌菌種的方法，其特征在于羊肚菌子實(shí)體在切割前要基部菌柄完整，用透明膠把羊肚菌整個(gè)纏繞密封，中間不留空隙。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離羊肚菌菌種的方法，其特征在于所述的抗生素平板培養(yǎng)基為馬鈴薯400g，草炭100g，葡萄糖20g，磷酸ニ氫鉀lg，硫酸鎂O. 5g，酵母膏50g，瓊脂20g、水 IOOOmL,鏈霉素 30U/mL，青霉素 30U/mL，pH 5-7。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離羊肚菌菌種的方法，其特征在于所述抗生素平板培養(yǎng)基的制作方法為土豆削皮切薄皮加3000mL水煮30min,過(guò)濾取2000mL,加入草炭,小火浸煮20min，過(guò)濾取濾液IOOOmL,在此濾液中加入葡萄糖、酵母膏、瓊脂、磷酸ニ氫鉀、硫酸鎂，小火煮至瓊脂溶解，定容至IOOOmL,分裝于三角瓶，在高溫121°C_126°C、高壓O. 1-0. 14MPa滅菌30min。待冷卻至50°C左右加入青霉素鈉、硫酸鏈霉素復(fù)合抗生素母液，使抗生素終濃度在30U/mL左右，將配好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中或直接冷卻成固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離羊肚菌菌種的方法，包括以下步驟將膠帶封閉的羊肚菌用75％消毒酒精均勻擦拭后，用燒灼的刀具從菌柄頂端在火焰上方切割掉子實(shí)體頭部，露出的新鮮菌柄橫切面，在火焰上輕快過(guò)2-4下，用刀具在新鮮菌柄內(nèi)側(cè)環(huán)割菌柄新鮮菌肉組織并送入抗生素平板培養(yǎng)基上，于20-30℃的溫度下培養(yǎng)，待萌發(fā)出菌絲后及時(shí)轉(zhuǎn)接。本發(fā)明的整個(gè)操作過(guò)程不用消毒液，全用火焰消毒，萌發(fā)率較高，既保證了容易萌發(fā)，同時(shí)也能降低污染，并能較順利的分離到羊肚菌菌種。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102687639SQ201110427089
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者侯軍, 劉保國(guó), 吳祖峰, 杜愛(ài)玲, 林曉民 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)