專利名稱：一種杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種杜衡(Asarum forbesiiMaxim.)組織培養(yǎng)的繁殖方法。
背景技術(shù)：
杜衡(AsarumforbesiiMaxim.)，又稱南細辛，馬兜鈴科(Aristolochiaceae)細辛 屬(Asarum L.)多年生草本植物，塊莖的節(jié)間短，下端集生多數(shù)肉質(zhì)根。葉一二枚，生于莖 端。單花頂生。蒴果肉質(zhì)，具多數(shù)黑褐色種子。生于陰濕有腐植質(zhì)的林下或草叢中。是一種 極具園林觀賞價值的地被植物。此外，全草均可入藥，為珍貴中藥材之一。有散寒止咳、祛 風(fēng)止痛的功效。主要藥物成分是黃樟醚(safrole)和少量的丁香濁酚(eugend)。杜衡不僅 是一種很好的藥用植物，還是國家二級保護動物——中華虎鳳蝶iliwhcbrfia chinensis Leech.)喜食的植物。在南京紫金山地區(qū)，中華虎鳳蝶的寄主即為杜衡。由于杜衡具有很高 的藥用價值，近年來遭到過度采挖，數(shù)量越來越少，威脅了中華虎鳳蝶的生存。因此，如何開 發(fā)杜衡資源為中華虎鳳蝶提供食源，是亟待解決的問題。有關(guān)杜衡及其同屬植物的組織培養(yǎng)，國內(nèi)外鮮有報道。李洪林等通過嫩芽為外植 體研究了杜衡的組織培養(yǎng)，得出了芽增殖、壯苗和生根培養(yǎng)基配方(杜衡的組織培養(yǎng)，植物 生理學(xué)通訊，2004年第4期，妨4頁)。王金平等采用葉柄為外植體研究了杜衡的組織培養(yǎng) (杜衡的組織培養(yǎng)研究，信陽師范學(xué)院學(xué)報，2000年第3期，310-312頁)。周建中以莖尖為 外植體，進行了杜衡離體繁殖的研究(杜衡離體繁殖的研究，生物學(xué)雜志，2002年第4期， 16-18頁)。以往研究均得到了杜衡的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，但未從愈傷途徑得出最佳 的杜衡組織培養(yǎng)的激素組合，因此增殖率相對比較低。郭忠仁等通過研究外源激素對杜衡葉柄愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響(外源激素對 杜衡葉柄愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響，植物資源與環(huán)境學(xué)報，2010年19卷第1期，38-42 頁)，得到了適宜的杜衡葉柄愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基。該方法雖然能夠適當(dāng)?shù)靥岣哂鷤?組織的分化率和增殖系數(shù)，但對于繼代增殖、側(cè)芽誘導(dǎo)和生根過程仍有待研究。此外，未見 有報道在高增殖率繼代過程中解決無菌苗塊莖褐化的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提高杜衡組織培養(yǎng)的增殖率和增殖速度。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，包括如下步 驟
(1)外植體的選取與消毒選取當(dāng)年生葉柄作為外植體，沖洗干凈后，進行消毒；
(2)愈傷組織的誘導(dǎo)取步驟(1)中處理得到的外植體，切割為0.5-1. Ocm長的小段， 將葉柄接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織的誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度為20-26°C，首先在黑暗中培養(yǎng) 20-26小時，然后進行正常培養(yǎng)20-25天；所述正常培養(yǎng)條件為光照時間為10-16小時/天，光照強度為1600-2000IX ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6_BA、NAA和2，4-D ； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA濃度為1. Omg/L, NAA濃度為0. 3mg/L, 2，4-D濃度為1. Omg/L ；
(3)愈傷組織的繼代增殖將步驟(2)中得到的杜衡愈傷組織切割后接入繼代增殖培 養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度 為1600-2000IX ；所述繼代增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和NAA ；所述繼代增殖 培養(yǎng)基中6-BA濃度為5. Omg/L, NAA濃度為0. 2mg/L ；
(4)愈傷組織的分化取步驟(3)中繼代增殖得到的杜衡愈傷組織，切割后接入分化 培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，培養(yǎng)溫度為2046°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度為 1600-2000IX ；所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6_BA、IBA和NAA ；所述分化培養(yǎng)基 中 6-BA 濃度為 3. Omg/L, IBA 濃度為 0. lmg/L, NAA 濃度為 0. 3mg/L ；
(5)無菌苗的側(cè)芽誘導(dǎo)取步驟(4)中分化所得杜衡芽苗接入無激素MS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 15-20天后，接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)溫度為2046°C，光照時間為10-16 小時/天，光照強度為1600-2000IX ；所述側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和 IBA ；所述側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA濃度為3. Omg/L, IBA濃度為0. 2mg/L ；
(6)根的誘導(dǎo)將步驟(5)中經(jīng)側(cè)芽誘導(dǎo)后所得杜衡試管苗進行切割后，接入生根培養(yǎng) 基中進行生根培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度 為1600-2000IX ；所述切割后的試管苗每株均帶有塊莖；所述生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基 并添加激素IBA ；所述生根培養(yǎng)基中IBA濃度為3. 0mg/L ；
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、無激素MS培養(yǎng)基、側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、 生根培養(yǎng)基中均含有瓊脂6.0-7. 0g/L (優(yōu)選6.5g/L)、蔗糖25-35g/L (優(yōu)選30g/L)，且pH 值為 5. 6-5.8。對于本發(fā)明的進一步改進在于，步驟(1)中外植體的選取與消毒的具體過程為 選取當(dāng)年生葉柄作為外植體，用清水沖洗干凈，用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再 用自來水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震蕩漂洗30分鐘，接著用自來水流水沖洗30分 鐘，84消毒液(稀釋50倍)搖床上振蕩消毒10分鐘。流水沖洗20-30分鐘后，于無菌操作臺 上用75%乙醇消毒50-60秒，立即倒入0. 1%的升汞消毒12分鐘，最后用無菌水洗滌4次， 每次振蕩3-5分鐘；
步驟(2)中最佳的正常培養(yǎng)時間為20天；步驟(3)中最佳繼代增殖培養(yǎng)時間為25天； 步驟(4)中最佳分化培養(yǎng)時間為15天；步驟(5)中的側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有活性炭，所 側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中活性炭濃度為1000mg/L，最佳側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為25天；步驟(6)中的 生根培養(yǎng)基中還含有活性炭，所述生根培養(yǎng)基中活性炭濃度為1000mg/L，最佳生根培養(yǎng)時 間為10天。本發(fā)明杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法具有以下優(yōu)點
1、繼代增殖培養(yǎng)基相對愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基增加了6-BA的濃度，促進細胞分裂、誘 導(dǎo)塊莖形成，進而增大愈傷組織中細胞團的數(shù)量；同時去除了 2，4-D，避免其干擾植物體內(nèi) 的激素平衡，破壞核酸與蛋白質(zhì)代謝，從而導(dǎo)致無菌苗莖葉扭曲、變形變異；適當(dāng)降低NAA 濃度，以促進愈傷組織生長；
2、在對愈傷組織分化得到的杜衡芽苗進行側(cè)芽誘導(dǎo)時，首先經(jīng)過無激素培養(yǎng)基的過 渡培養(yǎng)，消除外源激素對植物體內(nèi)的影響，使內(nèi)部激素達到平穩(wěn)水平，有利于芽苗的健壯生長；經(jīng)過無激素培養(yǎng)后，杜衡無根苗體內(nèi)激素達到了相對低的水平，此時適當(dāng)增加生長素的 劑量，能夠有效地促進腋芽的生長；同時添加適量的活性炭，吸附植株分泌出的有毒次生代 謝物，使植株生長活力保持旺盛，起到遏制褐化的作用；
3、生根誘導(dǎo)時，添加IBA促進生根，同時添加適量的活性炭，有效地遏制褐化；
4、采用本發(fā)明的組織培養(yǎng)繁殖方法，最終增殖率為50-72倍；其中采用繼代增殖培養(yǎng) 基，增殖倍數(shù)為4倍；采用側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，側(cè)芽誘導(dǎo)率為80%，平均誘導(dǎo)側(cè)芽數(shù)為3. 4 ；采 用生根培養(yǎng)基，生根率為80%-90%，平均生根數(shù)為2. 3。
具體實施例方式培養(yǎng)基篩選實施例
1、愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)基的篩選
選取經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的愈傷組織切割成面積約為0. 5cm2的小塊，接入5種繼代增殖培養(yǎng) 基中進行繼代培養(yǎng)25天，培養(yǎng)溫度^TC,光照時間16小時/天，光照強度為2000Ix。試驗發(fā)現(xiàn)相對于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素添加量(6-BA 1. Omg/L+NAA 0. 3mg/L+2, 4-D 1. Omg/L),當(dāng)繼代培養(yǎng)基中去除2，4-D,維持NAA的濃度，同時6-BA濃度不增加或增加不 大時(濃度為1. 0-3. Omg/L),愈傷組織生長速度緩慢，基部開始褐化；當(dāng)6-BA濃度增加至 5. Omg/L時，愈傷組織生長加快，基部未見褐化出現(xiàn)，但缺點是在NAA濃度沒有降低的條件 下，愈傷組織比較疏松；當(dāng)6-BA濃度增加至5. Omg/L,同時NAA濃度降低至0. 2mg/L時，愈 傷組織明顯致密，呈現(xiàn)暗綠色。(參見表1)
因此繼代增殖培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，同時含有激素6-BA的濃度為5. Omg/L、NAA的濃 度為0. 2mg/L,繼代增殖倍數(shù)能達到4倍。 表1繼代增殖培養(yǎng)基的篩選
權(quán)利要求
1.一種杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體的選取與消毒選取當(dāng)年生葉柄作為外植體，沖洗干凈后，進行消毒；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)取步驟(1)中處理得到的外植體，切割為0.5-1. Ocm長的小段， 將葉柄接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行愈傷組織的誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度為20-26°C，首先在黑暗中培養(yǎng) 20-26小時，然后進行正常培養(yǎng)20-25天；所述正常培養(yǎng)條件為光照時間為10-16小時/ 天，光照強度為1600-2000IX ；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6_BA、NAA和2，4-D ； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA濃度為1. Omg/L, NAA濃度為0. 3mg/L, 2，4-D濃度為1. Omg/L ；(3)愈傷組織的繼代增殖將步驟(2)中得到的杜衡愈傷組織切割后接入繼代增殖培 養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度 為1600-2000IX ；所述繼代增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和NAA ；所述繼代增殖 培養(yǎng)基中6-BA濃度為5. Omg/L, NAA濃度為0. 2mg/L ；(4)愈傷組織的分化取步驟(3)中繼代增殖得到的杜衡愈傷組織，切割后接入分化 培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-20天，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度為 1600-2000IX ；所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6_BA、IBA和NAA ；所述分化培養(yǎng)基 中 6-BA 濃度為 3. Omg/L, IBA 濃度為 0. lmg/L, NAA 濃度為 0. 3mg/L ；(5)無菌苗的側(cè)芽誘導(dǎo)取步驟(4)中分化所得杜衡芽苗接入無激素MS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 15-20天后，接入側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)溫度為20_26°C，光照時間為10-16 小時/天，光照強度為1600-2000IX ；所述側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基并添加激素6-BA和 IBA ；所述側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA濃度為3. Omg/L, IBA濃度為0. 2mg/L ；(6)根的誘導(dǎo)將步驟(5)中經(jīng)側(cè)芽誘導(dǎo)后所得杜衡試管苗進行切割后，接入生根培養(yǎng) 基中進行生根培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度 為1600-2000IX ；所述切割后的試管苗每株均帶有塊莖；所述生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基 并添加激素IBA ；所述生根培養(yǎng)基中IBA濃度為3. 0mg/L ；上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、無激素MS培養(yǎng)基、側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、 生根培養(yǎng)基中均含有瓊脂6. 0-7. 0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值為5. 6-5. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述步驟(5)中的側(cè)芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還含有活性炭，所述側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中活性炭濃度為1000mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述步驟(6)中的生根 培養(yǎng)基中還含有活性炭，所述生根培養(yǎng)基中活性炭濃度為1000mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述步驟(2)中的正常 培養(yǎng)時間為20天；所述步驟(3)中的繼代增殖培養(yǎng)時間為25天；所述步驟(4)中的分化培 養(yǎng)時間為15天；所述步驟(5)中的側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為25天；所述步驟(6)中的生根培養(yǎng) 時間為10天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述杜衡組織培的養(yǎng)繁殖方法，其特征在于所述步驟(1) 中進行消毒過程為將清洗干凈的外植體置于稀釋50倍的84消毒液中振蕩消毒10分鐘， 流水沖洗20-30分鐘后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50-60秒，立即置于0. 1%的升汞 中消毒12分鐘，最后用無菌水洗滌4次，每次振蕩3-5分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培 養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、無激素MS培養(yǎng)基、側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中均含有 瓊脂6. 5g/L、蔗糖30g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種杜衡組織培養(yǎng)的繁殖方法，該方法包括以下步驟(1)選取外植體并進行消毒；(2)將處理后的外植體切割后，進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)；(3)將步驟(2)中所得愈傷組織進行繼代增殖培養(yǎng)；(4)對繼代增殖培養(yǎng)后的愈傷組織進行分化誘導(dǎo)；(5)將經(jīng)分化處理后的愈傷組織進行側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；(6)對步驟(5)中得到的無根苗進行生根誘導(dǎo)。采用該繁殖方法對杜衡進行組織培養(yǎng)，增殖率為50-72倍，且繁殖速度快。
文檔編號A01H4/00GK102090336SQ20101058464
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者宣繼萍, 李乃偉, 湯詩杰, 賈曉東, 郭忠仁, 陸小清 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所