專利名稱：：玉米個(gè)體pv-imgt32(nk603)和用于對(duì)其檢測(cè)的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用于使植物具有對(duì)草甘膦的耐藥性的一種DNA構(gòu)建體。本發(fā)明更特別地涉及一種對(duì)草甘膦具有耐藥性的玉米植林PV-ZMGT32(nk603)和檢測(cè)在樣品及其組成中玉米植抹PV-ZMGT32(nk603)DNA的存在與否的分析方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及對(duì)草甘膦除草劑具有耐藥性的玉米(Zeamays)植林PV-ZMGT32(nk603)和玉米植林PV-ZMGT32(nk603)的DNA植物表達(dá)構(gòu)建體，以及在玉米PV-ZMGT32(nk603)及其后代中轉(zhuǎn)基因/基因組插入片段的檢測(cè)。玉米是一種重要的作物，在世界很多地方它是主要的食物來源。生物工藝學(xué)的方法已經(jīng)被應(yīng)用于玉米以改善其農(nóng)藝學(xué)特性和產(chǎn)品質(zhì)量。上述的農(nóng)藝學(xué)特性之一是對(duì)除草劑的耐藥性，特別是對(duì)草甘膦除草劑的耐藥性。玉米的這種特性可以通過轉(zhuǎn)基因在玉米植株中的表達(dá)而得到(美國(guó)專利號(hào)6，040，497)。人們已知外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)受到它們的染色體位置的影響，這種影響可能是由于染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)(即異染色質(zhì))或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如，增強(qiáng)子)緊靠整合位點(diǎn)的接近(Weising等，Ann.Rev,Genet22:421-477，1988)造成的。由于這個(gè)原因，通常需要篩選大量的個(gè)體(event)才能鑒定出具有所關(guān)注引入的基因最理想表達(dá)特征的個(gè)體。例如，人們觀察到在植物或其他生物體內(nèi)，外源基因在不同的個(gè)體之間表達(dá)水平有很大的差異。另外在外源基因表達(dá)的時(shí)間和空間模式上也會(huì)有差異，例如，外源基因在不同植物組織之間相對(duì)表達(dá)上的差異性，這種差異性表現(xiàn)在實(shí)際表達(dá)模式可能與根據(jù)外源基因構(gòu)建中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件所預(yù)期的表達(dá)模式不一致。因此，通常情況下需要產(chǎn)生成百上千個(gè)不同的基因重組個(gè)體，然后從這些個(gè)體中篩選出單個(gè)具有商業(yè)應(yīng)用前景的預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的個(gè)體。具有預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平或模式的遺傳背景的個(gè)體中。通過這種雜交作用產(chǎn)生的后代保持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特性。這種策略用于保證在很好適應(yīng)本地生長(zhǎng)條件的各種品種中基因的可靠表達(dá)。如果能夠檢測(cè)一個(gè)特定個(gè)體基因的存在以確定有性雜交的后代是否含有所關(guān)注的轉(zhuǎn)基因，將是有利的。另外，檢測(cè)特定個(gè)體基因存在與否的方法也將有助于遵守相關(guān)的條例，例如要求來源于重組作物植物的食物在投入市場(chǎng)前需要獲得正式批準(zhǔn)和進(jìn)行標(biāo)記。通過目前熟知的任何一種核酸檢測(cè)方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或利用核酸探針進(jìn)行DNA雜交來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在都是可能的。這些檢測(cè)方法的對(duì)象普遍都集中在常用的基因元件，如啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記物基因等。因此，如果與插入DNA相鄰的染色體DNA("側(cè)翼DNA")的序列未知，上述這些方法就不能夠用來區(qū)別不同個(gè)體間的差異，特別是那些用相同的DNA構(gòu)建體得到的個(gè)體。人們?cè)?jīng)討論過一類個(gè)體特異性的PCR分析方法，例如，Windels等(Med.Fac.Landbou麗.Univ.Gent64\5b:459-462,1999)通過使用一個(gè)引物組的PCR分析方法鑒定草甘膦耐藥性的大豆個(gè)體40-3-2，他們所用的引物組跨越了插入DNA和側(cè)翼DNA的接合部位，具體地說，是包括了插入DNA的序列的一個(gè)引物，和包括了側(cè)翼DNA的序列的第二引物。本發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一個(gè)DNA構(gòu)建體，當(dāng)其在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，該植物獲得對(duì)草甘膦除草劑的耐藥性。本發(fā)明優(yōu)選涉及生產(chǎn)和選擇具有草甘膦耐藥性的單子葉谷類植物的方法。該DNA構(gòu)建體由兩個(gè)轉(zhuǎn)源基因表達(dá)組件構(gòu)成。第一個(gè)基因表達(dá)組件包含一個(gè)由水稻(Oryzaesativa)肌動(dòng)蛋白l啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白1內(nèi)含子組成的DNA分子，所述內(nèi)含子和編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA分子操作連接起來，該DNA分子和編碼草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子操作連接起來，和包含有3，轉(zhuǎn)錄終止子的DNA分子操作連接起來。第二個(gè)DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)組件包含一個(gè)花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子的DNA分子，該分子和包含Hsp70內(nèi)含子的DNA分子操作連接起來，和編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA分子操作連接起來，再和編碼草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子操作連接起來，和包含有3，轉(zhuǎn)錄終止子的DNA分子操作連接起來。更為具體地，所提供的DNA構(gòu)建體在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該植物獲得對(duì)草甘膦除草劑的耐藥性。本發(fā)明優(yōu)選涉及生產(chǎn)和選擇具有草甘膦耐藥性的單子葉谷類植物。該DNA構(gòu)建體由兩個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)組件構(gòu)成。第一個(gè)表達(dá)組件由一個(gè)由水稻(Oryzaesativa)肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白1內(nèi)含子操作連接到編碼ArabidopsisEPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA分子上，搡作連接到從根癌土壤桿菌(Agrobaeteriumtumefacienssp.)CP4抹中分離得到的編碼草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子上，操作連接到由胭脂堿合酶轉(zhuǎn)錄終止子組成的DNA分子上而組成。第二個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)組件由含有增強(qiáng)子區(qū)域串聯(lián)重復(fù)的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子的DNA分子操作連接到由ZeamaysHsp70內(nèi)含子組成的DNA分子上，操作連接到編碼ArabidopsisEPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的DNA分子上，操作連接到從根癌土壤桿菌(Agrobaeteriumtumefacienssp.)CP4抹中分離得到的編碼草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子上，操作連接到由胭脂堿合酶轉(zhuǎn)錄終止子組成的DNA分子上而組成。根椐本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)存在轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域的組合物和方法，該插入?yún)^(qū)域來源于一種新的被稱為PV-ZMGT32(nk603)的玉米植抹。所提供的DNA分子包括至少一個(gè)PV-ZMGT32(nk603)的連接序列，該序列選自5，TGTAGCGGCCCACGCGTGGT3，(SEQIDNO:9)，5'TACCACGCGACACACTTC3，(SEQODNO:IO)，和5'TGCTGTTCTGCTGACTTT3，(SEQIDNO:ll)以及它們的互補(bǔ)序列；其中連接序列跨越了插入基因組的異源DNA和來自于玉米細(xì)胞的側(cè)翼插入位點(diǎn)的DNA之間的結(jié)合部位，該連接序列用于鑒定這一個(gè)體的發(fā)生。含有這些分子的玉米植株和種子是本發(fā)明的一個(gè)方面。一個(gè)新的DNA分子5'ACCAAGCTTTTATAATAG3，(SEQIDNO:12)及其互補(bǔ)序列，其中該DNA分子在PV-ZMGT32(nk603)及其后代中是新的。包含該分子的玉米植抹和種子是本發(fā)明的一個(gè)方面。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，包含有新的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)域，SEQ補(bǔ)的DNA分子是本發(fā)明的一個(gè)方面。含有足夠長(zhǎng)度的SEQIDN0:7DNA序列的轉(zhuǎn)基因部分和類似的足夠長(zhǎng)度的SEQIDNO:7的5，側(cè)翼玉米DNA序列的DNA分子，或者含有類似足夠長(zhǎng)度的SEQIDNO:8DNA序列的轉(zhuǎn)基因部分和類似的足夠長(zhǎng)度的SEQIDNO:8轉(zhuǎn)基因3'側(cè)翼DNA序列的DNA分子，其中這些DNA分子用作DNA擴(kuò)增方法中的DNA引物，以提供特異性來自于PV-ZMGT32(nk603)及其后代的DNA擴(kuò)增子產(chǎn)物，是本發(fā)明的另一個(gè)方面。與一定長(zhǎng)度的SEQIDNO:7和SEQIDNO:8同源或互補(bǔ)的DNA引物是本發(fā)明的一個(gè)方面。用DNA引物所產(chǎn)生的用于鑒定玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)及其后代的擴(kuò)增子是本發(fā)明的一個(gè)主題。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測(cè)樣品中與玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)對(duì)應(yīng)的DNA存在的方法。這樣的方法包括(a)將含有DNA的樣品與DNA引物組接觸，該引物組用于和提取自玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)的基因組DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生可用于鑒定玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；和(c)檢測(cè)該擴(kuò)增子。一對(duì)含有與SEQIDNO:7和SEQIDNO:8同源或互補(bǔ)的DNA引物組的DNA分子，該引物組的作用是在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生可用于鑒定PV-ZMGT32(nk603)的擴(kuò)增子DNA分子。更為具體的，一對(duì)含有DNA引物組的DNA分子，其中的DNA分子被鑒定為SEQIDNO:13或其互補(bǔ)序列和SEQIDNO:M或其互補(bǔ)序列；SEQIDNO:15或其互補(bǔ)序列和SEQIDNO:16或其互補(bǔ)序列。包含有SEQIDNO:13和SEQIDNO:14DNA分子的擴(kuò)增子。包含有SEQIDNO:15和SEQIDNO:16DNA分子的擴(kuò)增子。通過上述方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以在嚴(yán)格條件下和SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、或SEQIDNO:12進(jìn)行雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，檢測(cè)樣品中與PV-ZMGT32(nk603)個(gè)體對(duì)應(yīng)的DNA分子存在的方法，這樣的方法包括(a)將含有從玉米植抹中提取的DNA的樣品與DNA探針分子相接觸，該探針分子可以在嚴(yán)格條件下和來自于玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)的基因組DNA發(fā)生雜交，而不和對(duì)照組玉米植抹DNA在嚴(yán)格條件下發(fā)生雜交；(b)將樣品和探針置于嚴(yán)格雜交條件下；和(c)檢測(cè)探針和DNA的雜交情況。更為具體的，一種檢測(cè)樣品中與PV-ZMGT32(nk603)個(gè)體對(duì)應(yīng)的DNA分子存在的方法，該方法，由如下步驟組成(a)將含有從玉米植株中提取的DNA的樣品與DNA探針分子相接觸，該探針分子由SEQIDNO:9，SEQIDNO:IO,SEQIDNO:ll或SEQIDNO:12組成，其中該DNA探針分子在嚴(yán)格條件下和來自于玉米植抹PV-ZMGT32(nk603)的基因組DNA進(jìn)行雜交，而不和對(duì)照組玉米植林DNA在嚴(yán)格條件下發(fā)生雜交；(b)將樣品和探針置于嚴(yán)格雜交條件下；和(c)檢測(cè)探針和DNA的雜交情況。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)對(duì)草甘膦具有耐藥性的玉米植抹的方法，該方法包括如下步驟(a)將第一親本玉米系與第二親本玉米系進(jìn)行有性雜交，第一親本玉米系含有本發(fā)明的表達(dá)組件，該表達(dá)組件產(chǎn)生對(duì)施用草甘膦的耐藥性，第二親本玉米系缺乏草甘膦耐藥性，從而產(chǎn)生大量的子代植林；和(b)挑選能夠耐受施用草甘膦的子代植抹。這樣的方法可以任選地包括進(jìn)一步將子代植株和第二親本玉米進(jìn)行回交的步驟，以產(chǎn)生純育的具有草甘磷抗性的玉米植林。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種方法以挑選本發(fā)明中對(duì)草甘磷具有耐藥性的玉米植林和其后代，該方法包括，從植株樣品中提取DNA,將DNA和選自SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、或SEQIDNO:12或其互補(bǔ)序列的標(biāo)記物核酸分子相接觸，檢測(cè)該標(biāo)記物核酸分子和DNA的雜交情況，進(jìn)行標(biāo)記物輔助育種分析以確定草甘膦耐藥性特征和標(biāo)記物核酸分子的遺傳學(xué)連鎖。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)對(duì)草甘膦除草劑具有耐藥性的玉米植抹的方法，該方法包括用DNA構(gòu)建體(pMON25496)轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞，選擇對(duì)有效劑量草甘磷處理有耐藥性的玉米細(xì)胞，培育該玉米細(xì)胞長(zhǎng)成可育的玉米植林。這種可育的玉米植林可以自花授粉或與可配伍的玉米品種進(jìn)行雜交以產(chǎn)生對(duì)草甘磷具有耐藥性的子代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種DNA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒至少包括一種DNA分子，該DNA分子具有足夠長(zhǎng)度的與SEQIDNO:7或SEQIDNO:8同源或互補(bǔ)的連續(xù)的核苦酸，其作用是作為對(duì)玉米植抹PV-ZMGT32(nk603)或其后代特異性的DNA引物或探針。本發(fā)明進(jìn)一步涉及ATCC登記號(hào)為No.PTA-2478的具有草甘膦耐藥性的玉米(Zeamays)PV-ZMGT32(nk603)植抹和種子以及其產(chǎn)生的后代。通過種植對(duì)草甘膦具有耐藥性的玉米植株P(guān)V-ZMGT32(nk603)而得到的玉米植株或其組成部分，玉米植抹PV-ZMGT32(nk603)的花粉和胚珠。玉米植抹PV-ZMGT32(nk603)及其后代的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核，花粉細(xì)胞的細(xì)胞核，卵細(xì)胞的細(xì)胞核。本發(fā)明的來源于玉米植抹和種子PV-ZMGT32(nk603)的DNA引物分子提供了一種特異性的擴(kuò)增子產(chǎn)物是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明前述和其他的方面在下面的詳細(xì)描述和附圖中會(huì)更為明確。附圖簡(jiǎn)述附圖1.質(zhì)粒pMON25496的結(jié)構(gòu)圖優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本申請(qǐng)對(duì)在06/22/00日提交的、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/213,567的申請(qǐng)，10/13/00日提交的、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/241,215的申請(qǐng)，以及在10/13/00日提交的，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/240,014的申請(qǐng)?zhí)岢隼嬉?。如下所提供的定義和方法是為了更好地定義本發(fā)明以及指導(dǎo)那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。除非另外指出，所用的術(shù)語應(yīng)該根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法進(jìn)行理解。分子生物學(xué)的一般性術(shù)語的定義可以在Rieger等著的《GlossaryofGenetics:ClassicalandMolecular》(第5版，Springer-Verlag:紐約，1991)一書中和Lewin所著的《GenesV》(牛津大學(xué)出版社紐約1994.)一書中找到。所用的DNA堿基命名法是在37CFR§1.822中提出的。于此所用的術(shù)語"玉米"指的是"Zeamays"或玉蜀黍，它包括可以和玉米進(jìn)行育種的所有植物品種，包括野生玉蜀黍品種。于此所用的術(shù)語"包括"指的是"包含但不局限于"。草甘膦指的是N-膦酰基曱基氨基乙酸及其鹽類，草甘膦是Roundup除草劑(孟山都公司)的活性成分。用"草甘膦除草劑"進(jìn)行處理指的是用Roundup,RoundupUltra,RoundupUltraMax(g)除草劑或其他任何一種含有草甘膦的除草劑制劑進(jìn)行處理。為了達(dá)到有效生物學(xué)劑量而對(duì)某種草甘膦制劑使用率的選擇不超出普通農(nóng)藝技術(shù)人員的技能。DNA構(gòu)建體是DNA分子互相連接起來的組裝，該組裝提供了一個(gè)或多個(gè)表達(dá)組件。DNA構(gòu)建體優(yōu)選地是能夠在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，而且含有不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的質(zhì)粒，所含的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用于導(dǎo)入提供功能性基因元件，即啟動(dòng)子、內(nèi)含子、前導(dǎo)序列、編碼序列、3'終止子區(qū)域和其他序列的DNA分子。DNA構(gòu)建體中所含有的表達(dá)組件包括提供信使RNA的轉(zhuǎn)錄所必需的基因元件。該表達(dá)組件可以設(shè)計(jì)為在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)組件被設(shè)計(jì)為最優(yōu)選地在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)表達(dá)組件的組合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非預(yù)期的表型。在本發(fā)明中，在DNA構(gòu)建體(pMON25496)中所提供的水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子組件和CaMV35S啟動(dòng)子組件的組合與單一組件相比，以及與含有3個(gè)水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子組件拷貝的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA21相比，加強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因玉米植林對(duì)草甘膦除草劑的耐藥性。轉(zhuǎn)基因"個(gè)體"是通過用異源基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而得到的，包括一個(gè)含有目的轉(zhuǎn)基因的核酸表達(dá)組件，由轉(zhuǎn)基因插入植物基因組而得到的植物群體的再生，挑選具有插入特定基因組位點(diǎn)特征的特定植抹。術(shù)語"個(gè)體"指的是原始轉(zhuǎn)化體和包含有異源DNA的轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語"個(gè)體"也指轉(zhuǎn)化體和含有異源DNA的其他品種個(gè)體之間進(jìn)行有性雜交而得到的后代。即使經(jīng)過與循環(huán)的親本進(jìn)行反復(fù)回交，來自于轉(zhuǎn)化體親本的插入的DNA和側(cè)翼DNA在雜交的子代中，繼續(xù)存在染色體上的相同位點(diǎn)。術(shù)語"個(gè)體"也指來自于原始轉(zhuǎn)化體的DNA，該原始轉(zhuǎn)化體含有插入DNA和與插入DNA緊密相鄰的側(cè)翼基因組序列，該插入DNA被預(yù)期轉(zhuǎn)移到子代中，作為含有插入DNA(例如，原始轉(zhuǎn)化體和其自交產(chǎn)生的后代)的親本系和不含插入DNA的親本系有性雜交的結(jié)果，子代接受了包含有目的轉(zhuǎn)基因的插入DNA。培育一種具有草甘膦耐藥性的玉米植株P(guān)V-ZMGT32(nk603),通過以下步驟首先進(jìn)行第一親本系與第二親本系的有性雜交，第一親本玉米植林由培育自轉(zhuǎn)基因玉米植林PV-ZMGT32(nk603)(ATCC登記號(hào)No.PTA-2478)及其后代的玉米植抹組成，該轉(zhuǎn)基因玉米植林及其后代是通過利用本發(fā)明的對(duì)施用草甘膦除草劑具有耐藥性的表達(dá)組件轉(zhuǎn)染而得到的，第二親本玉米植林缺乏對(duì)草甘膦除草劑的耐藥性，從而產(chǎn)生了多樣的第一代子代植抹；然后挑選對(duì)施用草甘膦除草劑具有耐藥性的第一代子代植林，進(jìn)行自交，從而產(chǎn)生大量第二代子代植林；接著從第二代子代植林中挑選對(duì)草甘膦除草劑具有耐藥性的植抹。這些步驟可以進(jìn)一步包括將第一代草甘膦耐藥性子代植林或第二代草甘膦耐藥性子代植林與第二親本玉米植林或第三親本玉米植抹進(jìn)行回交，從而產(chǎn)生對(duì)施用草甘膦除草劑具有耐藥性的玉米植林。同樣應(yīng)該理解的是，兩抹不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以配對(duì)產(chǎn)生具有兩個(gè)獨(dú)立的、分離性添加的外源基因的后代。適當(dāng)后代的自交可以得到對(duì)兩個(gè)添加的外源基因來說都是純合子的后代植抹。與親本植林的回交以及與非轉(zhuǎn)基因植物的遠(yuǎn)交，如營(yíng)養(yǎng)體繁殖也是可以預(yù)期的。對(duì)其它普遍才戈到，例:i口，F(xiàn)ehr的《BreedingMethodsforCultivarDevelopment》(WilcoxJ.編著，AmericanSocietyofAgronomy,MadisonWI(1987))。"探針"是一段分離的核酸分子，其上結(jié)合有常規(guī)的可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道性分子，例如，放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶類。這樣的探針與目標(biāo)核酸的一條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，在本發(fā)明中，探針的互補(bǔ)對(duì)象是來自玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)基因組DNA的一條鏈，該基因組DNA來源于玉米植林或含有該個(gè)體DNA的樣品。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括聚酰胺和其他用于特異性結(jié)合到目標(biāo)DNA序列的探針材料，這些材料還可以用于檢測(cè)目標(biāo)DNA序列的存在。"引物"是一段分離的核酸分子，它可以經(jīng)過通過核酸雜交，退火結(jié)合到互補(bǔ)目標(biāo)DNA鏈上，在引物和目標(biāo)DNA鏈之間形成雜合體；然后在聚合酶，例如DNA聚合酶，的作用下沿著目標(biāo)DNA鏈延伸。本發(fā)明的引物對(duì)涉及其在目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增中的應(yīng)用，例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。探針和引物要有足夠的核苷酸長(zhǎng)度從而在操作人員設(shè)定的雜交或反應(yīng)條件下特異性地結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上。這段長(zhǎng)度可以是滿足所選檢測(cè)方法需要的任意足夠的長(zhǎng)度。一般的，使用長(zhǎng)度為U個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)，優(yōu)選使用長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)，更優(yōu)選的使用長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)，最優(yōu)選使用長(zhǎng)度為30個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。這樣的探針和引物在高度嚴(yán)格的雜交條件下特異性地和目標(biāo)序列雜交。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的探針和引物和與目標(biāo)序列連續(xù)核苷酸具有全DNA序列相似性，盡管探針與目標(biāo)DNA序列不同而且那些保持了與目標(biāo)DNA序列雜交能力的探針可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)得到。制備和使用探針和引物的方法在文獻(xiàn)中進(jìn)行過描迷，例如，在《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(《MolecularCloning:ALaboratoryManual》)第2版，vo1.l-3，Sambrook等編著，冷泉巷實(shí)驗(yàn)出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),冷泉港，NY,1989(下文中略作"Sambrook等，1989");《當(dāng)代分子生物學(xué)方法》(《CurrentProtocolsinMolecularBiology》)，Ausubel等編著，GreenePublishingandWileylnterscience,紐約，1992(周期性更新)(下文略作"Ausubel等，1992");以及Innis等的《PCR方案方法和應(yīng)用指南》(《PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications》)，科學(xué)出版社SanDiego,1990。PCR引物對(duì)可以從已知序列中得到，例如使用專門為此目的設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序，象Primer(Version0.5，1991,whiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)。這里所公開的基于側(cè)翼DNA和插入序列的引物和探針能夠通過常規(guī)方法，例如再克隆和測(cè)序，確定(如果需要，也可以改正)所公開的序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下和目標(biāo)DNA序列發(fā)生雜交。任何一種常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定樣品中來源于轉(zhuǎn)基因個(gè)體的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定的條件下能夠和其他核酸分子發(fā)生特異性雜交。如這里所用的，如果兩個(gè)核酸分子能夠形成一個(gè)反平行、雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個(gè)核酸分子彼此之間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性則稱一個(gè)核酸分子與另一個(gè)核酸分子互補(bǔ)。如這里所用的，如果一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苦酸都和另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)，則稱這兩個(gè)核酸分子具有"完全互補(bǔ)性"。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交從而使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的"低度嚴(yán)格"條件下發(fā)生退火并結(jié)合在一起，則稱這兩個(gè)分子具有"最低程度的互補(bǔ)性"。類似的，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交從而使它們?cè)诔Ｒ?guī)的"高度嚴(yán)格"條件下發(fā)生退火并結(jié)合在一起，則稱這兩個(gè)分子具有"互補(bǔ)性"。常規(guī)的嚴(yán)格條件在Sambrook等，1989和Haymes等的《核酸雜實(shí)踐方法》(《NucleicAcidHybridizaton，APraticalApproach》)(IRLPress,Washington,DC(1985))中有所描述。與完全互補(bǔ)性的偏差是允許的，只要這樣的偏差不會(huì)完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，只需要保證其在序列上有足夠的互補(bǔ)性，能夠在使用的特定的溶劑和鹽濃度條件下形成一個(gè)穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如這里所用的，基本同源的序列是指一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格的條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性的雜交。啟動(dòng)DNA雜交的適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件，例如，大約45'C條件下6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后用2.0xSSC在50。C條件下沖洗，為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，這些條件也可以在《當(dāng)代分子生物學(xué)方法》《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。例如，在沖洗步驟中的鹽濃度可以從低嚴(yán)格條件的約2.0xSSC、50'C到高嚴(yán)格條件的約0.2xSSC、50'C中選擇。另外，清洗步驟中的溫度條件可以從低嚴(yán)格條件下的室溫，約22。C，升高到高嚴(yán)格條件下的約65。C。溫度條件和鹽濃度都可以發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持恒定而另一個(gè)變量發(fā)生改變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一個(gè)核酸分子可以在適度嚴(yán)格條件下，例如大約65'C、和大約2.0xSSC，和前面提出的SEQIDNO:9、10、11和12中的一個(gè)或多個(gè)核酸分子或其互補(bǔ)序列或其片段發(fā)生雜交。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的一個(gè)核酸分子在高度嚴(yán)格條件下和前面提出的SEQIDNO:9到SEQIDNO:12中的一個(gè)或多個(gè)核酸分子或其互補(bǔ)序列或其片段發(fā)生雜交。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子具有的核酸序列是前面提出的SEQIDNO:9到SEQIDNO:12或其互補(bǔ)序列或其片段的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子的序列與前述的SEQIDNO:9到SEQIDNO:12或其互補(bǔ)序列或其片段的序列有80%到100%或90%到100%的序列同一性。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面中，一個(gè)優(yōu)選的標(biāo)記物核酸分子的序列與前述的SEQIDNO:9到SEQIDNO:12或其互補(bǔ)序列或其片段的序列有95%到100%的序列同一性。SEQIDNO:9到SEQIDNO:12可以用來作為植物育種方法中的標(biāo)記物以鑒定基因雜交的后代，該方法與《DNA標(biāo)i己物方法，應(yīng)用和綜述〉X〈DNAmarkers:Protocols,applications,andreviews》(1997，173-185,Cregan等編著，Wiley-LissNY;)中介紹的簡(jiǎn)單序列重復(fù)DNA標(biāo)記物分析方法類似，上述所有引用的文獻(xiàn)在此完全引入作為參考。探針和目標(biāo)DNA分子的雜交可以通過任何一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行檢測(cè)，這些方法包括，但不局限于熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、抗體類標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。關(guān)于使用特定擴(kuò)增引物對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行的擴(kuò)增(例如，PCR)，"嚴(yán)格條件"指的是僅僅允許引物對(duì)同目標(biāo)核酸序列發(fā)生雜交的條件，具有與目標(biāo)DNA相應(yīng)的野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物對(duì)，能夠在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中結(jié)合到目標(biāo)DNA并且優(yōu)選產(chǎn)生唯一的擴(kuò)增產(chǎn)物，即擴(kuò)增子。術(shù)語"特異性結(jié)合(目標(biāo)序列)"指的是探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下僅僅同含有目標(biāo)序列的樣品中的目標(biāo)序列發(fā)生雜交。如這里所用的，"經(jīng)過擴(kuò)增的DNA"或"擴(kuò)增子"指的是作為核酸模板一部分的目標(biāo)核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，為了確定通過有性雜交方式得到玉米植林是否含有來自于本發(fā)明玉米植抹的轉(zhuǎn)基因個(gè)體基因組DNA，可以將從玉米植抹組織樣品中提取的DNA通過核酸擴(kuò)增方法產(chǎn)生擴(kuò)增子用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體DNA的存在，其所用的引物對(duì)包括一個(gè)來源于植物基因組中與插入的外源DNA插入位點(diǎn)相鄰的側(cè)翼序列的第一引物，和來源于插入的異源DNA的第二引物。擴(kuò)增子具有一定的長(zhǎng)度和序列也可用于對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體的檢測(cè)。擴(kuò)增子的長(zhǎng)度范圍可以是引物對(duì)的聯(lián)合長(zhǎng)度加上1個(gè)核苷酸堿基對(duì)、優(yōu)選加上約五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)、更為優(yōu)選加上約兩百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)以及甚為優(yōu)選加上約四百五十個(gè)核苷酸堿基對(duì)范圍?？蛇x的，引物對(duì)可以來自于插入DNA兩側(cè)的側(cè)翼序列，這樣就會(huì)產(chǎn)生包括整個(gè)插入核苷酸序列(例如，圖1中，pMON25496表達(dá)構(gòu)建體中的MlulDNA片段，約6706個(gè)核苷酸堿基對(duì))的擴(kuò)增子。來源于植林基因組序列的引物對(duì)中的一個(gè)可以位于距插入的DNA序列一定距離處，這段距離范圍可以從1個(gè)核苷酸堿基對(duì)到擴(kuò)增反應(yīng)的極限，或約兩萬個(gè)核苷酸堿基對(duì)。"擴(kuò)增子"術(shù)語的使用特別排除了在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以通過本領(lǐng)域中所知的任何一種核酸擴(kuò)增方法實(shí)現(xiàn)，包括，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。各種核酸擴(kuò)增方法在本領(lǐng)域內(nèi)為人所知而且特別在美國(guó)專利號(hào)4，683，195和4，683，202以及在《PCR方案方法和應(yīng)用指南》(《PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications》)Innis等編著，AcademicPress,SanDiego,1990)中有所描述。PCR擴(kuò)增方法已經(jīng)被發(fā)展到可以擴(kuò)增長(zhǎng)度達(dá)到22kb的基因組DNA和42kb的噬菌體DNA(Cheng等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl，Aca.Sci.USA)91:5695-5699，1994)。這些方法和其他一些在DNA擴(kuò)增領(lǐng)域?yàn)槿怂姆椒梢栽诒景l(fā)明的具體實(shí)踐操作中使用。插入的異源DNA序列和來自于玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)的側(cè)翼DNA序列可以通過擴(kuò)增從ATCC保藏登記編號(hào)為No.PTA-2478的種子或植抹中提取的DNA的序列進(jìn)行檢驗(yàn)(如果必要可以進(jìn)行修正)，該擴(kuò)增過程所用的DNA引物來源于其中所提供的序列，擴(kuò)增后對(duì)PCR擴(kuò)增子或克隆的DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA測(cè)序。這些方法所產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以通過多種技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。其中一個(gè)方法是GeneticBitAnalysis(Nikiforov,等.核酸研究(NucleicAcidRes.)22:4167-4175，1994)，該方法設(shè)計(jì)了一個(gè)跨越插入的DNA序列和相鄰的側(cè)翼基因組序列的DNA寡核苷酸鏈。將該寡核苷酸鏈固定在一個(gè)微孔板的微孔內(nèi)。在對(duì)所關(guān)注的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增(在插入序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列各使用一個(gè)引物)后，單鏈PCR產(chǎn)物可以和固定化的寡聚核苷酸鏈進(jìn)行雜交，并且作為單堿基延伸反應(yīng)的模板，該延伸反應(yīng)使用了DNA聚合酶和為下一個(gè)預(yù)期的堿基特定標(biāo)記的ddNTPs。可以通過焚光或ELISA類方法讀出結(jié)果。信號(hào)代表了插入/側(cè)翼序列的存在，說明進(jìn)行了成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸反應(yīng)。另一種方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所描述的高溫測(cè)序技術(shù)。在此方法中設(shè)計(jì)了一個(gè)跨越插入DNA和相鄰的基因組DNA結(jié)合部位的寡聚核苷酸鏈。將該寡聚核苷酸和所關(guān)注區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(在插入序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列各使用一個(gè)引物)進(jìn)行雜交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫?；?、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷-5，-磷硫酸鹽和熒光素一起進(jìn)行溫育。分別加入DNTPs，結(jié)合的結(jié)果會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生可測(cè)量的光信號(hào)。光信號(hào)代表了轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在，說明進(jìn)行了成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基或多堿基延伸反應(yīng)。Chen等(基因組研究(GenomeRes.)9:492-498,1999)所迷的熒光偏振現(xiàn)象也是一種可以用于檢測(cè)本發(fā)明擴(kuò)增子的方法。使用這種方法需要設(shè)計(jì)一個(gè)跨越插入DNA和相鄰的基因組DNA結(jié)合部位的寡聚核苷酸鏈。將該寡聚核苷酸和所關(guān)注區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(在插入的DNA內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列中各使用一個(gè)引物)進(jìn)行雜交，然后和DNA聚合酶以及一種焚光標(biāo)記的ddNTP—起進(jìn)行溫育。單堿基延伸會(huì)導(dǎo)致插入ddNTP。這種插入可以通過使用熒光儀測(cè)量其偏振的改變。偏振的改變代表了轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在，說明進(jìn)行了成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸反應(yīng)。T叫man0(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)被描述為一種檢測(cè)和定量分析DNA序列存在的方法，該方法在制造商所提供的使用說明中有詳細(xì)介紹?，F(xiàn)簡(jiǎn)要說明如下，設(shè)計(jì)一個(gè)跨越了插入DNA和相鄰的基因組側(cè)翼結(jié)合部位的FRET寡聚核苷酸探針。該FRET探針和PCR引物(插入DNA序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列各使用一個(gè)引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs存在下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。FRET探針的雜交導(dǎo)致FRET探針上熒光部分和淬滅部分的分裂以及熒光部分的釋放。熒光信號(hào)的產(chǎn)生代表了轉(zhuǎn)基因插入序列/側(cè)翼序列的存在，說明進(jìn)行了成功的擴(kuò)增和雜交。Tyangi等(自然生物技術(shù)(NatureBiotech.)14:303-308,1996)介紹了分子標(biāo)志在序列檢測(cè)中的應(yīng)用。簡(jiǎn)要說明如下，設(shè)計(jì)一個(gè)跨越了插入DNA和相鄰的基因組側(cè)翼結(jié)合部位的FRET寡聚核苷酸探針。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有二級(jí)結(jié)構(gòu)，該二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠在近距離內(nèi)保持熒光部分和淬滅部分。該FRET探針和PCR引物(插入DNA序列內(nèi)和相鄰的側(cè)翼基因組序列中各使用一個(gè)引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs存在下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。經(jīng)過成功的PCR擴(kuò)增，F(xiàn)RET探針和目標(biāo)序列的雜交導(dǎo)致探針二級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失，從而使熒光部分和淬滅部分在空間上發(fā)生分離。產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的產(chǎn)生代表了轉(zhuǎn)基因插入序列/側(cè)翼序列的存在，說明進(jìn)行了成功的擴(kuò)增和雜交。下面的實(shí)施例用于示范本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方案的實(shí)施例。本領(lǐng)i了發(fā)明人:Z:明的實(shí)際操作口中發(fā)現(xiàn)的:ft用良好的方法，因此可以被認(rèn)為在實(shí)際操作中構(gòu)成優(yōu)選的實(shí)施例。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)公開的特定實(shí)施方案可能會(huì)進(jìn)行很多的改動(dòng)，但在不背離本發(fā)明的范圍和精神的條件下，仍可以得到類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)(下文以nk603代表)是通過用來源于pMON25496(附圖l)的線性MluIDNA片段對(duì)玉米胚胎(Songstad等，InVitroCellPlant32:179-183,1996)進(jìn)行微粒轟擊而得到的。該DNA片段含有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)組件，這兩個(gè)組件共同使玉米植林具有對(duì)草甘膦的耐藥性。第一個(gè)表達(dá)組件由水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子和內(nèi)含子(P-Os.Actl和I-Os.Actl，美國(guó)專利號(hào)5,641,876)，操作連接到Arabid叩sisEPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TS-At.EPSPS:CTP2,Klee等,分子、基因、遺傳(Mol.Gen,Genet.)210:47-442,1987)上，操作連接到來土壤桿菌屬CP4抹(AGRTU.aroA:CP4，美國(guó)專利號(hào)5，633，435)的草甘膦耐藥性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)上，并操作地連接到胭脂堿合酶的轉(zhuǎn)錄終止子(T-AGRTU.nos,Fraley等美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sd.USA)80:4803-4807,1983)上而組成。第二個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)組件由含有增強(qiáng)子區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(P-CaMV.35S，Kay等Science236:1299-1302,1987;美國(guó)專利號(hào)5,164,316)，操作連接到Zea脂ys的Hsp70內(nèi)含子(I-Zm.Hsp70,美國(guó)專利號(hào)5,362,865)上，操作連接到ArabidopsisEPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TS-At.EPSPS:CTP2,Klee等，分子、基因、遺傳(Mol.Gen.Genet)210:47-442,1987)上，操作連接到來自土壤桿菌CP4林(AGRTU.aroA:CP4，美國(guó)專利號(hào)5，633，435)的草甘膦耐藥性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)上，和操作連接到胭脂堿合酶的轉(zhuǎn)錄終止子(T-AGRTU.nos，F(xiàn)raley等美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl，Acad.Sci.USA)80:4803-4807,1983)上而組成。經(jīng)過轟擊后，具有草甘膦耐藥性的轉(zhuǎn)基因胼胝體在含有3mM草甘膦的培養(yǎng)基中進(jìn)行挑取，然后再生得到植林。一共產(chǎn)生了來自91個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因個(gè)體的304林植林，然后依據(jù)一個(gè)高級(jí)的特性組合從這個(gè)群體中挑選nk603，這些特性包括草甘膦耐藥性、農(nóng)藝學(xué)表現(xiàn)和單個(gè)轉(zhuǎn)基因插入。對(duì)nk603個(gè)體及其后代進(jìn)行的溫室和大田生長(zhǎng)評(píng)估說明該轉(zhuǎn)基因插入使其荻得了在V4和V8葉期使用時(shí)為340g草甘膦/英畝的耐藥性(840g草甘膦/公頃；32ozRoundupUltm/英畝)，該標(biāo)準(zhǔn)超過了對(duì)完整營(yíng)養(yǎng)期(vegetative)和繁殖期(productive)耐藥性的商品規(guī)格。實(shí)施例2將草甘磷耐藥性nk603玉米個(gè)體和目前的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，GA21(美國(guó)專利號(hào)6,040,497)進(jìn)行對(duì)草甘膦營(yíng)養(yǎng)期損傷的耐藥性和對(duì)產(chǎn)量的影響的比較。GA21含有至少3個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)組件在GA21個(gè)體基因組中以串聯(lián)形式4非列(SCP/GMO/232-Final,EuropeancommissionHealth&ConsumerProtectionDirectorate-General)。GA21的轉(zhuǎn)基因組件由一個(gè)水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子和連接到一個(gè)核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽上，連接到一個(gè)修飾過的玉米草甘磷抗性EPSPS和一個(gè)3'胭脂堿合酶的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)的內(nèi)含子組成。nk603和GA21的植抹被成行種植在重復(fù)的田間試驗(yàn)小區(qū)上。處理?xiàng)l件為1)不噴灑，2)按64oz/英畝劑量在V4葉期噴灑RoundupUltra,然后在V8期按相同劑量再次噴灑RoundupUltra,3)按96oz/英畝劑量在V4葉期噴灑RoundupUltra,然后在V8期按相同劑量再次噴灑RoundupUltra。營(yíng)養(yǎng)期耐藥性是以營(yíng)養(yǎng)期損傷百分比的形式進(jìn)行度量的，該百分比是根據(jù)在V8期除草劑處理后第10天觀察到的葉子畸形數(shù)量而確定的。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)的產(chǎn)量是以蒲式耳/英畝以及除草劑處理后與未噴灑組相比產(chǎn)量降低率的形式進(jìn)行度量的。表1所顯示的結(jié)果說明和GA21植抹相比，nk603顯示出更低的營(yíng)養(yǎng)期損傷率，而觀察到的產(chǎn)量降低率也比GA21要小。在未噴灑小區(qū)也觀察到低的營(yíng)養(yǎng)期損傷發(fā)生率，這種現(xiàn)象歸因于各種環(huán)境因素的影響而不是因?yàn)楸┞队诓莞熟⒊輨┑挠绊憽k603中pMON25496的雙表達(dá)組件和3個(gè)單獨(dú)的僅由CaMV.35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)草甘膦耐藥性基因(AGRTU.aroA:CP4)表達(dá)的玉米個(gè)體就營(yíng)養(yǎng)期損傷率和繁殖率進(jìn)行比較。觀察到雙表達(dá)組件與3個(gè)單獨(dú)的玉米個(gè)體(evl，ev2，ev3)相比，可以使玉米獲得更高的營(yíng)養(yǎng)期耐藥性和繁殖耐藥性，這3個(gè)單獨(dú)的玉米個(gè)體僅含有由CaMV.35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)草甘膦耐藥性基因的表達(dá)組件。nk603加上3個(gè)附加的來自pMON25496的玉米個(gè)體和6個(gè)來源于草甘膦耐藥性基因表達(dá)僅僅被水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和內(nèi)含子(P-Os.AcU/I-Os.Actl)所驅(qū)動(dòng)的構(gòu)建體的玉米個(gè)體的平均傷害水平進(jìn)行比較，可以觀察到前者使玉米個(gè)體獲得更高的對(duì)草甘膦除草劑的營(yíng)養(yǎng)期耐藥性水平。用雙表達(dá)組件轉(zhuǎn)化的植物和來源于用單表達(dá)組件轉(zhuǎn)化的植物相比較，前者對(duì)營(yíng)養(yǎng)期和繁殖期損傷具有更高水平的草甘膦耐藥性，因此就導(dǎo)致了對(duì)使用草甘膦除草劑帶來的產(chǎn)量降低的抗性的提高。pMON25496構(gòu)建體在nk603的單一位點(diǎn)上提供了兩個(gè)植物表達(dá)組件，與在商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA21中的3個(gè)串聯(lián)插入相比，提高了對(duì)草甘膦的耐藥性水平。表l.nk603的草甘膦耐藥性-營(yíng)養(yǎng)期損傷、產(chǎn)量和繁殖車述GA21處理備件o/。營(yíng)養(yǎng)期M(駄nk603證未噴灑V4期和V8期各64盎司RoundupUltra處理V4期和V8期各96盎司RoundupUltra處理未噴灑V4期和V8期各64盎司RoundupUltra處理V4期和V8期各96盎司RoundupUltra⑧處理處理?xiàng)l件0.35.38.30.92.94,7nk603CaMV.35Sev1CaMV.35Sev2CaMV.35Sev3V8期64盎司Roundup'Ultra處理V8期64盎司RoundupUltra處理V8期64盎司RoundupUltra處理V8期64盎司RoundupUltra處理處理?xiàng)l件疆*)142.2134.1129.1145.6138.5140.1繁殖率4.52.02.22.4%產(chǎn)量降低車5.79.24.9.8nk603加上3個(gè)附加的pMON25496個(gè)體6個(gè)P-Os.Actl單組件個(gè)體V4期和V8期各128盎司RoundupUltra處理V4期和V8期各128盎司RoundupUltra處理平均％營(yíng)養(yǎng)期損傷率*22.928.9*表示營(yíng)養(yǎng)期損傷率是在V8期處理后第10天進(jìn)行的觀察，它是評(píng)估由于草甘磷處理引起的營(yíng)養(yǎng)期損傷的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。"表示雄性繁殖率4-5=完全可育；3=花粉排出顯著降低；0-2=完全不育-高度不育，不適于商業(yè)應(yīng)用。實(shí)施例3來自nk603的相應(yīng)的側(cè)翼DNA分子使用了GenomeWalkerTM試劑盒(catalog#K1807-1,CloneTechLaboratories,Inc，PaloAlto,CA)中所介紹的連接銜接子和嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法進(jìn)行了克隆。首先，來自nk603個(gè)體的基因組DNA用CTAB純化方法(Rogers等，植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol.)5:69-76,1985)進(jìn)行純化。用于擴(kuò)增的基因組DNA文庫根據(jù)試劑盒制造商的說明(GenomeWalkerTM，CloneTechLaboratories,Inc，PaloAlto,CA)進(jìn)行準(zhǔn)備。在各自的反應(yīng)中，基因組DNA用下述的平頭限制性內(nèi)切酶在37'C條件下消化過夜EcoRV，Seal,Dral,PvuII和Stul(CloneTechLaboratories,Inc,PaloAlto,CA)。反應(yīng)混合物用苯酚三氯曱烷進(jìn)行抽提，在水相中加入乙醇以沉淀dna，離心收集沉淀，然后在Tris-EDTA緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0.ImMEDTA)中將沉淀重懸。將純化的平頭基因組DNA片段按照制造商的說明連接到GenomeWalkerTM銜接子上。連接后，對(duì)各反應(yīng)用熱處理(70。C條件下5分鐘)以終止反應(yīng)，然后用Tris-EDTA緩沖液稀釋10倍。將1yl各個(gè)分別的連接產(chǎn)物在50pl反應(yīng)物中進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)物包括1y1各自的銜接子連接文庫、1m1的10jliMGenomeWalkerTM銜接子引物API(5，GTATATCGACTCACTATAGGGC3'，SEQIDNO:l)、1M1的10mMnk603轉(zhuǎn)基因-特異性寡聚核苷酸(5'TGACGTATCAAAGTACCGACAAAAACATCC3，，SEQidNO:2)、1m110mM脫氧核糖核芬酸2.5(Lil二曱基亞砜、5jul含有MgCl2的10XPCR緩沖液、0.5Ml(2.5個(gè)單位)AmpliT叫熱穩(wěn)定型DNA聚合酶(PEAppliedBiosystems,FosterCity，CA)，最后用水稀釋到50jul。反應(yīng)是在一個(gè)溫度循環(huán)儀中在計(jì)算的溫度控制下進(jìn)行的，溫度循環(huán)條件如下95。C下9分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94。C下2秒鐘、7(TC下3分鐘進(jìn)行7個(gè)循環(huán)；94'C下2秒鐘、65。C下3分鐘進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；65。C下4分鐘進(jìn)行l(wèi)個(gè)循環(huán)。將ljal的各個(gè)初級(jí)反應(yīng)液用水稀釋50倍，然后在二級(jí)反應(yīng)條件下擴(kuò)增(1m1各個(gè)稀釋的初級(jí)反應(yīng)液、的10mMGenomeWalkerTM嵌套式銜接子引物AP2(5'ACTATAGGGCACGCGTGGT3，，SEQIDNO:3)(由制造商提供)、1m1的10mMnk603轉(zhuǎn)基因-特異性嵌套式寡聚核苷酸(5，CTTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC3'，SEQIDNO:4)、1Ml的10mM脫氧核糖核苷酸、2.5jul二甲亞砜、5p1含有MgCl2的10XPCR緩沖液、0.5m1(2.5個(gè)單位)AmpliTaq熱穩(wěn)定型DNA聚合酶(PEAppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA),最后用水稀釋到50)j1。)使用如下的循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增95'C下9分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94'C下2秒鐘、7(TC下3分鐘進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94'C下2秒鐘、65'C下3分鐘進(jìn)行24個(gè)循環(huán)；65。C下4分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)。將代表跨越了nk603轉(zhuǎn)基因插入和鄰近的側(cè)翼玉米DNA的結(jié)合部位的5'區(qū)域的PCR產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，接著用QIAquickGelExtrationKit(catalog#28704，QiagenInc.,Valencia,CA)從瓊脂糖基質(zhì)中分離出純化的PCR產(chǎn)物，接著定向克隆到pGEM-TEasy栽體(catalog#A1360，Promega，Madison,WI)中?？寺『蟮腜CR產(chǎn)物的鑒定及其與pMON25496的MluI片段的關(guān)系通過DNA序列分析(ABIPrismTM377,PEBiosystems,FosterCity,CA和DNASTAR序列分析軟件，DNASTARInc.,Madison,WI)進(jìn)行確定。類似地，nk603的3，側(cè)翼玉米DNA序列使用退火成T-AGRTU.nos轉(zhuǎn)錄終止子的嵌套式基因特異性引物，例如，SEQIDNO:5(5，AGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC3，)和SEQIDNO:6(5'CAGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG3，)進(jìn)行擴(kuò)增和克隆。在nk603轉(zhuǎn)基因/基因組插入序列中有兩個(gè)T-AGRTU.nos轉(zhuǎn)錄終止子，一個(gè)在構(gòu)建體的內(nèi)部，一個(gè)在與玉米基因組DNA相鄰的構(gòu)建體的3'末端。對(duì)通過上述反應(yīng)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物測(cè)序，跨越了轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼序列接合部位的DNA序歹"通過與前述已知的pMON25496構(gòu)建體的基因元件序列相比較就可以與內(nèi)部T-AGRTU.nos的產(chǎn)物相區(qū)別。nk603轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)兩側(cè)的玉米DNA側(cè)翼序列通過對(duì)由Genome定。在轉(zhuǎn)基因插入^列的5'末端，位于插入接合^位附近的一個(gè)長(zhǎng)度為498bp的片段的序列已經(jīng)被確定(SEQIDNO:7)。該序列由304個(gè)堿基對(duì)(bp)的玉米側(cè)翼基因組DNA序列(SEQIDNO:7的核苷酸1-304)、45個(gè)bp的pMON25496構(gòu)建體DNA序列(SEQIDNO:7的核苷酸305-349)和149個(gè)bp的P-Os.Actl5'末端DNA序列(SEQIDNO:7的核苷酸305-498)組成。在3，插入接合部位附近的一個(gè)U83bp片段的DNA序列已經(jīng)被確定(SEQIDNO:8),該序列以164bp的T-AGRTU.nos轉(zhuǎn)錄終止子序列(SEQIDN0:8的核苷酸1-164)作為起始，然后是217個(gè)bp的pMON25496構(gòu)建體DNA序列(SEQIDNO:8的核苷酸165-381)和305個(gè)bp的玉米質(zhì)體基因，rpsll和rpoA(每一個(gè)基因的部分片段，對(duì)應(yīng)于Genebank目錄編號(hào)為X07810的63-363位堿基，對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:8的堿基382-686)，余下的DNA序列由整合位點(diǎn)側(cè)翼的玉米基因組DNA序列(與SEQIDNO:8的堿基687-1193對(duì)應(yīng))組成。接合DNA分子，SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12在nk603中是新的DNA分子，他們可以用于檢測(cè)玉米植抹nk603及其后代。SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11中的接合分子代表了轉(zhuǎn)基因DNA片段和玉米基因組DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的約9個(gè)核苦。SEQIDNO:9位于SEQIDNO:7的295-314核苷酸位置上。接合序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:ll分別位于SEQIDNO:8的373-390和678-695核苷位置上，代表了構(gòu)建體DNA序列和玉米質(zhì)體DNA序列的接合DNA分子(SEQIDNO:10)以及構(gòu)建體序列和玉米基因組DNA序列的接合DNA分子(SEQIDNO:ll)。SEQIDNO:12位于SEQIDNO:8的156-173核苷位置上，代表了nk603中的一個(gè)新的DNA分子，因?yàn)樵摲肿邮荰-AGRTU,nos終止子序列和一個(gè)水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子DNA序列的反向片段的融合。實(shí)施例4DNA個(gè)體《I物對(duì)被用來產(chǎn)生檢測(cè)nk603的擴(kuò)增子。這些個(gè)體引物對(duì)包括但不局限于5'擴(kuò)增子DNA分子的SEQIDNO:13和SEQIDNO:14以及3'擴(kuò)增子DNA分子的SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。除了這些引物對(duì)，任何一種來源于SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的引物對(duì)在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生可用于檢測(cè)nk603的DNA擴(kuò)增子，這是本發(fā)明的一個(gè)方面。這些分析所用的對(duì)5，轉(zhuǎn)基因插入/基因組結(jié)合區(qū)域的擴(kuò)增條件在表2和表3中進(jìn)行了說明。相同的方法也應(yīng)用于3'擴(kuò)增子DNA分子的擴(kuò)增過程，該過程使用的引物DNA分子是SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，不過對(duì)這些用DNA分子或其互補(bǔ)序列以產(chǎn)生用于鑒定nk603的擴(kuò)增子DNA分子的方法的任何改動(dòng)都屬于本領(lǐng)域的一般性技術(shù)。另外，用于擴(kuò)增玉米內(nèi)源基因的一個(gè)對(duì)照引物對(duì)(SEQIDNO:17和18)被包括在內(nèi)，作為反應(yīng)條件的一個(gè)內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)nk603植物組織DNA抽提樣品的分析應(yīng)該包括一個(gè)nk603的陽性組織DNA抽提物對(duì)照，一個(gè)來源于非nk603玉米植物的陰性DNA抽提物對(duì)照和一個(gè)不含有模板玉米DNA抽提物的陰性對(duì)照。具有足夠長(zhǎng)度的附加的DNA引物分子可以由DNA擴(kuò)增領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員從SEQIDN0:7和SEQIDNO:8中進(jìn)行選擇，而且擴(kuò)增子制備的優(yōu)化條件可以和表2和表3所示的方法不同，但都會(huì)產(chǎn)生可用于檢測(cè)nk603的擴(kuò)增子。這些帶有對(duì)表2和3的方法的改變的DNA引物序列的使用在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于檢測(cè)nk603的擴(kuò)增子，其中至少有一個(gè)來源于SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的具有足夠長(zhǎng)度的DNA引物分子，這是本發(fā)明的一個(gè)方面。用于檢測(cè)nk603的擴(kuò)增子，其中至少有一個(gè)來源于pMON25496的任一基因元件的具有足夠長(zhǎng)度的DNA引物分子，這是本發(fā)明的一個(gè)方面。nk603擴(kuò)增子的檢-瞼可以通過i吏用如表3所示的StratageneRobocycler,MJEngine,Perkin-Elmer9700，或EppendorfMastercyclerGradientThermocycler等儀器進(jìn)行，也可以用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的其他方法和設(shè)備進(jìn)行。表2:用于確定nk6035'轉(zhuǎn)基因插入/基因組結(jié)合區(qū)域的PCR程序和反應(yīng)混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表3:不同的溫度循環(huán)儀的PCR參數(shù)建議值輕輕混合，如果需要的話(溫度循環(huán)儀無頂部加熱)，在各反應(yīng)液上方力口入l-2滴礦物油。然后在StratageneRobocycler,MJEngine,Perkin-Elmer9700，或EppendorfMastercyclerGradientThermocycler等儀器中按照下表中的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR。注MJEngine或EppendorfMastercyclerGradientThermocycler應(yīng)該運(yùn)行在計(jì)算的模式下。Perkin-Elmer9700Thermocycler運(yùn)行時(shí)rampspeed要設(shè)為最大。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>孟山都公司上述公開的PV-ZMGT32(nk603)的玉米種子按照布達(dá)佩斯條約于2000年9月18日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110進(jìn)行了保藏。其ATCC目錄編號(hào)為PTA-2478,分類命名CornZeaMays:PV-ZMGT32。該保藏物在保存庫中維持時(shí)間在30年，或最后一次取樣后5年，或?qū)＠挠行谶@三者中選取最長(zhǎng)的一個(gè)，在這段時(shí)間內(nèi)如有必要保藏物將進(jìn)行更新。在對(duì)本發(fā)明的原則進(jìn)行了說明和描述后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該可以清楚的看到在不違背上述原則的基礎(chǔ)上，可以對(duì)本發(fā)明在具體的安排和細(xì)節(jié)上進(jìn)行改動(dòng)。我們要求在附錄的權(quán)利要求書的范圍和精神以內(nèi)的所有的改動(dòng)。在本規(guī)范說明書中所引用的所有的出版物和發(fā)表的專利文獻(xiàn)在這里引入作為參考，其性質(zhì)和對(duì)每一篇單獨(dú)的出版物和專利申請(qǐng)都特別指出作為參考是一致的。序列表<110>MonsantoCoBehr,CarlHironaka,CatherineHeck,GregoryYou,Jinsong<120>玉米個(gè)體PV-ZMGT32(nk603)和用于對(duì)其檢測(cè)的組合物和方法<130>38-21(S22Sa)B<150>60/213,5672000-06-22<150>60/241,215<151>2000-10-13<150>60/240,0"<151>2000-10-13<160>16<170>版本3.0<210>工<211>22<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>(1)..(22)<223>全合成的<400>gtatatcgactcactatagg<210>2<211>30<212>DNA<213>人造的<220>來源<222>(1>..(30)<223;全合成的<400>2tgacgtatcaaagtaccgac<210>32230<211>13<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>(1)..(19)<223>全合成的<400;>3actatagggcacgcgtggt19<210>4<211>23<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>(1)(29)"2h全合成的<400>4ctttgttttattttggactatcccgactc29<210>5<211:>26<212>DNA<213>人造的<220><221:來源<222>(D,.(2S)<223>全合成的"00>5agattgaatcctgttgccggtcttgc26<210>S<211>28<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>(1>.(28)<223>全合成的<400>6gcggtgtcatctatgttactagatcg的28<210>7<2U>438<212>DNA<213>人造的<220:><221>來源<222>U).,("8)<223>l-304Zea玉米基罔組DNA305_349構(gòu)建我體DNA350-498水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子DNA<400>7貼tcg3tccaaaatcgcgactgaaatggtggaagaaagagagaacagagagcctcacgtt60tccagggtgaagtatcagagtstgg3gac3ag時(shí)gggg汰g120gaggtaaacagatcagcatcagcgctcgaaagtttcgtcaaaggatgcggaactgtttcc180agccgccgtcgccattcggccagactcctcctctctcggcatgagccgatcttttctctg240gcatttccaaccctsgagacgtgcgtccctggtg的ctgctcggccagcaagccttgtag300cggcccacgcgt的taccaagcttgatatcccta的gc的ccgcgttascaagcttdctc360gaggtcattcatatgcttgagaagagagtcg的atagtcc420aaagtgaaaacatc這gttaaaa的tgtataaagtaaaatatc的taataa480aaggtggccc"8<210>8<211>1183<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>U),U183)<223>1-164根癌土壤扦菌nos3'終止子165-381構(gòu)建我休DNA382-683Zea玉米廣體基罔，rpsll和rpoA687-1183Zea玉米基因組DNA"00>8gacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgc60gatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctat120gttactagatcggggatatccccggggaattcggtaceaagcttttataatagtagaaaa180gagta站tttcactttgggccaccttttattaccgatattttsctttataCC3CCtttt3240actgatgfttttcacttttgaccaggtaatcttacctttgttttattttggsctatcccga300ctctcttctcaagcatatgagtaagcttgttaacgcggccgccctaggga360tatcaagcttggtaccacgcgacacacttccactctagtgtttgagt的atcctgttatc420tcttctcgraaccataacagactagtattatttgatcattgaatcgtttatttctcttgaa480agcggtttcattttttttt3cagacgtctttttttaggaggtcgacatccattatgcggc540ataggtgttacatcgcgtatacaacttaaccgtacaccacttttagcaat訴ctcgtaat600gcggcatctcttccgctaccagcsccttttctgctcgttgcaaacccact6S0gtacgaatagcatctactgctgttctgctgactttattttttttaatae.agtgaaaaacc720ctgcccttcactaccggtcggagcgacgccgssgatgggg780ttcaacacggtcgcgacacggatgcaacggaccctccaagccaatactcgaggccggacc840gacgacgtag3cagg的t3gccataacgacggtggcggcatccaacttgttctttccctt900tctctgtcttcaacttgcgccggcagtctgctagacccaggggatgctgt960ggtcgcgg的cccgatttttatagcctgggcgaggacgagcttggccgaaccgatccaga1020gctctgcgcaaatcacgaagraaccagtggggccgctcgcgcctagcccaccgccaggagc1080ggggcttgttgcg的ccgtsgcgtcg的時(shí)cgctaggggggcccatgctc1140atg1183<210>9<211>19<212>DMA<213>人造的<220;><221>奉源<222>(1>,.(13)<223>Zea玉米基罔組和栽體DNA<400>9tgtagcggcccacgcgtgg19<210>10<2;li>18<212><213><220><221><222><223>DNA人造的來源(1)..(1B)Zea玉米基目組和栽體DNA<400>10taccacgcgacacacttc1B<210><211><212><213><220><221><222><223>1118DNA人造的來源(1)..(18)Zea玉米基因組和栽體DNA<400>11tgctgttctgctgacttt18<210>12<211:>18<212>DNA<213>人造的<221>來源<222>(1>-ClB)<223>根癌土壤桿菌nos3'終止了和水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子DNA"00>12accaagcttttataatag18<210>13<211>22<212:DNA<213>人造的<220><221>來源<222>(1)…(22)<223>全合成的<400>13aatcgatccaaaatcgcgactg22<210>14<211>22<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>(1>..(22)<223>全合成的<400>14ttcactttgggccscctttt<210>15<211>22<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222;>(1)..(22)<223;全合成的<400>15gacgttatttatgagatggg<210>16<211>22<212>DNA<213>人造的<220><221>來源<222>U)..(22)<223>全合成的2222<400>16catcatctcgcgccttcctttc2權(quán)利要求1.DNA分子，該分子選自SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9，SEQIDNO10，SEQIDNO11和SEQIDNO12，其中所述的DNA分子存在于玉米植株，種子，組織，細(xì)胞或細(xì)胞核中。2.玉米細(xì)胞，其包含SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。3.玉米細(xì)胞核，其包含選自SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:IO，SEQIDNO:l1和SEQIDNO:12的DNA分子。4.一種生產(chǎn)耐受施用的草甘膦除草劑的玉米植抹的方法，該方法包括(a)使對(duì)草甘膦耐受的玉米植株與另一玉米植林雜交，所述的草甘膦耐受的玉米植株包含SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12;(b)從(a)中所述的雜交荻得至少一抹子代植抹；(c)通過噴灑草甘膦對(duì)子代進(jìn)行篩選，其中所述的子代是草甘膦耐受的，并包含SEQIDNO:9,SEQIDNO:10，SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12。全文摘要本發(fā)明提供了一個(gè)能夠使轉(zhuǎn)基因玉米植株具有耐藥性的DNA構(gòu)建體。同時(shí)也提供了以插入玉米基因組的重組構(gòu)建體的DNA序列和插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列為基礎(chǔ)的檢測(cè)PV-ZMGT32(nk603)玉米個(gè)體存在的分析方法。文檔編號(hào)A01HGK101186918SQ20071015434公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期2001年6月22日優(yōu)先權(quán)日2000年6月22日發(fā)明者C·F·貝爾,C·希羅納卡,G·R·赫克,J·尤申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司