專利名稱：利用種子脂肪酶缺失材料選育作物耐儲藏品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種種子長壽命、耐儲藏作物品種的選育的方法。
背景技術(shù)：
種子是植物長期進(jìn)化的產(chǎn)物，是植物個體發(fā)育的一個階段。它是植物上一代的結(jié)束，同時又是下一代的開始。它肩負(fù)著植物世代繁衍和進(jìn)化的使命。在人類的選擇和自然進(jìn)化的雙重作用下，植物的種子除了上述作用外還成為人類食物的主要來源。所以作物種子不但是農(nóng)業(yè)的最基本的生產(chǎn)資料，也是最基本的生活資料。種子和糧食的安全儲藏對我國這樣一個具有13億人口的世界上第一人口大國來說意義十分重大。
研究表明作物種子的結(jié)構(gòu)和成分等直接影響的種子的壽命和耐儲藏特性，例如凡是種皮致密、色深的作物種子其生活力較強(qiáng)；種子中脂肪含量高的種子由于脂肪易氧化、酸敗、活力下降快、壽命短。我國是農(nóng)業(yè)大國也是人口大國。粗略估計全國每年農(nóng)作物播種面積15萬公頃以上，其中糧食作物播種面積約10萬公頃，糧食總產(chǎn)4.5億噸。作物用種量約1.5萬噸。由于糧食和種子儲藏、儲備過程中的陳化變質(zhì)以及種子的老化，每年造成的損失達(dá)數(shù)百億之巨。
在我國主要農(nóng)作物中花生是最不耐儲藏的作物之一，另外一個最重要的糧食作物水稻也是不耐儲藏的糧食品種，在一般儲存條件下稻谷第二年就開始陳化變質(zhì)，稻谷的儲存極限為3年左右。為此國家儲備糧采用分散分批、定期推陳儲新、輪流更新的方法，或作生產(chǎn)工業(yè)酒精原料，由此耗費(fèi)了大量的人力、物力和財力。稻谷陳化變質(zhì)過程中，產(chǎn)生大量陳味，導(dǎo)致其食用性差，種子生活力差，發(fā)芽率下降等，給人們的生活和生產(chǎn)帶來了不利的影響，也嚴(yán)重影響國家儲備的能力。
關(guān)于作物種子和糧食老化和陳化機(jī)理眾說紛紜，概括起來大致有胞壁、蛋白質(zhì)變化說，認(rèn)為造成種子變化的主要原因在于胞壁和淀粉粒外圍蛋白質(zhì)變化；直鏈和支鏈淀粉含量相對變化說；羰基化合物說；游離脂肪酸說；脫支酶說；巰基變化說等，長期以來，水稻等作物種子脂類與陳化的研究始終受到人們的關(guān)注，但是脂肪酶的作用一直未得到重視。水稻脂肪酶的研究也僅僅局限于米糠穩(wěn)定化和大米風(fēng)味營養(yǎng)的問題，而對水稻等作物種子脂肪酶與其儲藏陳化變質(zhì)的關(guān)系研究甚少。
作物種子的脂肪含量和分布因作物種類和品種不同差異很大，在稻谷中脂類含量約為3％，是稻谷的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一。它比蛋白質(zhì)、淀粉具有更高能量，且與維生素A，D，E，F(xiàn)，K等共存。同時，脂肪所含的花生烯酸、亞麻酸、亞油酸對防止動脈硬化及高血膽固醇癥效果明顯。因此，稻谷脂肪是一種營養(yǎng)豐富，又具醫(yī)療保健作用的物質(zhì)。稻谷脂肪受稻谷的儲藏影響，稻谷在氧氣及高溫條件下儲藏以后，稻谷脂肪極易發(fā)生水解、氧化，致使稻谷品質(zhì)劣變。稻谷脂類的變化被認(rèn)為是導(dǎo)致稻谷陳化的最主要因素。脂肪酶是脂肪分解代謝中第一個參與反應(yīng)的酶，一般認(rèn)為它對脂肪的轉(zhuǎn)化速率起著調(diào)控的作用，是稻谷儲藏過程中脂肪酸敗變質(zhì)的主要原因之一。隨著稻谷的儲藏，脂肪的分解，游離脂肪酸含量增加，脂肪酸組成發(fā)生變化，嚴(yán)重影響了稻谷的食用品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。
一般來說目前延緩作物種子和糧食的衰老和陳化變質(zhì)，主要通過工程技術(shù)有常規(guī)儲藏技術(shù)、通風(fēng)降溫降水技術(shù)、自然低溫儲藏技術(shù)、機(jī)械低溫儲藏技術(shù)、氣調(diào)儲藏技術(shù)、化學(xué)儲藏技術(shù)等。但這些都不能從根本上解決問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，水稻種子中脂肪酶在水稻種子衰老和稻谷陳化變質(zhì)中扮演十分重要的角色。在云南水稻品種中篩選出一個種子脂肪酶活性低的材料，其在室溫條件下保存42個月發(fā)芽率仍高達(dá)98.5％、成苗率達(dá)85％，表現(xiàn)出極強(qiáng)種子生活力和耐儲藏特性。作物中油菜本發(fā)明是基于作物自身的遺傳基因控制種子脂肪酶的表達(dá)，包括脂肪酶的缺失和脂肪酶抑制劑的高水平表達(dá)，配合脂肪酶活性檢測、分子標(biāo)記輔助選擇等相關(guān)技術(shù)，選育脂肪酶活性低的長壽命、耐儲藏的作物新品種的一種新方法、新途徑。
利用種子脂肪酶缺失材料選育作物耐儲藏品種的方法，是篩選脂肪酶的缺失或脂肪酶抑制劑的高水平表達(dá)的材料，分別與優(yōu)良糧油作物水稻、玉米、油菜、花生等品種或雄性不育系或雄性不育恢復(fù)系進(jìn)行雜交，其F1材料以后再采取自交、回交、花藥培養(yǎng)或誘變的方法加快耐儲藏和優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗性狀的聚合，選育作物耐儲藏品種。
實現(xiàn)上述目標(biāo)的主要技術(shù)路線從上述技術(shù)路線我們可以看出利用脂肪酶全缺失材料分別與優(yōu)良水稻品種、雄性不育系、雄性不育恢復(fù)系進(jìn)行雜交，其F1材料以后逐代再采取自交、回交、花藥培養(yǎng)或誘變的方法，從F2或Fn代進(jìn)行脂肪酶同功酶檢測、分子標(biāo)記檢測、人工老化及實倉儲藏等篩選，獲得脂肪酶活性低(攜帶脂肪酶缺失基因或脂肪酶抑制基因)的水稻新品(系)種、雄性不育系、雄性不育恢復(fù)系；攜帶脂肪酶缺失基因的雄性不育系與攜帶脂肪酶缺失基因的雄性不育恢復(fù)系雜交，進(jìn)而選育和配制耐儲藏水稻新組合。
本發(fā)明所述的分子標(biāo)記檢測，即分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)．是指從幼苗、種子、葉片等組織或器官中提取DNA，從分子水平檢測脂肪酶的缺失情況。
利用脂肪酶活性缺失種質(zhì)改良水稻、油菜、玉米、花生等作物的種子生活力和耐儲藏特性。通過誘變、雜交、回交、花藥培養(yǎng)等，加快耐儲藏(低脂肪化酶活性)、豐產(chǎn)性、抗性、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的”集聚”以及基因的修飾和遺傳改良，獲得一批脂肪酶活性低的耐儲藏水稻新品種(組合)，以及選配雜交組合所需的質(zhì)核互作型雄性不育系(CMS)、光(溫)敏核雄性不育系(S)和雄性不育恢復(fù)系，滿足稻谷安全儲藏中對耐儲藏專用型水稻品種需求。
本發(fā)明的優(yōu)點1、利用作物自身遺傳特性選育耐儲藏農(nóng)作物新品種，為我國糧食安全提供了一條有效途徑。
2、減緩了種子因貯備陳化等原因造成的生活力下降，發(fā)芽率變差的速度，提高了種子的發(fā)芽率與成苗率。延緩糧油儲藏過程中的陳化變質(zhì).
3、提高了糧油加工副產(chǎn)品的儲存時間與穩(wěn)定性。以水稻為例；米糠是稻谷加工的主要副產(chǎn)品之一。按稻谷產(chǎn)量5％計算，我國年產(chǎn)米糠約800~1000萬噸，米糠由于富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素等，能廣泛用于食品行業(yè)，從而提高食品的營養(yǎng)價值與功能特性。利用米糠制取米糠油可以減少我國進(jìn)口大豆的三分之一。米糠還可以提取糠蠟、植酸、植酸鈣、肌醇、谷維素、谷甾醇、牙周寧等成分，經(jīng)濟(jì)價值高。但是米糠中富含脂肪酶、脂肪氧化酶，在它們的共同作用下使脂肪酸敗變質(zhì)，所以米糠加工后極易發(fā)生酸敗，目前多用作家禽、畜禽和魚類的飼料。本發(fā)明培養(yǎng)的種子，由于其脂肪酶、脂肪氧化酶缺失，米糠穩(wěn)定性大大提高，米糠中含有的豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維，礦物質(zhì)和維生素等，都可以分別開發(fā)利用，米糠將大幅度增值，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。


附圖為本發(fā)明技術(shù)路線圖。
具體實施例方式
首先提供一種種子脂肪酶的檢測方法，以下各實施例中均可以采用該方法檢測。
一、粗酶的提取取稻胚5～20粒(玉米胚則取1～2粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg)放入研缽中，加入1ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，充分研磨后，即為粗酶液。
二、底物乳化液的配制將橄欖油和異辛烷按2∶3(V/V)混合，經(jīng)高速攪拌均質(zhì)化，得到底物乳化液。
三、銅指示劑的配制稱取5g乙酸銅，溶解于100ml蒸餾水中，過濾，用吡啶將濾液的PH值調(diào)至6.1，得到銅指示劑。
四、粗酶活力測定將5ml底物乳化液在35℃下預(yù)熱后，加入1ml粗酶液、1ml 0.005mol/l CaCl2、1ml 0.5mol/l NaCl、5ml PH7.5 Tris-HCl緩沖液，35℃水浴下攪拌30min(劇烈震蕩)。反應(yīng)完畢后加入2ml 6mol/l HCl，加熱至沸騰5min，冷卻后加入5ml異辛烷，再將溶液混勻(劇烈震蕩)，靜置后，觀察顏色深淺。深則表示脂肪酶活性高，淺則表示脂肪酶缺失。
以下方法同樣適于花生、玉米、油菜小麥等作物．實施例一利用脂肪酶活性低的種質(zhì)如水稻脂肪酶缺失皖優(yōu)2090和和隱性純合突變體材料DawDamlox-3-lox-3-雜交。雜交后代進(jìn)行自交、回交、花藥培養(yǎng)、誘變．進(jìn)行脂肪酶、脂質(zhì)氧化酶同功酶檢測、篩選，聚合脂肪酶、脂質(zhì)氧化酶缺失性狀于聚合體A材料。并對A材料進(jìn)行豐產(chǎn)性鑒定或作為育種材料提供lox-1-lox-1-，lox-2-lox-2-，lox-3-lox-3-和脂肪酶基因，可同時解決水稻稻谷貯藏中的抗陳化與抗倉儲害蟲問題。
實施例二利用脂肪酶缺失種質(zhì)和生產(chǎn)上主栽的優(yōu)良水稻品種，如早秈、中秈、中粳、晚秈、晚粳等不同類型進(jìn)行雜交。并通過逐代回交和自交，結(jié)合脂肪酶的檢測及脂肪酶分子標(biāo)記輔助選擇，選育脂肪酶缺失的具有其它重要優(yōu)良農(nóng)藝性狀的水稻新品種。
實施例三利用實施例二所選育的水稻新品種和水稻雄性不育系進(jìn)行雜交。通過逐代回交和自交，結(jié)合脂肪酶同功酶的檢測，選育脂肪酶水稻雄性不育系(CMS，S)。
實施例四利用實施例二所選育的水稻新品種和具有恢復(fù)基因的水稻品種進(jìn)行雜交。通過逐代回交和自交，結(jié)合脂肪酶的檢測，選育具有脂肪酶且同時具有恢復(fù)基因的水稻新恢復(fù)系。
實施例五利用實施例三、實施例四的雄性不育系(CMS，S)和雄性不育恢復(fù)系，配制脂肪酶缺失的強(qiáng)優(yōu)勢組合。
實施例六對利用脂肪酶缺失材料和雄性不育系、雄性不育恢復(fù)系以及生產(chǎn)上主栽的水稻品種進(jìn)行雜交的后代(F1、F2)進(jìn)行花藥培養(yǎng)。獲得單倍體植株并進(jìn)行加代，通過結(jié)合脂肪酶的檢測及脂肪酶分子標(biāo)記輔助選擇，，選育脂肪酶缺失的水稻新品種、新組合。
實施例七按照水稻選育方法，利用脂肪酶檢測技術(shù)篩選缺失糧油作物種質(zhì)和生產(chǎn)上主栽的優(yōu)良品種進(jìn)行雜交。通過誘變，結(jié)合脂肪酶的檢測及脂肪酶分子標(biāo)記輔助選擇，選育脂肪酶缺失的具有其它重要優(yōu)良農(nóng)藝性狀的低脂肪酶活性作物耐儲藏新品種。
權(quán)利要求
1.利用種子脂肪酶缺失材料選育作物耐儲藏品種的方法，其特征在于篩選脂肪酶的缺失或脂肪酶抑制劑的高水平表達(dá)的材料，分別與優(yōu)良糧油作物水稻、玉米、油菜、花生等品種或雄性不育系或雄性不育恢復(fù)系進(jìn)行雜交，其F1材料以后再采取自交、回交、花藥培養(yǎng)或誘變的方法加快耐儲藏和優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗性狀的聚合，選育作物耐儲藏品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于利用脂肪酶全缺失材料分別與優(yōu)良水稻品種、雄性不育系、雄性不育恢復(fù)系進(jìn)行雜交，其F1材料以后逐代再采取自交、回交、花藥培養(yǎng)或誘變的方法，從F2或Fn代進(jìn)行脂肪酶同功酶檢測、分子標(biāo)記檢測、人工老化及實倉儲藏等篩選，獲得攜帶脂肪酶缺失基因或脂肪酶抑制基因，脂肪酶活性低的水稻新品系或新品種、雄性不育系、雄性不育恢復(fù)系；攜帶脂肪酶缺失基因的雄性不育系與攜帶脂肪酶缺失基因的雄性不育恢復(fù)系雜交，進(jìn)而選育和配制耐儲藏水稻新組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用種子脂肪酶缺失材料選育作物耐儲藏品種的方法，是篩選脂肪酶的缺失或脂肪酶抑制劑的高水平表達(dá)的材料，分別與優(yōu)良糧油作物水稻、玉米、油菜、花生等品種或雄性不育系或雄性不育恢復(fù)系進(jìn)行雜交，其F
文檔編號A01H1/02GK1706242SQ20051003771
公開日2005年12月14日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者吳躍進(jìn), 余增亮, 張瑛, 吳敬德, 王鈺, 高山 申請人:中國科學(xué)院等離子體物理研究所