專利名稱：人參愈傷組織細胞凍干及超低溫保存方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物種質(zhì)資源的細胞保存，特別是人參愈傷組織細胞的保存。本發(fā)明涉及人參愈傷組織細胞的凍干方法和超低溫保存方法，以及凍干的人參愈傷組織細胞。
背景技術：
植物遺傳多樣性是保護人類生存環(huán)境和維持農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的一個關鍵因素，如何保存和利用物種多樣性是當今社會面臨的重大課題之一。植物組織培養(yǎng)技術與超低溫保存技術在植物種質(zhì)的長期保存中有重要作用，其中一些方法已開始進入應用。至今還未形成一種既在實驗室常用，同時又能夠大規(guī)模長期穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)的技術手段，在一些技術環(huán)節(jié)上尚需進一步完善。
而對于許多植物細胞，例如人參愈傷組織細胞，尚未有任何保存方法被提出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種保存植物種質(zhì)，特別是人參愈傷組織細胞的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種恢復植物種質(zhì)，如人參愈傷組織細胞的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種保存的植物種質(zhì)，如人參愈傷組織細胞。
本發(fā)明的其它目的，體現(xiàn)在本發(fā)明內(nèi)容的詳細描述之中根據(jù)本發(fā)明，一種保存人參愈傷組織細胞的方法，包括1)在低溫下，將人參愈傷組織細胞與保護劑混合，2)將混合物用冷凍干燥法或超低溫法進行處理，3)保存處理后的混合物。
本發(fā)明中采用的保護劑含有海藻糖，例如含有10％的海藻糖；根據(jù)需要，還可以添加蔗糖，例如添加10％的蔗糖。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，該保護劑含有10％海藻糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該保護劑含有10％海藻糖，10％蔗糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
根據(jù)本發(fā)明的方法，人參愈傷組織細胞與保護劑混合前，可對該細胞進行預培養(yǎng)(加速傳代、提高培養(yǎng)基滲透壓、低溫鍛煉)。該保護劑與預培養(yǎng)細胞按1∶1-1∶3的體積比混合。
根據(jù)本發(fā)明一種恢復保存的細胞生長的方法，包括1)在40-60℃解凍保存的細胞，2)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)解凍的細胞。
本發(fā)明還涉及一種保存的人參愈傷組織細胞。


圖1是本發(fā)明人參愈傷組織細胞凍干及超低溫保存方法的流程圖。
1.本發(fā)明采用了冷凍干燥保存技術成功地保存了人參愈傷組織，具有操作簡單、經(jīng)濟合理、可大批量保存冷凍材料優(yōu)點。
2.本發(fā)明采用了超低溫保存技術成功地保存了人參愈傷組織，具有操作簡單、細胞凍存后恢復生長快優(yōu)點。
3.本發(fā)明使用海藻糖作為植物細胞保存保護劑組分，作為植物種質(zhì)資源的細胞保存保護劑，特別是人參愈傷組織細胞保存保護劑，目前還尚未有報道。
4.本發(fā)明提供了理想的玻璃化保護劑，海藻糖可以和甘油、DMSO、蔗糖、葡萄糖、鮮脫脂牛奶、脯氨酸中配制成復合保護劑并選擇各組分最佳組合，使細胞更容易進入玻璃化狀態(tài)。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1待凍存材料的準備用液體懸浮培養(yǎng)，愈傷組織細胞以培養(yǎng)5～7天為宜；用固體培養(yǎng)，愈傷組織細胞以培養(yǎng)10～15天為宜。
實施例2保護劑配制取海藻糖、蔗糖、葡萄糖、鮮脫脂牛奶、脯氨酸分別配制1-6號保護劑，1、2、4、5、6號保護劑使用67V液體培養(yǎng)基溶解，3號保護劑直接使用鮮脫脂牛奶溶解。分別進行凍干及超低溫保存。各濃度如下1號保護劑5％DMSO、10％甘油2號保護劑20％蔗糖、5％DMSO、10％甘油3號保護劑鮮脫脂牛奶、5％DMSO、10％甘油4號保護劑1.0M脯氨酸、5％DMSO、10％甘油5號保護劑10％海藻糖、5％DMSO、10％甘油6號保護劑10％海藻糖、10％蔗糖、5％DMSO、10％甘油實施例3預培養(yǎng)取待凍存材料在添加海藻糖、蔗糖、葡萄糖、鮮脫脂牛奶、脯氨酸成分的培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)，如按5、6號保護劑配方凍存細胞時，在添加5％DMSO和5％海藻糖的67V培養(yǎng)基中25℃預培養(yǎng)3d，再在5％DMSO和10％海藻糖67V培養(yǎng)基中4℃預培養(yǎng)1d。
實施例4冷凍干燥保存方法首先在冰浴上(0℃)保護劑與預培養(yǎng)細胞按1∶3的體積混合，其濃度為原濃度的1/4，緩緩加入，輕輕攪拌，10min后吸去液體。然后，在原濃度的保護劑中冰浴處理5min，最后以每冷凍管細胞和保護劑的總體積為1ml分裝于西林瓶中，置凍干機內(nèi)經(jīng)預凍后，-28℃冷凍干燥22h，取出置-20℃冰箱中凍存。
實施例5超低溫保存方法首先在冰浴上(0℃)保護劑與預培養(yǎng)細胞按1∶3的體積混合，其濃度為原濃度的1/4，緩緩加入，輕輕攪拌，10min后吸去液體。然后，在原濃度的保護劑中冰浴處理5min，最后，以每冷凍管細胞和保護劑的總體積為1ml分裝于塑料凍存管中，以每分鐘降1℃，至-50℃迅速投入液氮中凍存。
實施例6將實施例4中凍存后的細胞放入液體洗滌培養(yǎng)基中洗滌10min，洗滌時應逐漸稀釋，液體洗滌培養(yǎng)基為預培養(yǎng)所用的67V液體培養(yǎng)基吸去洗滌液，液體洗滌培養(yǎng)基需置于0℃，洗滌后細胞轉入預培養(yǎng)所用67V固體培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)。觀察細胞恢復生長情況。細胞恢復生長良好。
實施例7將實施例5中凍存后的細胞在60℃水浴中1min快速化凍，把細胞團放入液體洗滌培養(yǎng)基中洗滌10min，洗滌時應逐漸稀釋，液體洗滌培養(yǎng)基為預培養(yǎng)所用的67V液體培養(yǎng)基吸去洗滌液，液體洗滌培養(yǎng)基需置于0℃，洗滌后細胞轉入預培養(yǎng)所用67V固體培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)。觀察細胞恢復生長情況。細胞恢復生長良好。
本發(fā)明結果說明在本發(fā)明中觀察到當使用1、2、3、4、5、6號保護劑，分別采用冷凍干燥和超低溫法保存人參愈傷組織細胞，在經(jīng)過0-6月保存期后，解凍再培養(yǎng)，均有部分細胞恢復生長。但是，使用5、6號保護劑按凍干和超低溫法保存解凍后，細胞恢復期短，生長較快，在5-6周后便可觀察到細胞分裂長出鮮嫩的新細胞，而且6號優(yōu)于5號。而使用1-4號保護劑按凍干和超低溫法保存解凍后，細胞恢復期較長，細胞存在不同程度褐化現(xiàn)象，生長較慢，在8-10周后，甚至更長時間，才能觀察到細胞分裂長出鮮嫩的新細胞。本發(fā)明還觀察到使用5、6號保護劑，同時按凍干和超低溫法保存懸浮培養(yǎng)細胞，超低溫法細胞恢復生長較凍干法快。
實驗說明，采用含海藻糖的保護劑，用凍干法和超低溫法凍存人參愈傷組織細胞是可行的，并且效果很好。
在觀察細胞恢復生長時，由于目前最常用的TTC法和FDA法檢測細胞活性，檢測的只是細胞內(nèi)某中酶的綜合作用，而真正細胞活性，還需保持細胞結構的完整性，即使經(jīng)TTC法和FDA法檢測的相對存活率很高，但接種到恢復培養(yǎng)基上，可能根本不能恢復生長，說明細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)或其他結構已遭受不可逆的致命損傷。因此，在本發(fā)明中采用最直接、最有力、最具有實際價值的方法，既觀察細胞凍存后恢復生長的比率為判定細胞存活指標。
權利要求
1.一種保存人參愈傷組織細胞的方法，包括1)在低溫下，將人參愈傷組織細胞與保護劑混合，2)將混合物用冷凍干燥法或超低溫法進行處理，3)保存處理后的混合物其中該保護劑含有海藻糖。
2.權利要求1的方法，其中該保護劑含有10％海藻糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
3.權利要求2的方法，其中該保護劑還含有10％蔗糖。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中該保護劑含有10％海藻糖、10％蔗糖、5％DMSO和10％甘油。
5.根據(jù)權利要求1-4中之一的方法，進一步包括在人參愈傷組織細胞與保護劑混合前，對該細胞進行預培養(yǎng)。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其中該保護劑與預培養(yǎng)細胞按1∶1-1∶3的體積比混合。
7.一種恢復保存的細胞生長的方法，包括1)在40-60℃解凍保存的細胞，2)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)解凍的細胞。
8.一種按權利要求1-6的方法保存的人參愈傷組織細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了人參愈傷組織細胞凍干及超低溫保存的方法，其中使用海藻糖作為人參細胞凍干及超低溫保存保護劑組分。本發(fā)明還涉及一種保存的人參愈傷組織細胞。采用本發(fā)明的方法，保護人參愈傷組織細胞的效果明顯。
文檔編號A01H4/00GK1532279SQ0312098
公開日2004年9月29日 申請日期2003年3月26日 優(yōu)先權日2003年3月26日
發(fā)明者盛軍, 劉曉宇, 李娟 , 劉丹, 回悅君, 郭橋, 于海鵬, 王志武, 張雪梅, 蔡偉明, 盛 軍 申請人:長春生物制品研究所