一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地涉及通過優(yōu)化培養(yǎng)基關(guān)鍵組分濃度和孢子濃度，控制菌球大小，從而提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]曲酸是一種與葡萄糖結(jié)構(gòu)相似的有機酸，是由好氧微生物利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于酒類、醬油及豆瓣醬等釀造產(chǎn)品中。目前，國內(nèi)外主要利用米曲霉(Aspergillums oryzae)及不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉(Aspergillus flavus)發(fā)酵生產(chǎn)曲酸。由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、與金屬離子螯合等性質(zhì)，曲酸常用作防腐劑、殺蟲劑、抗菌劑等，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化妝品等各個行業(yè)。
[0003]曲霉作為典型的絲狀真菌，液態(tài)深層發(fā)酵與其他單細胞微生物相比，一個顯著的特征是個體形態(tài)具有明顯的變化，易形成多種形態(tài)，使其發(fā)酵過程變得復(fù)雜與難以控制。絲狀真菌在液態(tài)發(fā)酵過程中菌體形態(tài)主要分為絲狀、球狀、團狀，這主要由自身的遺傳特性與環(huán)境因素共同影響。菌體的形態(tài)受多個基因調(diào)控，影響曲霉屬菌體形態(tài)發(fā)育的基因主要有1^?4/^0(^、117口(:、8￥(^和86口4等。通過這些基因編碼的蛋白質(zhì)維持菌絲極性、控制細胞大小或細胞間隔膜的間距、組織肌動蛋白微絲和促進菌絲尖端生長等來改變菌體形態(tài)。影響菌體形態(tài)的環(huán)境因素主要包括培養(yǎng)基組成(如碳氮源的種類及濃度、磷酸鹽的水平、金屬離子的添加等)、環(huán)境條件(如溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶解氧及二氧化碳水平、機械剪切力、通氣量等)、接種量、孢子形狀、表面活性劑的種類、補料方式等。
[0004]對于絲狀真菌而言，菌體的外觀和微觀上的變化與酶、代謝產(chǎn)物的合成及分泌有著密切的關(guān)系，也會導(dǎo)致整個發(fā)酵過程參數(shù)(如流變性等)截然不同，對目標產(chǎn)物的產(chǎn)率有重要影響。發(fā)酵不同產(chǎn)物達到最高發(fā)酵強度的菌體最佳形態(tài)也不相同。然而，目前關(guān)于米曲霉菌體形態(tài)和曲酸生產(chǎn)的研究還有不足，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)有效提高曲酸產(chǎn)量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法。本發(fā)明涉及一株株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，已于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué))，保藏編號CCTCC M 2014436。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及兩方面的技術(shù)方案:
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供了一種提高米曲霉產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](i)從保藏管中取一環(huán)孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，25?35°C培養(yǎng)4?6d;
[0009](ii)將培養(yǎng)4?6d的成熟孢子用無菌生理鹽水洗下，經(jīng)玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，并用血球計數(shù)板計數(shù)；
[0010](iii)將孢子懸浮液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速150?250r/min，在25?35°C下培養(yǎng)20?40h;
[0011](iv)按6?15% (v/v)的接種量，將液體種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速150?250r/min，25?35°C下恒溫搖床培養(yǎng)3?5d ；
[0012]其中，步驟(iv)中所述的液體種子的菌球直徑為0.25?0.35mm。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為250mL三角瓶中裝20?40mL培養(yǎng)基。
[0014]本發(fā)明的第二方面，提供了一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法，包括種子液中菌球直徑的控制。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述菌球直徑為0.1?0.5mm，較佳的0.2?0.4mm，最佳的0.25?
0.35mm0
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括種子培養(yǎng)基關(guān)鍵組分對菌球直徑的影響。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括孢子懸浮液濃度對菌球直徑的影響。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述種子培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為60?160g/L。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述種子培養(yǎng)基中的酵母提取物濃度為25?15g/L。
[°02°] 在另一優(yōu)選例中，所述孢子懸浮液的孢子濃度為107?108個/mL。
[0021 ]在另一優(yōu)選例中，所述孢子懸浮液的接種量為6?15%。
[0022]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0023]圖1顯示了葡萄糖濃度對菌球直徑的影響。
[0024]圖2顯示了酵母提取物濃度對菌球直徑的影響。
[0025]圖3顯示了孢子濃度對菌體形態(tài)及菌球直徑的影響。
[0026]圖4顯示了菌絲與菌球形態(tài)對曲酸產(chǎn)量的影響。
圖5顯示了菌球直徑與單位細胞合成曲酸能力的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法。實驗表明，米曲霉菌球的直徑隨著葡萄糖濃度提高而增大，隨著酵母提取物濃度提高菌球直徑先減小后增大。米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的最佳形態(tài)為菌球，并且菌球直徑與曲酸合成能力關(guān)系密切，菌球直徑為0.25?0.35mm時，單位細胞曲酸積累量最高。
[0028]通用材料和方法
[0029]丨.培養(yǎng)方法
[0030]生孢培養(yǎng):從-70°C的甘油保藏管中取一環(huán)孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。
[0031]種子培養(yǎng):將培養(yǎng)5d的成熟孢子用無菌生理鹽水洗下，經(jīng)玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)。將孢子懸浮液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200r/min，在30 °C下恒溫搖床培養(yǎng)30h。
[0032]發(fā)酵培養(yǎng):按10%(v/v)的接種量，將液體種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為250mL三角瓶中裝入30mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速200r/min，30°C下恒溫搖床培養(yǎng)4d。
[0033]2.分析方法
[0034]曲酸含量測定:采用三氯化鐵比色法測定。
[0035]生物量測定:采用干重法，將發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后用蒸餾水洗滌，置于干燥箱中65°C烘干至恒重，用稱重法測定其生物量。
[0036]菌體形態(tài)測定:光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝，菌球直徑用顯微鏡標尺測量。
[0037]粘度測定:取30mL發(fā)酵液用Brookfield DV-S數(shù)顯粘度計進行測定，選用轉(zhuǎn)子型號為4#，轉(zhuǎn)速為60 %。
[0038]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0039]除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0040]實施例1葡萄糖濃度對菌球直徑的影響
[0041 ]將生孢培養(yǎng)基中的孢子用無菌生理鹽水洗下，制成孢子懸浮液后，接種到含有不同葡萄糖濃度(60?160g/L)的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30h后測定菌球大小。結(jié)果表明，隨著種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的逐漸增大，A.0ryzae菌球直徑也隨之由0.23mm增大到0.463mm(見圖1)。
[0042 ]實施例2酵母提取物濃度對菌球直徑的影響
[0043]同實施例1中孢子懸浮液的制備，然后接種到含有不同酵母提取物濃度(2.5?15g/L)的種子培養(yǎng)基中，于30°C條件下，培養(yǎng)30h后測定菌球大小。結(jié)果顯示，酵母提取物對A.0ryzae菌球大小的影響不同于葡萄糖，當酵母提取物濃度從2.5g/L提高至10g/L時，A.0ryzae菌球直徑從0.52mm降低到0.265mm，之后隨著酵母提取物濃度繼續(xù)提高菌球直徑也增大(見圖2)。
[0044]實施例3孢子濃度對菌球形成的影響
[0045]制備不同濃度的孢子懸浮液，分別接種到相同配方的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30h后測定菌球大小。結(jié)果如圖2所示，當孢子懸浮液濃度為17?1iMVmIJt，A.0ryzae主要形成菌球(見圖3A a/c)，且在一定范圍內(nèi)菌球直徑與孢子濃度呈負相關(guān)，即孢子懸浮液濃度越高，菌球直徑越小，接種孢子濃度為2 X 17個/mL的菌球直徑為是孢子濃度為1.2 X 18個/mL的3.61倍(見圖3B)。
[0046]實施例4基于形態(tài)的曲酸發(fā)酵優(yōu)化
[0047]將種子液培養(yǎng)過程中獲得的不同形態(tài)的菌體，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。在本實施例中，測定了曲酸產(chǎn)量，研究了菌體形態(tài)對A.0ryzae生產(chǎn)曲酸的影響。當菌體形態(tài)為菌球時，A.0ryzae的產(chǎn)酸能力較高，曲酸產(chǎn)量達到15.1lg/L，相比菌絲明顯提高(見圖4)，A.0ryzae發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的最佳形態(tài)為菌球。
[0048]實施例5菌球直徑對曲酸產(chǎn)量的影響
[0049]將不同大小的菌球接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定曲酸產(chǎn)量。菌球直徑對曲酸產(chǎn)量有一定的影響，最佳菌球直徑范圍為0.25?0.35mm，此時單位細胞曲酸積累量最高為0.778g/g(見圖5)。
[0050]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1.一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括控制種子液的菌球直徑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌球直徑為0.25?0.35mm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通過改變種子培養(yǎng)基中的葡萄糖和酵母提取物濃度及孢子濃度來控制菌球直徑。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括制備種子液的步驟:將米曲霉接種于生孢培養(yǎng)基中，然后用無菌生理鹽水將成熟孢子洗下，玻璃珠打散后將孢子懸浮液接種至種子培養(yǎng)基中。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述孢子懸浮液濃度為16?18個/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將種子液以3?20%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，生孢培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖50，玉米淀粉10，酵母提取物5，KH2P04 5,MgSO4.7H20 2.5，瓊脂20。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖(50?200)，玉米淀粉10，酵母提取物(I?20)，KH2P04 5,MgSO4.7Η20 2.5。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖120，酵母提取物3，豆餅粉5，KH2P04 2,MgSO4.7Η20 0.5。10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)速200r/min，30°(:恒溫培養(yǎng)30h。11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:裝液量為20?40mL培養(yǎng)基(250mL三角瓶)，轉(zhuǎn)速200r/min，30°C恒溫發(fā)酵4d。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，通過改變培養(yǎng)基關(guān)鍵組分的濃度與接種條件控制米曲霉的菌落形態(tài)為球形(菌體處于最佳產(chǎn)酸形態(tài))，進而提高曲酸產(chǎn)量。當菌體形態(tài)為菌球時，米曲霉(A.oryzae)的產(chǎn)酸能力比菌絲時明顯提高，曲酸產(chǎn)量可達15.11g/L。同時，菌球直徑范圍為0.25～0.35mm時，單位細胞曲酸積累量最高為0.778g/g。本發(fā)明優(yōu)化了種子培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母提取物濃度和孢子濃度，控制菌球大小，從而提高了米曲霉單位細胞曲酸產(chǎn)量，具有很好的應(yīng)用前景。CCTCC NO:M 201443620140920
【IPC分類】C12P17/06, C12R1/69, C12N1/14
【公開號】CN105647815
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】楊海泉, 沈微, 華珊, 陳獻忠, 許菲, 劉晗, 樊游
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月16日