一種地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種地下水體生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法，利用地下水微生物完整性指數(shù)作為判斷指標(biāo)，包括以下步驟：微生物群落豐富度指數(shù)計(jì)算：收集微生物細(xì)胞，提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物雙末端測(cè)序；候選生物參數(shù)確定：設(shè)定參照點(diǎn)與受損點(diǎn)，選取與步驟中豐富度相關(guān)、群落組成相關(guān)和對(duì)干擾耐受能力相關(guān)的參數(shù)作為計(jì)算生物完整性指數(shù)的候選參數(shù)；確定微生物完整性指數(shù)值：進(jìn)行指數(shù)值分布范圍分析和判別能力分析，篩選生物參數(shù)；生態(tài)系統(tǒng)的健康檢測(cè)：以步驟中參照點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值分布的95％分位數(shù)最佳值。本發(fā)明具有較強(qiáng)的敏感性，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確、全面客觀地反映地下水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況?！緦＠f明】一種地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境污染監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要是利用地下水微生物完整性指數(shù)作為判斷指標(biāo)，來評(píng)價(jià)地下水生態(tài)系統(tǒng)健康的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]地下水是地球上最豐富且分布最廣泛的淡水資源。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，人類過度干擾地下水系統(tǒng)而又不加以保護(hù)，導(dǎo)致部分區(qū)域地下水水質(zhì)惡化、形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、水文條件變化、生境退化以及重要或敏感生物消失，甚至釀成難以彌補(bǔ)的嚴(yán)重后果。因此，開展地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)研究，建立有效的評(píng)價(jià)指標(biāo)和科學(xué)方法，準(zhǔn)確診斷地下水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況，將對(duì)地下水可持續(xù)利用與管理以及促進(jìn)地下水生態(tài)系統(tǒng)健康發(fā)展具有重大意義。[0003]目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)地下水的評(píng)價(jià)主要從水文地質(zhì)條件與污染物分布等方面展開。例如，專利"一種地下水環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)方法"（201410314367.0)和"一種地下水污染源強(qiáng)評(píng)價(jià)方法"（201510616503.6)分別以地下水中污染物濃度與污染源強(qiáng)為指標(biāo)評(píng)價(jià)地下水，孫才志在《基于ArcView_W0E的下遼河平原地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)》一文中通過含水層上覆氣帶特征、含水層滲透系數(shù)和地下水礦化度等十個(gè)地下水環(huán)境指標(biāo)構(gòu)建評(píng)價(jià)體系。但是，這些評(píng)價(jià)方法均不能直接反映地下水生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。在水體生態(tài)系統(tǒng)中，生產(chǎn)者、消費(fèi)者和分解者共同構(gòu)成系統(tǒng)生物群落，在生存環(huán)境受到干擾后，這些生物將產(chǎn)生各異的生物學(xué)響應(yīng)。如果能夠利用其反應(yīng)敏感的生物參數(shù)對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，將更好更直接地掌握水體生態(tài)系統(tǒng)健康狀況。生物完整性指數(shù)方法便是基于此發(fā)展的水體生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法，該方法以魚、大型無脊椎動(dòng)物、藻類或浮游生物等生產(chǎn)者和消費(fèi)者為研究對(duì)象，從生物類群的組成和結(jié)構(gòu)來反映水體生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況，定量描述生物特性與非生物因子的關(guān)系，建立對(duì)環(huán)境干擾最敏感的生物參數(shù)，通過比較參數(shù)值與參考系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)值對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)健康水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。但是，地下水生態(tài)系統(tǒng)中由于大型生物豐度低，生物信息匱乏，基于生產(chǎn)者和消費(fèi)者發(fā)展的生物完整性指數(shù)方法并不適用于地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)領(lǐng)域。[0004]地下水生態(tài)系統(tǒng)中的分解者主要是微生物，它們是水體自我凈化的基礎(chǔ)。微生物群落特性與水生態(tài)環(huán)境具有高度相關(guān)性，微生物的變化比水文地球化學(xué)指標(biāo)的變化更為敏感，其結(jié)構(gòu)特征和功能狀態(tài)可以反映地下水生態(tài)系統(tǒng)對(duì)污染輸入脅迫的響應(yīng)。在水體污染嚴(yán)重區(qū)域，生產(chǎn)者和消費(fèi)者的豐度及多樣性顯著減少，數(shù)據(jù)可獲得性難度增加，而微生物作為分解者，功能活性極其活躍，群落結(jié)構(gòu)多樣性高，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與完善，Illumina等高通量測(cè)序技術(shù)可以克服傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法通量低、準(zhǔn)確性低等缺點(diǎn)，更加快速、靈敏獲取更全面的環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)信息，從而更加綜合客觀地認(rèn)識(shí)地下水環(huán)境中原位微生物在污染脅迫下生態(tài)特征的變化。因此，通過構(gòu)建基于地下水微生物群落特性的生物完整性指數(shù)方法，考察地下水生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，可望提供更全面更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)地下水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況，為我國(guó)地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)和管理提供更全面的科學(xué)基礎(chǔ)與技術(shù)支持?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的在于打破現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用的局限性，提高評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性，應(yīng)用微生物群落結(jié)構(gòu)信息計(jì)算微生物完整性指數(shù)，提供一種利用微生物完整性指數(shù)來評(píng)價(jià)地下水水質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)的健康評(píng)價(jià)方法。[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種地下水生態(tài)系統(tǒng)的健康評(píng)價(jià)方法，利用地下水微生物完整性指數(shù)作為判斷指標(biāo)，包括以下步驟：A、微生物群落豐富度指數(shù)計(jì)算：收集地下水樣品中的微生物細(xì)胞，提取微生物基因組DNA，以DNA為模板，針對(duì)16SrRNA的V4-V5可變區(qū)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物，切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物，后進(jìn)行雙末端測(cè)序；過濾掉低質(zhì)量序列并挑選代表性序列并進(jìn)行聚類與注釋，隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選出相同數(shù)目的序列，進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算微生物群落豐富度指數(shù)；B、候選生物參數(shù)確定設(shè)定參照點(diǎn)與受損點(diǎn)，選取與步驟A)中豐富度相關(guān)、群落組成相關(guān)和對(duì)干擾耐受能力相關(guān)的參數(shù)作為計(jì)算生物完整性指數(shù)的候選參數(shù)，計(jì)算干擾耐受參數(shù)與棲境參數(shù)的最適值，確定關(guān)鍵環(huán)境因子的敏感和耐受微生物分類單元；C、確定微生物完整性指數(shù)值對(duì)步驟B)中確定的候選生物參數(shù)進(jìn)行指數(shù)值分布范圍分析和判別能力分析，篩選生物參數(shù)，采用比值法計(jì)算各樣點(diǎn)中篩選到的各生物參數(shù)分值，累加各參數(shù)分值得到各樣點(diǎn)的生物完整性指數(shù)值；D、生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)以步驟C)中參照點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值分布的95%分位數(shù)作為健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最佳值，低于該值的分布范圍進(jìn)行5等分，靠近95%分位數(shù)的一等分代表被測(cè)樣點(diǎn)處于健康狀態(tài)，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標(biāo)準(zhǔn)。[0007]本發(fā)明的有益效果為:運(yùn)用微生物群落結(jié)構(gòu)完整性指數(shù)可以綜合評(píng)價(jià)地下水生態(tài)系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的敏感性，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確、全面地反映地下水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況。將微生物完整性指數(shù)應(yīng)用于評(píng)價(jià)地下水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況必將進(jìn)一步補(bǔ)充和完善地下水健康評(píng)價(jià)體系，為地下水生態(tài)系統(tǒng)健康分級(jí)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，也為該區(qū)域地下水資源的可持續(xù)利用和管理提供支撐。本發(fā)明可廣泛適用于地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)，在時(shí)間和空間動(dòng)態(tài)都能進(jìn)行長(zhǎng)期和短期的監(jiān)測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。[0008]進(jìn)一步優(yōu)化，步驟A中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物，在MiSeqPE300等測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序；測(cè)序得到的序列reads，采用微生物16srRNA分析管道QUME等生物信息學(xué)軟件過濾掉低質(zhì)量序列，生成〇TUtable，挑選代表性序列并進(jìn)行OTUs的聚類與注釋，隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選出相同數(shù)目的0TU序列，利用QUME等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算微生物群落豐富度指數(shù)。[0009]微生物16srRNA分析管道QIIME(QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology)是一個(gè)專門針對(duì)于微生物群落的分析管道，可以進(jìn)行OUT，以及多樣性分析等等。擁有處理16srRNA所需要的軟件并呈現(xiàn)相應(yīng)的處理結(jié)果。[0010]reads(讀長(zhǎng))是高通量測(cè)序中一個(gè)反應(yīng)獲得的測(cè)序序列。在測(cè)序過程中，一條DNA分子的兩端都可以測(cè)序。先測(cè)其中的一端，獲得一個(gè)reads，然后再轉(zhuǎn)到另一端測(cè)序，獲得另外一個(gè)reads。得到的這兩個(gè)reads就是PEreads，PEreads的獲得有助于后期序列組裝。[0011]采用新一代Illumina高通量測(cè)序技術(shù)獲取更全面客觀的地下水微生物群落結(jié)構(gòu)信息(可包括數(shù)目極少的細(xì)菌和古菌），避免了有限的微生物群落信息造成M-IBI指數(shù)值計(jì)算的誤差。[0012]進(jìn)一步優(yōu)化，步驟B)中通過以下公式計(jì)算干擾耐受參數(shù)與棲境參數(shù)的最適值：Uk=Zmi=ixiyki/Zmi=iyki式中，xi表不樣點(diǎn)環(huán)境變量值;yki表不屬種k在i號(hào)樣品中的相對(duì)豐度;U表不屬種k的最適值。[0013]其中，步驟D)中：地下水樣點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值<0.65,地下水生態(tài)系統(tǒng)為極差狀況，水質(zhì)為V類水平；0.65<微生物完整性指數(shù)值<1.30，地下水生態(tài)系統(tǒng)為較差狀況，水質(zhì)為IV類水平；1.30<微生物完整性指數(shù)值<1.95，地下水生態(tài)系統(tǒng)為一般狀況，水質(zhì)為m類水平；1.95<微生物完整性指數(shù)值<2.60，地下水生態(tài)系統(tǒng)為亞健康狀況，水質(zhì)為Π類水平；2.60<微生物完整性指數(shù)值<3.25，地下水生態(tài)系統(tǒng)為健康狀況，水質(zhì)為I類水平。[0014]本發(fā)明具體包括以下步驟：1)將待檢樣品的微生物細(xì)胞進(jìn)行收集，提取微生物基因組DNA，以DNA為模板，針對(duì)16SrRNA的V4-V5可變區(qū)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物，在MiSeqPE300等測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序；3)測(cè)序得到的序列reads，采用微生物16srRNA分析管道QUME等生物信息學(xué)軟件過濾掉低質(zhì)量序列，生成〇TUtable，挑選代表性序列并進(jìn)行OTUs的聚類與注釋。隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選出相同數(shù)目的0TU序列，利用QIME等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算微生物群落豐富度指數(shù)；4)候選生物參數(shù)確定:設(shè)定參照點(diǎn)與受損點(diǎn)，選取與豐富度相關(guān)的參數(shù)、與群落組成相關(guān)的參數(shù)和與對(duì)干擾耐受能力有限的參數(shù)作為計(jì)算生物完整性指數(shù)的候選參數(shù)。采用典范對(duì)應(yīng)分析和加權(quán)平均回歸的方法計(jì)算干擾耐受參數(shù)與棲境參數(shù)的最適值，確定關(guān)鍵環(huán)境因子的敏感和耐受微生物分類單元；5)對(duì)4)確定的候選生物參數(shù)進(jìn)行指數(shù)值分布范圍分析和判別能力分析，篩選生物參數(shù)，并對(duì)篩選的生物參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析；6)采用比值法計(jì)算各樣點(diǎn)中由5)篩選到的各生物參數(shù)分值，累加各參數(shù)分值得到各樣點(diǎn)的微生物完整性指數(shù)值；7)以參照點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值分布的95%分位數(shù)作為健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最佳值，低于該值的分布范圍進(jìn)行5等分，靠近95%分位數(shù)的一等分代表被測(cè)樣點(diǎn)處于健康狀態(tài)，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標(biāo)準(zhǔn)；8)將6)計(jì)算得到的各樣點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值指數(shù)值參照7)建立的健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)各樣點(diǎn)生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況?！揪唧w實(shí)施方式】[0015]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式詳予說明。[0016]微生物完整性指數(shù)(microbiomeindexofbioticintegrity)，以下簡(jiǎn)稱M-IBI。[0017]首先選取內(nèi)蒙古自治區(qū)某城市內(nèi)尾礦庫(kù)周邊地下水，采集與尾礦庫(kù)距離不同的樣點(diǎn)地下水總計(jì)12個(gè)。選擇人為活動(dòng)明顯、靠近尾礦庫(kù)、可能有點(diǎn)源污染的9個(gè)樣點(diǎn)為受損點(diǎn)(G1，G2，G3，G4，G5，G6，G7，G8，G9)，選擇遠(yuǎn)離尾礦庫(kù)、無點(diǎn)源污染、受人為活動(dòng)影響小、污染小的其余地下水樣點(diǎn)作為參照點(diǎn)(610,6111，612)。測(cè)定各樣點(diǎn)地下水水質(zhì)酸堿度(？!〇，溫度(T)，溶解氧(D0)，電導(dǎo)率(Ec)、氧化還原電位(Eh)、溶解性總固體(TDS)、總硬度(GH)、高錳酸鉀指數(shù)、氨氮(順4+)、硝態(tài)氮(N〇3-)、亞硝態(tài)氮(N02-)、硫酸根(S〇42-)等多項(xiàng)理化指標(biāo)，如表1所示。收集的地下水低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即抽濾過膜收集微生物細(xì)胞，將膜置于_20°C保存?zhèn)溆谩0018]表1包鋼稀土尾礦庫(kù)周邊地下水理化特征(c/mg·L一4將冷凍保存的濾膜采用滅菌剪刀剪碎轉(zhuǎn)移至DNA提取的破碎管中，DNA提取步驟參照FastDNASpinKitforSoil(MP醫(yī)療，美國(guó)）試劑盒說明書進(jìn)行。得到的DNA樣品采用帶有barcode序列的引物對(duì)（515F:5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'和907R:5'_CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）對(duì)16SrRNA基因V4-V5區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系是包括40~50ng模板DNA，25μL的2XPremixExTaqTM聚合酶（TAKARA，Japan)，0·5μL牛血清蛋白(BSA)(20mg/mL，TAKARA，日本）以及10μΜ引物各1yL，用無菌水補(bǔ)充至50yL。擴(kuò)增條件是95°C預(yù)變性3min，隨后94°C變性30s，58退火1min，72延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72延伸5min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物采用通用DNA純化試劑盒(天根，中國(guó)）進(jìn)行純化回收。所得純化的DNA樣品米用Quant-iTPicoGreendouble-strandedDNA(dsDNA)試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）進(jìn)行定量，具體步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等份合并后，送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序采用雙末端測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)采用IlluminaMiSeqPE300高通量測(cè)序平臺(tái)。高通量測(cè)序分析共獲得729,827條序列。通過不同的barcode序列區(qū)分并分配到相應(yīng)的樣品中，采用QHME軟件包去除獲得序列中包含模糊堿基的，引物錯(cuò)配的或者多于6個(gè)堿基同聚物的序列，并過濾掉含有>20bp低質(zhì)量堿基的低質(zhì)量序列，隨后去掉引物序列。采用RDPclassifier的方法生成OTUtable(cutoff=97%)，去除嵌合體序列和單一序列。選擇每個(gè)0TU中豐度最大的序列為代表性序列，將代表性序列與Greengenedatabase進(jìn)行比對(duì)分類。為使樣品間的序列數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選最小數(shù)目19,221條序列，利用QIIME進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算地下水豐富度指數(shù)(Chao-Ι指數(shù)，Shannon指數(shù)，Simpson指數(shù)，物種累計(jì)數(shù)，偏Simpson指數(shù)，Observedspecies，均勾度指數(shù)以及PD_whole_tree進(jìn)化多樣性等）。[0019]通過CCA分析和蒙特卡羅(MonteCarlo)置換檢驗(yàn)分析與微生物群落結(jié)構(gòu)變化顯著相關(guān)的環(huán)境因子。硒含量與微生物群落分布具有極顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.008<0.01)。另增加其他影響微生物群落分布的主要因子溶解氧、溫度、高錳酸鉀指數(shù)，總共4個(gè)關(guān)鍵環(huán)境因子，它們?cè)趨⒄拯c(diǎn)和受損點(diǎn)中的分布見表2。然后利用加權(quán)平均回歸方法計(jì)算各分類單元的最適值，其具體運(yùn)算公式如下：Uk=Zmi=ixiyki/Zmi=iyki式中，xi表不樣點(diǎn)環(huán)境變量值;yki表不屬種k在i號(hào)樣品中的相對(duì)豐度;Uk表不屬種k的最適值。然后根據(jù)微生物對(duì)環(huán)境因子的最適值不同，并按照各樣點(diǎn)環(huán)境因子的25%與75%百分位數(shù)為分界點(diǎn)，將其劃分為對(duì)環(huán)境干擾的敏感種、中間種或耐受種(見表3)。選取與豐富度相關(guān)的參數(shù)、與群落組成相關(guān)的參數(shù)和與對(duì)干擾耐受能力有限的參數(shù)作為計(jì)算生物完整性指數(shù)的參數(shù)。對(duì)參數(shù)進(jìn)行分布范圍分析，根據(jù)參照點(diǎn)和受損點(diǎn)的數(shù)據(jù)計(jì)算各生物參數(shù)值，分析生物參數(shù)對(duì)人類干擾的反應(yīng)，挑選出對(duì)人類干擾反應(yīng)單向遞增或遞減的候選指標(biāo)，剔除掉分布范圍太大或太小的指數(shù)，總共確定了26種候選生物參數(shù)(見表4)〇[0021]表4地下水微生物生物完整性指數(shù)的候選生物參數(shù)隨后對(duì)候選參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行判別能力分析和相關(guān)性分析，篩選或淘汰不能充分反映地下水生態(tài)系統(tǒng)受損情況的參數(shù)。判別能力分析即對(duì)剩余參數(shù)在參照點(diǎn)和受損點(diǎn)的分布做箱體圖，比較各指數(shù)在參照點(diǎn)和受損點(diǎn)的25%~75%分位數(shù)范圍即箱體四分位范圍（IQ)。根據(jù)箱體的重疊情況，對(duì)IQ(生物判別能力)賦予不同的值，如無重疊，IQ=3;部分重疊，但各自中位數(shù)值都在對(duì)方箱體范圍之外，IQ=2;僅一個(gè)中位數(shù)值在對(duì)方箱體范圍之內(nèi)，IQ=1;各自中位數(shù)值都在對(duì)方箱體范圍之內(nèi)，IQ=〇。獲得可以參與計(jì)算M-IBI的4個(gè)生物參數(shù)：M13(Methyloversatilis屬相對(duì)豐度）；M20(高溫敏感屬相對(duì)豐度）；M25(Pseudidiomarina屬相對(duì)豐度）;M26(Thiobacillus屬相對(duì)豐度）經(jīng)過上述判別能力分析后，選取IQ判別的指數(shù)用SPSS22.0作Pearson相關(guān)性分析，若量參數(shù)相關(guān)性較高（|R|2〇.75)，表明二者所反映的信息重疊性較大，選擇其中之一參數(shù)用于構(gòu)建M-IBI評(píng)價(jià)體系。M13和M25具有顯著相關(guān)(P<0.05)，但是r=0.67<0.75，所以這4個(gè)參數(shù)都將用于M-IBI評(píng)價(jià)體系標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)值的計(jì)算(見表5)。[0022]表54個(gè)生物指數(shù)Pearson相關(guān)性分析(*代表顯著相關(guān)）采用比值法計(jì)算各樣點(diǎn)各生物參數(shù)分值，累加各個(gè)參數(shù)分值得到各樣點(diǎn)的M-IBI指數(shù)值。具體步驟:①對(duì)于隨干擾增大而數(shù)值越低的生物參數(shù)，以95%分位數(shù)為最佳期望值，參數(shù)分值為:該生物參數(shù)值/95%分位數(shù);②對(duì)于隨干擾增大而數(shù)值越低的生物參數(shù)，以5%分位數(shù)為最佳期望值，參數(shù)分值為：（最大參數(shù)值一該生物參數(shù)值)/(最大參數(shù)值一5%分位數(shù)）。經(jīng)計(jì)算后，得到的分值的分布范圍為〇~1，如果>1，則都記為1。計(jì)算各樣點(diǎn)的M-IBI值，所用的比值法的計(jì)算公式見表6。[0023]表6比值法計(jì)算4個(gè)生物參數(shù)值的公式最后，以參照點(diǎn)M-IBI值分布的95%分位數(shù)(3.25)作為健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最佳值，低于該值的分布范圍進(jìn)行5等分，靠近95%分位數(shù)的一等分代表被測(cè)樣點(diǎn)處于健康狀態(tài)，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標(biāo)準(zhǔn)(見表7)。最終確定的M-IBI的評(píng)價(jià)等級(jí)為:2.6<M-IBI<3.25為健康，1·95<Μ-ΙΒΙ<2.6為亞健康，1·3<Μ-ΙΒΙ<1.95為一般，0·65<Μ-ΙΒΙ<1.3為較差，M-IBI<為極差。將地下水各樣點(diǎn)計(jì)算的Μ-皿指數(shù)值對(duì)照構(gòu)建的健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)各樣點(diǎn)生態(tài)系統(tǒng)健康狀況。在尾礦庫(kù)周邊地下水的樣點(diǎn)中，4個(gè)樣點(diǎn)是健康狀況，占總樣點(diǎn)的33.3%;2個(gè)樣點(diǎn)是亞健康狀況，占總樣點(diǎn)的16.7%;5個(gè)樣點(diǎn)是一般狀況，占41.7%;1個(gè)樣點(diǎn)是較差狀況，占8.3%(見表8)。受損點(diǎn)靠近尾礦庫(kù)污染源，受人類活動(dòng)干擾比較大，健康狀況比較差，處于亞健康、一般或者更低(較差）的水平;參照點(diǎn)(G10、G11和G12)遠(yuǎn)離尾礦庫(kù)，受周圍人類活動(dòng)干擾較小，該區(qū)域的地下水生態(tài)系統(tǒng)受到破壞較小，處于健康水平。綜上所述，微生物生物完整性指數(shù)(M-IBI)可以很好的適用于地下水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況的評(píng)價(jià)。[0025]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法，利用地下水微生物完整性指數(shù)作為判斷指標(biāo)，其特征在于，包括以下步驟：A、微生物群落豐富度指數(shù)計(jì)算：收集地下水樣品中的微生物細(xì)胞，提取微生物基因組DNA，以DNA為模板，針對(duì)16SrRNA的V4-V5可變區(qū)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增;檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物，切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序;過濾掉低質(zhì)量序列并挑選代表性序列進(jìn)行聚類與注釋，隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選出相同數(shù)目的序列，進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算微生物群落豐富度指數(shù)；B、候選生物參數(shù)確定：設(shè)定參照點(diǎn)與受損點(diǎn)，選取與步驟A)中豐富度相關(guān)、群落組成相關(guān)和對(duì)干擾耐受能力相關(guān)的參數(shù)作為計(jì)算生物完整性指數(shù)的候選參數(shù)，計(jì)算干擾耐受參數(shù)與棲境參數(shù)的最適值，確定關(guān)鍵環(huán)境因子的敏感和耐受微生物分類單元；C、確定微生物完整性指數(shù)值：對(duì)步驟B)中確定的候選生物參數(shù)進(jìn)行指數(shù)值分布范圍分析和判別能力分析，篩選生物參數(shù)，采用比值法計(jì)算各樣點(diǎn)中篩選到的各生物參數(shù)分值，累加各參數(shù)分值得到各樣點(diǎn)的生物完整性指數(shù)值；D、生態(tài)系統(tǒng)的健康檢測(cè)：以步驟C)中參照點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值分布的95%分位數(shù)作為健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最佳值，低于該值的分布范圍進(jìn)行5等分，靠近95%分位數(shù)的一等分代表被測(cè)樣點(diǎn)處于健康狀態(tài)，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標(biāo)準(zhǔn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法，其特征在于，步驟A中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物，在測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序;測(cè)序得到的序列reads，采用生物信息學(xué)軟件過濾掉低質(zhì)量序列，生成OTUtable，挑選代表性序列并進(jìn)行OTUs的聚類與注釋，隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選出相同數(shù)目的0TU序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算微生物群落豐富度指數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法，其特征在于，步驟B)中通過以下公式計(jì)算干擾耐受參數(shù)與棲境參數(shù)的最適值：Uk=ZVixiyki/Zmi=iyki式中，xi表不樣點(diǎn)環(huán)境變量值;yki表不屬種k在i號(hào)樣品中的相對(duì)豐度;Uk表不屬種k的最適值。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地下水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)方法，其特征在于，步驟D)中：地下水樣點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值<〇.65，地下水生態(tài)系統(tǒng)為極差狀況，水體生態(tài)系統(tǒng)健康為V類水平；0.65<微生物完整性指數(shù)值<1.30,地下水生態(tài)系統(tǒng)為較差狀況，水體生態(tài)系統(tǒng)健康為IV類水平；1.30<微生物完整性指數(shù)值<1.95,地下水生態(tài)系統(tǒng)為一般狀況，水體生態(tài)系統(tǒng)健康為m類水平；1.95<微生物完整性指數(shù)值<2.60,地下水生態(tài)系統(tǒng)為亞健康狀況，水體生態(tài)系統(tǒng)健康為Π類水平；2.60<微生物完整性指數(shù)值<3.25，地下水生態(tài)系統(tǒng)為健康狀況，水體生態(tài)系統(tǒng)健康為I類水平。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地下水水質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)的健康檢測(cè)方法，其特征在于，具體包括以下步驟：1)將待檢樣品的微生物細(xì)胞進(jìn)行收集，提取微生物基因組DNA，以DNA為模板，針對(duì)16SrRNA的V4-V5可變區(qū)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割目的條帶進(jìn)行純化，定量所得PCR產(chǎn)物，在測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序；3)測(cè)序得到的序列reads，采用生物信息學(xué)軟件過濾掉低質(zhì)量序列，生成OTUtable，挑選代表性序列并進(jìn)行OTUs的聚類與注釋;隨機(jī)從每個(gè)樣品中挑選出相同數(shù)目的OTU序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行稀有化分析并計(jì)算微生物群落豐富度指數(shù)；4)候選生物參數(shù)確定:設(shè)定參照點(diǎn)與受損點(diǎn)，選取與豐富度相關(guān)的參數(shù)、與群落組成相關(guān)的參數(shù)和與對(duì)干擾耐受能力有限的參數(shù)作為計(jì)算生物完整性指數(shù)的候選參數(shù);采用典范對(duì)應(yīng)分析和加權(quán)平均回歸的方法計(jì)算干擾耐受參數(shù)與棲境參數(shù)的最適值，確定關(guān)鍵環(huán)境因子的敏感和耐受微生物分類單元；5)對(duì)4)確定的候選生物參數(shù)進(jìn)行指數(shù)值分布范圍分析和判別能力分析，篩選生物參數(shù)，并對(duì)篩選的生物參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析；6)采用比值法計(jì)算各樣點(diǎn)中由5)篩選到的各生物參數(shù)分值，累加各參數(shù)分值得到各樣點(diǎn)的微生物完整性指數(shù)值；7)以參照點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值分布的95%分位數(shù)作為健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的最佳值，低于該值的分布范圍進(jìn)行5等分，靠近95%分位數(shù)的一等分代表被測(cè)樣點(diǎn)處于健康狀態(tài)，隨后依次是亞健康、一般、較差和極差的劃分標(biāo)準(zhǔn)；8)將6)計(jì)算得到的各樣點(diǎn)微生物完整性指數(shù)值指數(shù)值參照7)建立的健康評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)各樣點(diǎn)生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況?！疚臋n編號(hào)】G06F19/00GK105868545SQ201610179071【公開日】2016年8月17日【申請(qǐng)日】2016年3月28日【發(fā)明人】蔡超,安新麗,張又弛,朱永官【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所