c-Kit作為藥物成癮治療靶點(diǎn)的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了c?Kit的新用途。本發(fā)明提供了c?Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療藥物成癮的藥物中的應(yīng)用以及在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的成癮心理渴求和興奮性的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用經(jīng)典評(píng)價(jià)成癮的大鼠敏化和條件位置偏愛動(dòng)物模型,分別觀察c?Kit的抑制劑伊馬替尼對(duì)大鼠的敏化行為表達(dá)和條件位置偏愛形成戒斷后復(fù)燃行為的影響,評(píng)價(jià)伊馬替尼對(duì)嗎啡成癮的抑制作用及嗎啡成癮戒斷后的防復(fù)吸效果,確定其作用靶點(diǎn)c?Kit受體在作為藥物成癮的戒毒治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明效果好,有望從根本上治療藥物成癮。
【專利說明】
c-K i t作為藥物成癮治療靶點(diǎn)的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療藥物成癮藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物濫用(drug abuse)或成癮(drug addict1n)已成為世界性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問題,毒品不僅會(huì)嚴(yán)重危害人類健康,還帶來了一系列經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和政治問題。根據(jù)聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室2013世界毒品報(bào)告,2011年國際藥物濫用人口占全球成年人總數(shù)的
0.3%?0.9%,而我國登記在冊的吸毒人數(shù)為247.5萬。近年來,外源性阿片類物質(zhì)(如嗎啡、海洛因)濫用已成為日益嚴(yán)重的社會(huì)問題。它不僅嚴(yán)重摧殘濫用者本人的身心健康,同時(shí)也給家庭、社會(huì)帶來災(zāi)難性后果。因?yàn)榘⑵愇镔|(zhì)一旦濫用成癮,戒斷極其困難。且據(jù)統(tǒng)計(jì),我國藥物濫用的復(fù)吸率高達(dá)95%以上。
[0003]藥物成癮是一種以失去控制能力和強(qiáng)迫性用藥為主要特征的慢性復(fù)發(fā)性腦疾病,其形成機(jī)制尚不明確(Nestler,2004)。目前,對(duì)吸毒者進(jìn)行戒毒治療主要包括自然戒斷法、替代療法(nicotine replacement therapy,NRT)和對(duì)癥治療。各種療法均能取得一定的效果,但對(duì)成癮的心理渴求的治療效果不佳。成癮機(jī)制的不明,戒毒的有效靶標(biāo)有限,尋求戒毒新靶點(diǎn)對(duì)于藥物成癮心理渴求的治療迫在眉睫。
[0004]c-Kit基因位于人染色體4ql2_13,屬于原癌基因,其產(chǎn)物是ΙΠ型酪氨酸激酶。C-Kit作為酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一,其與干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合作為重要的受體配基復(fù)合物通過激活下游信號(hào)分子復(fù)合物,產(chǎn)生強(qiáng)大的連鎖反應(yīng),從而在細(xì)胞分化增殖等調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。迄今為止,二聚化結(jié)構(gòu)及磷脂酰肌醇3’-激酶(PI3K)、JAK-STAT等十幾條激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路被陸續(xù)證實(shí)與c-kit的活化密切相關(guān),而針對(duì)抑制c-Kit活化設(shè)計(jì)的革E向藥物也陸續(xù)投入應(yīng)用,與特異性的單克隆抗體一起在臨床相關(guān)腫瘤的診斷及治療等方面起到了關(guān)鍵性的作用。c-Kit在70%小細(xì)胞肺癌和GIST患者體內(nèi)表達(dá)。至今為止,c-Kit是否在成癮中起著重要作用以及是否可以作為戒毒藥物作用的靶標(biāo)未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療藥物成癮的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的成癮心理渴求和興奮性的藥物中的應(yīng)用。
[0007]伊馬替尼(imatinib)是酪氨酸激酶抑制劑,該藥由瑞典諾華(Novartis)公司開發(fā),對(duì)c-Kit具有抑制作用,本發(fā)明經(jīng)灌胃給予實(shí)驗(yàn)大鼠伊馬替尼(0,100mg/kg)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)核團(tuán)定位給予后,皮下注射10mg/kg嗎啡,采用經(jīng)典評(píng)價(jià)成癮的大鼠敏化和條件位置偏愛動(dòng)物模型,分別觀察伊馬替尼對(duì)大鼠的敏化行為表達(dá)和條件位置偏愛形成戒斷后復(fù)燃行為的影響,評(píng)價(jià)伊馬替尼對(duì)嗎啡成癮的抑制作用及嗎啡成癮戒斷后的防復(fù)吸效果;通過western-blot確定其作用革E點(diǎn)c-Kit在伊馬替尼中樞神經(jīng)系統(tǒng)核團(tuán)定位給予后的活性變化,觀察C-Kit作為戒毒治療靶點(diǎn)的可能性。
[0008]結(jié)果可見:伊馬替尼可抑制大鼠嗎啡敏化的形成,定位注射伊馬替尼于獎(jiǎng)賞相關(guān)腦區(qū)伏隔核的核部抑制C-Kit的活性,可減弱嗎啡成癮大鼠的心理渴求。以上結(jié)果表明:C-Kit在藥物成癮中起著重要作用,針對(duì)其設(shè)計(jì)藥物有望戒除毒癮。
[0009]本發(fā)明所述的成癮藥物是指麻醉藥品和精神藥物等。其中麻醉藥品又分為阿片類、可卡因類、大麻類,阿片類包含天然來源的阿片及從中提取的有效成分如嗎啡,以及將有效成分加工得到的產(chǎn)品如海洛因,類似阿片作用的人工合成品如美沙酮等。精神藥物分為鎮(zhèn)靜催眠藥及抗焦慮藥、中樞興奮劑、致幻劑等。還包括酒精、煙草和揮發(fā)性有機(jī)溶劑等。
[0010]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn):(I)本發(fā)明為治療藥物成癮心理渴求提供了一種有效治療的靶點(diǎn);(2)本發(fā)明對(duì)心理渴求和藥物所致的興奮性均有效,治療效果好,有望從根本上治療物質(zhì)成癮及防止停藥后的復(fù)吸。
【附圖說明】
[0011]圖1為自發(fā)活動(dòng)箱裝置圖;
[0012]圖2為伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡敏化形成的影響;
[0013]A為給藥實(shí)驗(yàn)流程圖;B為伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡敏化形成的影響
[0014]圖3為條件位置偏愛裝置圖;
[0015]圖4為伏隔核的核部定位給予伊馬替尼抑制嗎啡成癮大鼠的心理渴求;
[0016]A為伏隔核定位給藥的時(shí)間流程圖;B為伏隔核的核部定位給予伊馬替尼對(duì)嗎啡成癮大鼠的心理渴求的抑制作用;C為伏隔核的核部定位給予伊馬替尼對(duì)c-Kit活性的抑制作用
【具體實(shí)施方式】
[0017]通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明,而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]【實(shí)施例1】伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡敏化表達(dá)的影響
[0019]本實(shí)施例選擇伊馬替尼作為抗嗎啡成癮高發(fā)性活動(dòng)的藥物,通過建立嗎啡敏化大鼠模型,探討C-Kit抑制劑伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡所致的高發(fā)性自發(fā)活動(dòng)的改善作用,旨在選擇療效確切,毒性小的抗精神活性物質(zhì)所致高發(fā)性自發(fā)活動(dòng)的藥物作用靶標(biāo)。
[0020]材料與方法
[0021 ] 藥品及試劑Morphine(青海制藥廠);伊馬替尼(Novartis PharmaStein AG);
[0022]動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠,體重220_250g。湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為N0.42000600012344,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2015_2018。鼠飼料,購于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0023]實(shí)驗(yàn)方法
[0024]動(dòng)物分組與處理:大鼠隨機(jī)分為四組,分別為生理鹽水+溶劑組、生理鹽水+伊馬替尼給藥組和嗎啡+溶劑組、嗎啡+伊馬替尼給藥組。均在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng),溫度為23 ± 2°C,濕度為50 土 5 %,光照時(shí)間為6:00-18:00,采用12小時(shí)明暗交替,并確保大鼠在飼養(yǎng)時(shí)能夠自由獲取食物與飲用水,實(shí)驗(yàn)前均提供一周時(shí)間環(huán)境適應(yīng)。
[0025]動(dòng)物造模:動(dòng)物造模:實(shí)驗(yàn)前一天(第O天),對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行活動(dòng)量基線測定,根據(jù)測定結(jié)果隨機(jī)分為4組(η= 10);實(shí)驗(yàn)第I?5天,生理鹽水+溶劑對(duì)照組和生理鹽水-伊馬替尼給藥組均皮下注射生理鹽水(lml/kg),嗎啡+溶劑對(duì)照組和嗎啡-伊馬替尼給藥組均皮下注射嗎啡(10mg/kg),給藥完后,所有的動(dòng)物記錄自發(fā)活動(dòng)60分鐘。如此實(shí)驗(yàn)重復(fù)5天。然后戒斷5天,于實(shí)驗(yàn)第10天,生理鹽水+溶劑對(duì)照組和嗎啡+溶劑對(duì)照組提前45分鐘灌胃生理鹽水(2ml/kg),而生理鹽水-伊馬替尼給藥組和嗎啡+伊馬替尼給藥組提前45分鐘灌胃伊馬替尼(100mg/kg),給藥后,以小劑量嗎啡(5mg/kg)皮下注射激發(fā),檢測其自發(fā)活動(dòng)行為60分鐘,觀察自發(fā)活動(dòng)行為的變化,如圖2A所示。
[0026]檢測指標(biāo):
[0027]各組大鼠注射嗎啡后放入自發(fā)活動(dòng)檢測箱(如圖1)記錄自發(fā)活動(dòng)I小時(shí),敏化形成后,自發(fā)活動(dòng)采用DigBehv自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制),是由4個(gè)自發(fā)活動(dòng)觀察箱、視頻合成器、視頻圖樣采樣卡和分析軟件等組成。本系統(tǒng)能對(duì)大鼠活動(dòng)進(jìn)行視頻跟蹤,自動(dòng)記錄小鼠活動(dòng)軌跡,記錄大鼠的活動(dòng)次數(shù)。自發(fā)活動(dòng)評(píng)價(jià)的指標(biāo)是:大鼠一定時(shí)間段內(nèi)(如60min)的活動(dòng)總次數(shù),即總次數(shù)增多顯示自發(fā)活動(dòng)增加。
[0028]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0029]結(jié)果可見,大鼠經(jīng)過5天嗎啡連續(xù)給藥后,發(fā)現(xiàn)分組給予伊馬替尼與生理鹽水干預(yù)的大鼠的自發(fā)性行為具有顯著性差異,即系統(tǒng)給予伊馬替尼對(duì)正常動(dòng)物的自主行為是沒有明顯影響的,可排除伊馬替尼自身的藥物作用。皮下注射嗎啡的實(shí)驗(yàn)組,系統(tǒng)給予空白溶劑,與生理鹽水對(duì)照組比較,可觀測到SD大鼠自發(fā)性行為明顯增多,興奮性增高,敏化作用明顯;系統(tǒng)給予伊馬替尼后,與空白溶劑的嗎啡組比較發(fā)現(xiàn)敏化表達(dá)收到明顯抑制。如附圖2B所示(*表示差異有顯著性)。
[0030]【實(shí)施例2】伏隔核的核部定位給予伊馬替尼抑制大鼠嗎啡成癮心里渴求
[0031]由實(shí)施例1的結(jié)果可知伊馬替尼可以作為抗嗎啡成癮的藥物,而其又是c-Kit的抑制劑,通過建立嗎啡條件位置偏愛(condit1ned place preference,CPP)模型,研究伊馬替尼定位微注射入伏隔核的核部對(duì)嗎啡依賴戒斷后心理渴求的影響,同時(shí)觀察在成癮性藥物作用相關(guān)腦區(qū)有大量表達(dá)(Katafuchi,2000)的C-Kit的活性變化。旨在確定其作為藥物靶標(biāo)在篩選一種療效確切、毒性小的藥物成癮治療藥物中發(fā)揮的作用。
[0032]材料與方法
[0033]藥品及試劑Morphine(青海制藥廠);伊馬替尼(Novartis PharmaStein AG)
[0034]動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠,體重220_250g。湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為N0.42000600012016,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-2018。鼠飼料,購于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0035]實(shí)驗(yàn)儀器
[0036]條件位置偏愛儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制):實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。裝置由三箱構(gòu)成的條件性位置偏愛箱:兩個(gè)側(cè)室和一個(gè)中間室(如圖3)。三室由可移動(dòng)的隔板分開,內(nèi)外均為黑色。其中A箱和B箱位于中間箱的兩側(cè),大小相同,A箱側(cè)壁上有9盞發(fā)黃光二極管構(gòu)成的正方形,底板為不銹鋼鋼條,B箱底板為不銹鋼網(wǎng)格。大鼠在各箱停留時(shí)間和出入次數(shù)可通過數(shù)據(jù)傳送到計(jì)算機(jī),自動(dòng)收集記錄行為學(xué)資料。
[0037]實(shí)驗(yàn)方法
[0038]大鼠伏隔核的核部行定位手術(shù),一星期后進(jìn)行生理鹽水或嗎啡CPP訓(xùn)練,如圖4A所不O
[0039](I)嗎啡CPP模型的建立
[0040]基礎(chǔ)值測試:
[0041]第I天,開放三箱間通道,啟動(dòng)計(jì)算機(jī)上CPP程序,大鼠由中間室放入,任其在三箱中自由活動(dòng)15分鐘,電腦同步記錄其在各室中停留的時(shí)間。
[0042]條件性位置偏愛訓(xùn)練:
[0043]第2至9天,封閉三箱間通道。第2、4、6、8天,實(shí)驗(yàn)組皮下注射嗎啡(10mg/kg)并放入伴藥側(cè)45分鐘;對(duì)照組皮下注射生理鹽水(lml/kg)并放入非伴藥側(cè)45分鐘。第3、5、7、9天,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠均注射生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組放入非伴藥側(cè),對(duì)照組放入伴藥側(cè),均為45分鐘。每只大鼠的伴藥側(cè)是固定的。每組大鼠之后被放回飼養(yǎng)籠。
[0044]嗎啡CPP測試:
[0045]第10天進(jìn)行CPP測試,與基礎(chǔ)值測試階段相似。開放三箱間通道,不予任何注射,啟動(dòng)計(jì)算機(jī)上CPP程序,大鼠由中間室放入,任其在三箱中自由活動(dòng)15分鐘,電腦同步記錄其在各室中停留的時(shí)間。偏愛分?jǐn)?shù)(CPP score)被定義為伴藥室所呆時(shí)間與非伴藥室所呆時(shí)間的差值。將大鼠在伴藥箱中CPP后測值與前側(cè)值比較確定大鼠是否形成CPP。并根據(jù)CPP后測值剔除未形成CPP的大鼠,將動(dòng)物進(jìn)行匹配分組。
[0046](2)環(huán)境線索誘發(fā)覓藥行為模型的建立
[0047]在實(shí)驗(yàn)的第11天,大鼠提前15分鐘微量注射伊馬替尼(4yg/0.5yl)和生理鹽水(0.5μ1)于伏隔核的核部,然后暴露于給藥箱,停留10分鐘,一部分大鼠再回到籠養(yǎng)環(huán)境中,用于24小時(shí)后和一周后條件位置偏愛行為學(xué)的測試;另一部分大鼠于60分鐘后斷頭取腦,采用western-blot的方法,檢測伏隔核的核部c-kit活性的變化與條件位置偏愛行為學(xué)變化的關(guān)系。
[0048](3)嗎啡CPP重新測試
[0049]伊馬替尼給藥后第I天和第7天,即第12和18天,測試大鼠對(duì)伴藥箱的偏愛程度,15分鐘,與基礎(chǔ)值測試階段相似。中間第13天到第17天,對(duì)大鼠不做任何處理。
[0050](4)嗎啡CPP的點(diǎn)燃
[0051]第14天檢測后24小時(shí),即第15天,利用小劑量嗎啡(3ml/kg)進(jìn)行點(diǎn)燃。嗎啡注射后10分鐘,將大鼠放入中間箱開始15分鐘的CPP值測試。
[0052]檢測指標(biāo):
[0053]大鼠訓(xùn)練后,采用條件位置偏愛箱檢測嗎啡成癮情況,條件位置偏愛評(píng)分(CPPScore)即反應(yīng)大鼠成癮行為的形成情況,CPP Score增高且有顯著性差異,成癮行為形成。伏隔核的核部微注射伊馬替尼再暴露后60min,檢測c-kit的活性,并于24小時(shí)和7天后檢測條件位置偏愛評(píng)分的變化。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055]結(jié)果見圖4B,給藥組與對(duì)照組相比差異具有顯著性。伏隔核的核部微注射伊馬替尼后,條件位置偏愛減弱,且2周后不被點(diǎn)燃;未給藥的大鼠,條件位置偏愛依然存在。采用western-blot方法檢測到伏隔核的核部給予伊馬替尼后c-kit的磷酸化活性明顯降低(圖4C)。說明微注射伊馬替尼于伏隔核的核部,通過抑制c-kit活化阻斷給藥環(huán)境引起的心理渴求,可改善嗎啡成癮癥狀。
[0056]實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0057]總之,伊馬替尼系統(tǒng)給藥可以抑制嗎啡引起的敏化活動(dòng)的形成,微注射C-Kit抑制劑于伏隔核的核部可抑制嗎啡成癮后心理渴求的形成,說明C-Kit信號(hào)分子在嗎啡所致的成癮行為中起著關(guān)鍵的作用,針對(duì)其設(shè)計(jì)藥物抑制其活性可達(dá)到戒毒的效果,是用于戒毒藥物研發(fā)的有效作用靶標(biāo)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的藥物中的應(yīng)用。2.c-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的成癮心理渴求和興奮性的藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的成癮藥物是指(I)麻醉藥品,其中麻醉藥品又分為阿片類、可卡因類、大麻類,阿片類包含天然來源的阿片及從中提取的有效成分嗎啡,以及將有效成分加工得到的產(chǎn)品海洛因,類似阿片作用的人工合成品;(2)精神藥物,精神藥物分為鎮(zhèn)靜催眠藥及抗焦慮藥巴比妥類、中樞興奮劑苯丙胺類、致幻劑麥角二乙胺;(3)酒精、煙草和揮發(fā)性有機(jī)溶劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105974131SQ201610435065
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】李艷琴, 楊奇, 陳萍萍
【申請人】武漢大學(xué)