專利名稱：一種耐貯藏的微粒,特別是一種用于載體結(jié)合反應(yīng)的載體及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是一種耐貯藏的微粒，特別是一種用于載體結(jié)合反應(yīng)、檢測和(或)分離方法的微粒載體，生產(chǎn)這種耐貯藏微粒的方法，及本發(fā)明的微粒的用途。
由固體核芯和多聚物組成的微粒載體已為人知，且已應(yīng)用于多種目的。尤其是，這種微粒已用作免疫測定標(biāo)志，用多聚物，如生物多聚物，將固體核與親和成分相結(jié)合。多種微粒物質(zhì)已得到使用特別是金屬微粒溶膠，如有色金屬微?；虼判晕⒘＃环墙饘傥⒘?，如硒、煤粉、SiO2或陶瓷微粒；血球，甚至還有帶著另一種具有不同(結(jié)合)特性的多聚物的乳膠微粒。
因此，US 4,230,685描述了特異性粘合劑與磁性微粒結(jié)合的改進(jìn)按此，用丙烯酸酯聚合物(Acrylatpolymer)或多糖涂蓋在微粒上，用戊二醛將蛋白A結(jié)合在此涂層上。
US 4,452,773描述了磁性-葡聚糖微粒的生產(chǎn)。這類微粒的大小為100-700，尤其是300-400。有大量的微粒是膠態(tài)的，有鐵磁性，帶有葡聚糖的外殼。得到的微粒用高碘酸鹽氧化使之功能化。
EP-B-452,342是關(guān)于涂有多糖、具有膠體大小的超順磁微粒。這種微?？膳c附加的基團(tuán)相結(jié)合。將微粒混合物分選成具有一致磁化水平的一定大小的組分，該組分展現(xiàn)了在磁場中阻滯性(Retardierung)的均一。敘述了按照大小來分離的可能性。優(yōu)選用多糖或蛋白質(zhì)涂蓋。多糖用高碘酸鹽氧化而功能化。此外，可能用溴化氰進(jìn)行功能化。蛋白外殼與微粒分子的結(jié)合可能由側(cè)鏈氨基或硫氫基完成。
DE-A-4037,724是關(guān)于使用直接或間接的標(biāo)志物進(jìn)行免疫測定的設(shè)計(jì)。優(yōu)選采用直接標(biāo)志物因?yàn)樗鼈儾恍枰硗獾牟襟E來使測試結(jié)果可視化。直接標(biāo)志物的例子如金屬溶膠，染料溶膠，乳膠微粒、顏色指示劑、脂質(zhì)體上的色料及非金屬溶膠如碳溶膠。DE-A-4037724的另一方面是關(guān)于一種免疫化學(xué)活性標(biāo)志物。煤粉顆粒與一個配基或配基共軛物吸附結(jié)合。檢測的靈敏度，以人絨毛膜促性腺激素hCG為例為25mIU/ml(IU＝國際單位)。
EP-A-0,410,893描述一種在生物液體中測定和識別針對特異抗原的抗體的方法。列出的不溶性載體微粒包括細(xì)胞、凝膠微粒、微膠囊、有機(jī)多聚物、無機(jī)細(xì)微粒、或用牛血清白蛋白或膽固醇精細(xì)分散的金屬或金屬化合物的膠體微粒。
EP-A-0,032,270描述用一種或幾種標(biāo)志化合物定量地或定性地測定一種免疫成分的方法將這些分成直接地或間接地與在親水染料或色素的水性分散體系中的微?；蛘咄可w有這類染料或色素的多聚物核相結(jié)合。
EP-0,321,008是關(guān)于藉特異結(jié)合蛋白與樣品中相應(yīng)的可結(jié)合物質(zhì)間的反應(yīng)，測定一種或幾種成分的方法。這種成分與至少一個的標(biāo)志成分間的相互反應(yīng)活性，是靠直接或間接地耦聯(lián)或吸附標(biāo)志溶膠微粒而得到的。優(yōu)選的溶膠微粒為磷、碳和/或硅。將這種微粒表面用含極性基團(tuán)的大分子包裹可以防止凝集和聚集，這種大分子可以是蛋白、聚乙二醇、多聚糖、聚乙烯醇及其它。適宜的保護(hù)蛋白有抗原、抗體和抗-抗體。免疫化學(xué)惰性物質(zhì)如白蛋白、聚乙二醇或其它極性大分子也可使用。檢測的靈敏度，以免疫球蛋白G為例，為1.5ng絕對量。
EP-0,298,368是關(guān)于使用含膠體鐵金屬的微粒進(jìn)行診斷性免疫測定的一種方法。這種微粒帶有一種結(jié)合物能特異地識別待測物質(zhì)，檢測hCG的靈敏度在mIU/ml范圍。
EP-A-0,280,560公開了共價結(jié)合于核/外殼多聚物微粒的鏈球菌A抗原抗體。微粒外殼是由聚(mp-氯甲基苯乙烯)構(gòu)成的，核芯則是聚(苯乙烯-CO-2-acetoacetoxidethyl methylacrylate)構(gòu)成的，核內(nèi)含有油紅EGN，以得到一種凝聚試劑。
US 4,452,886描述賴氨酸與戊二醛及剛果紅聚合成顏色微粒。對hCG的測試靈敏度在1000 IU/ml的范圍。
Collins WP在他的“任選的免疫測定”一書(John Wiley & Sons，Chichester，紐約，等)的“分散染料免疫測定(DIA)”一章的48-49頁中描述了微粒標(biāo)志物的優(yōu)點(diǎn)，并指出基本參數(shù)的意義，如微粒大小，分布與形式，有機(jī)溶劑中的溶解度，膠體穩(wěn)定性及結(jié)合容量，譬如，對抗體的結(jié)合。他提及的測試的靈敏度在mIU/ml范圍。結(jié)合物如以凍干狀態(tài)貯存在-20℃或4℃，其穩(wěn)定性至少為15個月，水性結(jié)合物應(yīng)在制備后6天內(nèi)用掉。
JP-A-0686,777是關(guān)于用膠囊包起來的調(diào)色劑及其生產(chǎn)。
本領(lǐng)域所描述的惰性核芯有著明顯的缺點(diǎn)。在核芯發(fā)生聚合時，所期望的核芯特性受損太多。當(dāng)聚合物吸附在核芯上并隨之結(jié)合共價的或其它結(jié)合方式的親和成分時，核芯的結(jié)合力在多數(shù)情況下太弱，因而不能在較長的時間內(nèi)保證其穩(wěn)定性。此外應(yīng)用本領(lǐng)域所提供的方法只能結(jié)合一種或少數(shù)幾種活性的及親和的成份。
構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)問題在于提供具有特有的有用特性，特別是標(biāo)志特性，穩(wěn)定的微粒。必要時也能將許多種反應(yīng)成份同時穩(wěn)定地結(jié)合在上面。穩(wěn)定性應(yīng)當(dāng)特別也包括長期貯藏。
本發(fā)明提供一種耐貯藏的微粒，特別是一種具有權(quán)利要求1的特征的微粒載體用于解決構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問題。從屬的權(quán)利要求2-18是關(guān)于本發(fā)明微粒的優(yōu)選實(shí)施方案。權(quán)利要求19與相應(yīng)的從屬權(quán)利要求20和22是關(guān)于本發(fā)明的耐貯藏微粒的生產(chǎn)方法。權(quán)利要求23-31是關(guān)于本發(fā)明微粒的用途。
本發(fā)明的耐貯藏的微粒被特別指明用于載體結(jié)合反應(yīng)、檢測和(或)分離方法。它由至少一個第一成分和一個第二成分組成。這種微粒很適于裝上一個活性成分，特別是特異的活性成分。第二成分是一種可交聯(lián)的聚合物，它在一定程度上形成一層外殼并(或)將第一成分作為核心，至少部分地，包被和/或包圍起來。
第一成分具有至少一個可確定的特性。在第二成分上可安置一些活性成分。耐貯藏微粒的特性取決于它的制造方法，它可用可交聯(lián)聚合物與第一成分反應(yīng)而得到，然后形成的產(chǎn)物和交聯(lián)劑反應(yīng)，從而使第一成分被安置在耐貯藏的第二成分之內(nèi)。第一成分耐貯藏地裝備于第二成分的特征意味著，甚至貯藏期間，在可能的不利的條件下，第一成分仍然保持在外殼內(nèi)。這意味著在本發(fā)明相關(guān)的方法的、以第一成分為熒光染料為特征的實(shí)施方案中，染料基本上定量地存在于由第二成分組分構(gòu)成的外殼內(nèi)。因而阻止了染料的流失。這意味著，由第二成分構(gòu)成的外殼，將置入其中的第一成分緊密包圍。本發(fā)明遵循的、使第一成分耐貯藏地裝備于第二成分的條件是，例如，通過設(shè)法使交聯(lián)劑以高度過量加入。典型地是，交聯(lián)劑以十倍濃度于第二成分的反應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選的是，交聯(lián)劑中含有的反應(yīng)基團(tuán)是10倍至100倍多于第二成分的相應(yīng)基團(tuán)，這兩種基團(tuán)相互交聯(lián)反應(yīng)。
最好將反應(yīng)條件調(diào)整到使第一成分被第二成分以網(wǎng)狀方式包被和/或包圍。
本發(fā)明的構(gòu)成載體的第二成分優(yōu)選是一種具有活性功能基團(tuán)、或者可活化的功能基團(tuán)的聚合物它能與交聯(lián)劑、或活性成分、或同時與二者起反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明構(gòu)成載體第二成分的聚合物也可從幾種可交聯(lián)的聚合物和/或可交聯(lián)的單體生產(chǎn)出來。因此，聚合物可由蛋白質(zhì)和/或具有功能基團(tuán)的聚酰胺生成。原則上，其它聚合物，諸如生物聚合物或單體也是可能的，只要能夠?qū)崿F(xiàn)交聯(lián)。最好，第二成分可與至少雙功能的化合物交聯(lián)。
優(yōu)選采用能吸附性地穩(wěn)定成分1水懸液的聚合物，特別是極性聚合物。
按本發(fā)明安置在微粒的第二成分上的活性成分是(特別是)一些具有對其它物質(zhì)有親合特性的分子或分子基團(tuán)。這特別包括酶以及與酶起作用的底物。這樣，底物或酶可以作為活性成分安置在第二成分上?？贵w/抗原，生物素/鏈親和素有相似的作用。作為特異活性成分與染料穩(wěn)定結(jié)合的生物素具有以下優(yōu)點(diǎn)即作為共反應(yīng)物，染料對生物素化的成分或與鏈親和素結(jié)合的成分普遍可用。這些成分可以具有完全不同的功能，如再與另一成分發(fā)生特異反應(yīng)或者起催化劑作用。此外，RNA或DNA類的核酸也可用作本發(fā)明意義上的載體。核酸可以與相應(yīng)的互補(bǔ)鏈、或部分互補(bǔ)鏈按反應(yīng)條件的嚴(yán)緊性雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這樣，就可鑒定一個研究樣品中特異的核酸鏈，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步處理。此外反應(yīng)成分的組合物可以安置在第二成分上。然后，依據(jù)發(fā)明可以得到應(yīng)用于不同問題的載體。
通過選擇交聯(lián)劑及其濃度并調(diào)整特殊的加工條件，可以控制交聯(lián)反應(yīng)，使第二成分多少象網(wǎng)絡(luò)樣包被第一成分，其網(wǎng)眼大小的分布范圍較窄。
同時，利用交聯(lián)的工藝條件，可以調(diào)整在微粒表面上的游離的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。此種微粒因?yàn)橹缓椭辽儆袃蓚€功能團(tuán)的交聯(lián)劑的一個功能團(tuán)結(jié)合，因此其表面對另外的結(jié)合，特別是活性成分的結(jié)合仍保持游離。產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以全部應(yīng)用或在部分飽和后應(yīng)用其確定的部分。
特別是利用加工條件可以調(diào)整外殼的厚度，其均一性還可用分級法提高。一個多步驟的包封方法還可以改進(jìn)第一成分的包含(EinschlaB)。
按本發(fā)明，微粒的第一成分具有至少一個可確定的特性，與之結(jié)合的成分2和(或)活性成分并不具有其有關(guān)的性質(zhì)，諸如吸收或發(fā)射電磁波、質(zhì)量、磁性、介電性、放射性、大小和/或密度。
作為確定的特性，按本發(fā)明作為載體第一成分的核芯當(dāng)然可具有藥理學(xué)-生物學(xué)效應(yīng)和催化效應(yīng)，或者二者的結(jié)合。因此，例如，電磁波的吸收性或發(fā)射性可以由各自的生色團(tuán)或螢光團(tuán)產(chǎn)生。質(zhì)量、大小和密度等特性是物理學(xué)上互相聯(lián)系的，并可用，例如，更高比重的微粒作相應(yīng)的調(diào)節(jié)。大小的特性有利于凝聚，而質(zhì)量特性有利于重量分析。凝聚對在溶液或微乳液中成分的特異性沉淀有利。第一成分可以具有放射性標(biāo)志結(jié)構(gòu)而有放射活性。與之相仿，其它特異的性質(zhì)也可以連接在第一成分上。第一成分可以是一個包含流體的膠囊，也可以是不能完全被包裹的微粒(例如極小的、或者在溶液中不穩(wěn)定的微粒)。
在本發(fā)明載體的有益設(shè)計(jì)中，載體是這樣的第一和第二成分的相互聯(lián)接是可分開的。第一和第二成分間的聯(lián)結(jié)是通過將第一成分包裹在第二成分中而實(shí)現(xiàn)的。在必要時，可通過除去第二成分來暴露第一成分，以便于用測量技術(shù)去檢測與核芯相聯(lián)結(jié)的特性。除去第二成分的方法，例如在蛋白的情況下，可用相應(yīng)的蛋白水解酶。這些酶使外殼降解但保留核芯。后者可以按其待測特性來進(jìn)一步處理。此外，還可用一種優(yōu)先溶解核芯的介質(zhì)使核芯從第一/第二成分的聯(lián)結(jié)中溶解下來，這樣，最后留下“空的”外殼；或用一個總?cè)軇┤ト芙庹麄€微粒。因此，例如，假如一個可溶于乙醇的染料被第二成分包裹，這就可以用溶劑去處理，再用分光法測量所得到的乙醇溶液。如果條件是標(biāo)準(zhǔn)的，而且必要時是刻度的，相應(yīng)的褪色程度可被用作定量測定的量。
除了各個耐貯藏微粒載體外，通過實(shí)施應(yīng)用方法而得到其他表現(xiàn)形式也具有重要意義。耐貯藏微粒載體大多數(shù)呈群體分布形式。為應(yīng)用本發(fā)明的微粒，載體的群體最好具有較窄的大小分布。
特別優(yōu)選的是載體微粒群體具有的外殼大小、核芯大小、以及外殼/核芯大小的分布都在一個窄范圍內(nèi)。對核芯，特別是對整個微粒的其它特性，也希望有一均一分布，如顏色、強(qiáng)度或者可磁化性。
對本發(fā)明微粒作為載體的實(shí)際應(yīng)用中，在第二成分上安置高濃度的活性成分是有益的。由此可以對免疫測定中相應(yīng)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)達(dá)到相當(dāng)高的結(jié)合常數(shù)，盡管個別活性成分和它的相應(yīng)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)可能只具有一個一般的結(jié)合常數(shù)。然而由于存在多個結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合效力(親和力)得到增加。
按本發(fā)明，載體生產(chǎn)方法包括的步驟中，第一成分與可交聯(lián)的聚合物至少反應(yīng)一次。然后，此聚合物可以被物理吸附在第一成分的表面上?？山宦?lián)的聚合物隨著下一步的加工步驟形成第二成分。這是用交聯(lián)劑處理完成的。作為交聯(lián)劑可以有，特別是雙功能分子，諸如戊二醛、二羧酸、丙烯酸鹽、異丁烯酸鹽。然后具有烯基(olefinische)的交聯(lián)劑可通過例如光反應(yīng)或其它自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而活化。功能分子能使聚合物交聯(lián)，特別是經(jīng)過縮合反應(yīng)或加成反應(yīng)。
也可能處理前的第一成分和/或中間產(chǎn)物以及第二成分和/或微粒可以根據(jù)大小和/或其它特性進(jìn)行分離以達(dá)到使大小或其它特性盡可能的均一。最好將第一成分與聚合物處理2-3次，特別優(yōu)選按大小進(jìn)行分離。
此方法特別有利，因?yàn)樗梢跃谝怀煞植⒄{(diào)整其在懸液中起始時的濃度，而與反應(yīng)無關(guān)。根據(jù)所用的第一成分，可以采用使懸液均化和穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。優(yōu)選用第二成分來穩(wěn)定懸液，如果這是一種在第一成分上的有足夠好吸附性的極性化合物。選擇第一和第二成分的濃度比例，使得通過吸附，外殼能達(dá)到合適的厚度。在多步驟方法中優(yōu)選薄的外殼。其它參數(shù)，如時間和溫度同樣可用來影響吸附。此后，中間產(chǎn)物可以再均化。為了使外殼，特別是在靠近第一成分的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)有好的交聯(lián)，交聯(lián)成分以幾個量級的過量加入。此外，交聯(lián)成分的效應(yīng)可受其它參數(shù)影響，特別是接觸時間和由單側(cè)結(jié)合的交聯(lián)分子在表面上形成的活性基團(tuán)的數(shù)量，后者可通過隨后的部分封閉而減少。
本發(fā)明的載體優(yōu)選用于測定技術(shù)，諸如免疫測定，固相測定和/或色譜測定。此外，它們可用作有效物質(zhì)親合性運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)載工具，如果，比方說，藥理學(xué)活性物質(zhì)作為第一成分被包裹在第二成分中。作為親合運(yùn)輸，意味著，例如，可用位于第二成分上的抗體來運(yùn)輸藥理學(xué)活性物質(zhì)，并特異地結(jié)合于一個特殊靶結(jié)構(gòu)。
具有放射性核芯的微粒也可以有益地應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兘逵H合運(yùn)輸在使用局部發(fā)揮作用或濃縮，因此可用低的總放射活度劑量，系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)可保持在窄的限度中。
本發(fā)明的耐貯藏微粒載體用作一個化學(xué)反應(yīng)的催化劑也是有利的。因此，為了將載體結(jié)合的催化劑(生物催化劑)與反應(yīng)混合物迅速混合，可采用一種磁性核芯，藉其重量隨后可進(jìn)行迅速的分離。
本發(fā)明可進(jìn)一步用以下的例子來說明。
例1一種具有高載量鏈親和素(作為對生物素化成分特異反應(yīng)的成分)的蘇丹IV染料微粒的制備。
1.膠溶10.0g蘇丹IV加入100ml含2％BSA(牛血清白蛋白)的PBS緩沖液(磷酸緩沖溶液)(2μm過濾除茵)中，高速攪拌成均一的懸浮液。然后，懸浮液進(jìn)行粗過濾(BioRad濾紙，543型)。
將懸液分配在2個離心管中，在預(yù)冷至4℃的離心機(jī)中離心，1000rpm(轉(zhuǎn)/分)，2000rpm，3000rpm各5分鐘。然后進(jìn)行第2次過濾。
2.交聯(lián)與活化50％戊二醛水溶液50ml，放置到室溫(通風(fēng)櫥內(nèi))，用約11ml的0.3M Na2HPO4緩沖液調(diào)pH值至7.3(用pH計(jì)校驗(yàn))。然后加入25mlPBS緩沖液及5ml以1∶1混合的PBS緩沖液和雙蒸水(在反應(yīng)溶液中有約1.5M的戊二醛或2.8M的醛基，約1.5×10-4M的BSA，按每個BSA具有300氨基酸計(jì)則有約4.5×10-2M活性氨基酸，這樣對于每個氨基，相應(yīng)有60個醛基)。全部溶液(pH 7.3)過濾除菌(0.2μm)。
對每份20ml戊二醛緩沖溶液，在渦流混合下(vortex)各加入20ml膠溶的蘇丹IV懸液(4個平行制備)，室溫下振搖4小時。
在離心管中對40ml活化的懸液各加入2.2ml 2％BSA溶液(0.2μm過濾)，使之穩(wěn)定。然后以2500rpm離心5分鐘，粗濾。
3.柱純化(凝膠過濾)CL 4B Sepharose(Parmacia)柱經(jīng)過再生并在室溫下用PBS緩沖液平衡至少1小時，然后加上圓形濾膜，將上層緩沖液吸走或排出。將160ml穩(wěn)定化了的懸液上柱，柱體加蓋。滲入后(約25分鐘)用PBS緩沖液淋洗柱體邊緣，開泵。
為分部收集，準(zhǔn)備帶刻度的12ml錐形管以收集下列體積1-10號管，及23-30號管，每管4ml；11號及22號管4.5ml；12號及21號管5ml；13號及20號管5.5ml；14-19號管6ml。
當(dāng)紅色溶劑前沾出現(xiàn)在出口處時，收集各部分，凝膠過濾歷時30分。
從收集的各部分各取5μl，用5ml PBS緩沖液稀釋(1∶1000)，渦流混合(Vortex)用肉眼觀看顏色深度。按顏色深度判斷各部分樣品，可得一個顏色最深的寬的中心峰區(qū)域，在它之前或之后的部分色度明顯下降。采用140ml左右的寬峰區(qū)域。將這些部分收集在一起，分配到3個50ml試管中，2500rpm離心5分鐘，然后粗濾。
(必要時，為得到較厚或較牢固的外殼，步驟2及3可重復(fù)一次或數(shù)次。)4.與特異反應(yīng)成分鏈親和素的結(jié)合100mg鏈親和素溶于6ml PBS緩沖液中。為檢查其質(zhì)量，用280nm下的光密度測定蛋白濃度，并與生產(chǎn)廠的說明書比較。將鏈親和素溶液裝入6mm的透析管，在4℃下對1升PBS緩沖液透析過夜。溶液轉(zhuǎn)入試管，用4ml PBS緩沖液再淋洗一下透析袋。再次用OD280鑒定蛋白濃度。將鏈親和素溶液離心，4000rpm 5分鐘，將上清部分再測一次OD280后用于結(jié)合反應(yīng)。
已包被有與活性醛基交聯(lián)的BSA的蘇丹IV染料粗濾液，同時4份，與鏈親和素上清液結(jié)合。方法如下在50ml試管中各加入約3ml鏈親和素溶液(蛋白濃度為11mg/ml)，在渦流混合下加入30ml懸液(即每33ml懸液中含33mg鏈親和素)。溶液在室溫下振搖過夜，次日晨離心2500rpm 5分鐘，然后粗濾。懸液總體積約為130ml。
5.CL-68 Sepharose柱純化及顏色測定按3的方法制備及平衡柱。130ml懸液的滲入約25分鐘，凝膠過濾約30分。分部收集管的準(zhǔn)備同3。各部分或按3的方法稀釋，或只憑肉眼觀察。當(dāng)需要高的顏色質(zhì)量時，將各部分以1∶50稀釋后按DE-A1-19500862例1的適當(dāng)方法進(jìn)行測定。在具有單克隆鼠抗人IgG抗體的凝膠床柱上，加入250μl 1∶5000稀釋的原含84 IU/ml人抗破傷風(fēng)IgG的采集血清(靈敏度1.7 mIU/ml，絕對量約0.4 mIU)，然后加入250μl濃度為5μg/ml的生物素化的破傷風(fēng)類毒素。在加入250μl 1∶50稀釋的結(jié)合鏈親和素的染料懸液后可見到明顯的顏色。具有高吸收的中心收集鈀團(tuán)包含一個約100ml的寬峰區(qū)。在要求較低時左右兩個肩區(qū)約30ml也分別收集。經(jīng)渦流混合(Vortex)及凝膠過濾，兩部分收集物在4℃保存(必要時過夜)，直到完成穩(wěn)定化。
6.穩(wěn)定含20％BSA的PBS緩沖液用0.2μm過濾除菌。取50ml的試管用BSA溶液涮過，加20％BSA溶液22ml，在渦流混合下(Vortex)加入18ml的粗濾懸液。然后，懸液再次進(jìn)行粗濾。
7.貯存用0.09％疊氮鈉穩(wěn)定的懸液在密封的50ml試管內(nèi)，在4℃下，至少能保持12個月的穩(wěn)定，并具有穩(wěn)定的吸收值。
8.特性與平均大小約為50nm的蘇丹IV微粒相比，經(jīng)過一次包被，大小約為51至200nm，二次涂復(fù)后的大小為300-400nm。
例2使用例1的本發(fā)明的耐貯藏的微粒載體物質(zhì)進(jìn)行免疫測定。
對破傷風(fēng)疫苗接種狀態(tài)的半定量和定量測定，即對血中抗破傷風(fēng)IgG濃度的測定。
a)半定量測試為了使半定量測定得到直觀可見的結(jié)果，采用了同時進(jìn)行多個測定具有三個區(qū)域的反應(yīng)柱，按DE-AI-19500862。
反應(yīng)柱的底部反應(yīng)區(qū)(參比區(qū))裝有蛋白G，并結(jié)合有一定量的抗破傷風(fēng)人IgG，相當(dāng)于加樣毛細(xì)管中血量所含的足夠接種量(IU)。為此，將采集的血清作相應(yīng)的稀釋，包括破傷風(fēng)特異免疫球蛋白在內(nèi)的總?cè)薎gG在流動中與此反應(yīng)區(qū)中蛋白G結(jié)合(蛋白G與CNBr活化的瓊脂糖相結(jié)合，見DE-A-19500862，例2)。
中部的陰性對照區(qū)含有CNBr活化的Sepharose 4B，具有共價結(jié)合的BSA。
頂部反應(yīng)區(qū)(測試區(qū))只含結(jié)合有CNBr活化的瓊脂糖的蛋白G。
用毛細(xì)管將一定量的血液加到柱上，用洗滌緩沖液洗后，將250μl的5μg/ml生物素化的破傷風(fēng)類毒素(生物素化水平50)上樣，再洗一次后，將以洗液1∶20稀釋的鏈親和素染料乳液上柱再洗一次。
樣品中的總?cè)薎gG在流動中結(jié)合在測試載體床內(nèi)。在測試區(qū)和參比區(qū)中，前者在流動中，后者原先就結(jié)合了一定量的抗破傷風(fēng)人IgG及相應(yīng)的生物素化破傷風(fēng)毒素。非特異結(jié)合的蛋白被緩沖液洗去。此后，染料乳液在測試區(qū)和參比區(qū)流動時，那里就結(jié)合上了相當(dāng)于破傷風(fēng)類毒素量的鏈親和素染料。此時，非特異結(jié)合的蛋白也被洗液洗去。在陰性對照區(qū)，沒有東西被結(jié)合。
半定量的判定采用肉眼比較顏色。如若測試區(qū)的顏色等于或超過參比區(qū)的顏色，說明接種是充分的。如比它弱，則需要接種；越是緊迫需要接種，則顏色差別越明顯。(按照醫(yī)學(xué)或世界衛(wèi)生組織(WHO)的資料，對參比區(qū)可作細(xì)的刻度，如，尚有二年保護(hù)力，5年保護(hù)力，建議接種，強(qiáng)烈建議接種。另一種方法是以相應(yīng)的標(biāo)志判定在測試區(qū)中顏色滲入的深度。這樣，參比區(qū)可以省去，或用作保護(hù)。)b)定量測試為此目的只需一個測試區(qū)，不過，為了可靠，也可加入陽性和陰性的對照區(qū)。
在此區(qū)中載有鼠抗人IgG，如DEA-19500862例2所示。應(yīng)用順序和反應(yīng)如文獻(xiàn)a)所述。在酒清溶液洗脫后采用520nm或492nm光度吸收進(jìn)行測定。
用酒清洗脫是必要的，因?yàn)槿玖蠘?biāo)志物藉大量的結(jié)合位點(diǎn)與凝膠床附著得非常牢固，它不能象其它標(biāo)志物那樣靠pH變動或被并存的分子取代(即使部分地也不行)，在此情況下只能通過溶解。
對于抗破傷風(fēng)人IgG的兩種測試靈敏度都在mIU/ml范圍。本測試方法在不作最佳化改進(jìn)的情況下，可以定性地(目測)或定量地測定10pg以下量的IgG，如在柱內(nèi)濃集，還可以測得更低(pg/ml范圍)。現(xiàn)行的質(zhì)量控制能保持乳液穩(wěn)定性至少達(dá)12個月。
例3活性染料微粒的合成在20ml濃度為1-50mg/ml溶于pH 6-8.5的0.01-0.2M磷酸緩沖液的BSA溶液中加入0.1至2g碳?；旌衔镉么帕嚢杵骰驕u流混合直至蛋白質(zhì)被充分吸附(膠溶)。將得到的懸液以6000×g離心5至10分。
大小為50-350nm的已吸附BSA的碳顆粒在下一步用戊二醛活化。戊二醛濃度在1-25％范圍內(nèi)，活化時間20至120分。
活化的懸液離心3-4次，用凝膠過濾純化，凝膠材料為6B，4B，2B，CL-6B，CL-4B，CL-2B，Sephacryl S300，或其它凝膠(Toyoperl，Ultragel等)，由此，對球狀蛋白的排阻限度不得低于1×106道爾頓。使用此方法可以得到黑色染料微粒。制備其它染料微粒的方法與此相似，代替碳的是如紅色用蘇丹II，暗紅色用蘇丹III，灰色用蘇丹黑，紫色用四唑二甲紫，暗紫用新四唑二甲，蘭色用四唑二甲蘭。這些結(jié)合物在懸液中的使用濃度約為0.08％，取決于干重。通過與反分析物如蛋白A，鏈親和素或抗體聯(lián)結(jié)生成染料標(biāo)記。
例4用蛋白A碳結(jié)合物在無孔隙固相上，對抗-HIV抗體進(jìn)行血清學(xué)測定。
采用吸附有HIV-1和HIV-2合成肽的聚苯乙烯-酶聯(lián)免疫吸附測定板作為固相。然后加入系列稀釋的兔抗HIV血清。孵育15分經(jīng)一步純化，加入蛋白A-碳結(jié)合物，再經(jīng)一步純化，15分后可讀取反應(yīng)所得的斑點(diǎn)。
與此平行，用購買的蛋白A金膠體(微粒大小40nm)和蛋白A-POD進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。用肉眼觀察作比較，這兩種標(biāo)志物的靈敏度為1/1280稀釋，碳結(jié)合物為1/20480。
例5用碳結(jié)合物以薄層色譜測定HCG一條2×16mm的硝酸纖維素粘合在透明的0.5mm PVC上。纖維素條的一端粘合一片1×1cm的色譜紙作為吸引材料。硝酸纖維素的中央用Hamilton注射器加上抗HCG抗體(1mg/ml磷酸緩沖溶液)。30分鐘后用1％酪蛋白溶液(含吐溫的磷酸緩沖液)封閉(1小時)，然后純化，干燥。
HCG標(biāo)準(zhǔn)物先用磷酸/吐溫緩沖液稀釋一次，然后再用健康人的尿稀釋一次，加吐溫20至0.1。將50μl碳與抗HCG的結(jié)合物加入50μl此標(biāo)準(zhǔn)溶液中。纖維素條的游離端浸入在此溶液中，結(jié)果可用目測，在2至3分鐘后可見一條黑線。50mIU/ml的靈敏度對于一周的妊娠測試是足夠的。
權(quán)利要求
1.包含至少一種第一和至少一種第二成分的耐貯藏微粒，其中，—所述的至少包含有一種可交聯(lián)聚合物的第二成分作為外殼，至少是部分地，包被或包圍作為核芯的第一成分，以及—該第一成分至少有一種可確定的特性，可用以下方法獲得—通過將第一成分與一個可交聯(lián)聚合物反應(yīng)，然后使所形成的產(chǎn)品與一個交聯(lián)劑反應(yīng)，使該第一成分耐貯藏地保持在該第二成分中。
2.權(quán)利要求1的微粒，其特征在于該微粒是一種用于載體結(jié)合反應(yīng)、檢測和/或分離方法的耐貯藏微粒，載體適宜于裝備有至少一種反應(yīng)成分，特別是特異的反應(yīng)成分。
3.權(quán)利要求1和/或2的微粒，其特征在于該第一成分是由第二成分以網(wǎng)狀包被或包圍的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于該第二成分是至少一種聚合物，其具有活性的或者可活化的功能基團(tuán)。
5.權(quán)利要求3的微粒，其特征是至少一種聚合物是由一個或數(shù)個可交聯(lián)聚合物和/或可交聯(lián)單體制備成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于該聚合物是由至少一種聚酰胺，優(yōu)選蛋白質(zhì)，或至少另一種具有功能基團(tuán)的生物聚合物制備的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的微粒，其特征在于該第二成分是至少可與雙功能的化合物交聯(lián)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的微粒，其特征在于，結(jié)合在表面上的雙功能化合物還具有至少一個反應(yīng)基團(tuán)，這些反應(yīng)基團(tuán)可全部或部分地被飽和，及/或可全部或部分地，最好是一個特定部分，用于與反應(yīng)組分或第二成分的另一層共價結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8中至少一項(xiàng)的載體，其特征在于反應(yīng)組分是一個具有對其它物質(zhì)有親合特性的分子或分子基團(tuán)。
10.據(jù)權(quán)利要求7的微粒，其特征在于至少一個反應(yīng)成分是一種酶、與酶起作用的底物、抗體、抗原、生物素或鏈親和素、可與另一種核酸雜交的RNA或DNA類型的核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于該第二成分以分子網(wǎng)形式包被該第一成分，分子網(wǎng)的網(wǎng)眼大小分布在一狹窄范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于所述第一成分的可確定的特性是選自以下一組特性中的至少一個，包括電磁波吸收性和發(fā)射性、質(zhì)量、磁性、介電性、放射性、大小、密度、以及藥理學(xué)的、生物學(xué)的、和/或催化的效應(yīng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于第一和第二成分間是可以分開地互相聯(lián)結(jié)的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于載體是以一群體形式出現(xiàn)，這些群體可在包裹后依微粒大小，和/或在包裹前、中和/或后，按第一成分的可確定的特性進(jìn)行至少一次分級。
15.據(jù)權(quán)利要求14的微粒，其特征在于所述微粒以一群體形式出現(xiàn)，其大小和/或可確定特性，特別是大小和/或顏色，分布在一窄范圍內(nèi)。
16.據(jù)權(quán)利要求14和/或15的微粒，其特征在于所述微粒其第一成分的可確定特性，特別是大小和/或顏色分布在一窄的范圍內(nèi)。
17.據(jù)權(quán)利要求2-16中至少一項(xiàng)的微粒，其特征在于，所述的載體有高額(eine hohe Belegung)的第二成分，后者至少具有一個反應(yīng)成分，特別是特異的反應(yīng)成分。
18.根據(jù)權(quán)利要求l-17之一的微粒，其特征在于，所述的反應(yīng)成分是經(jīng)過隔離物與外殼和核芯結(jié)合的。
19.由至少一個第一成分和至少一個第二成分構(gòu)成的微粒的生產(chǎn)方法，其中該第一成分用至少一個作為第二成分的可交聯(lián)聚合物處理至少一次，各個產(chǎn)物和/或終產(chǎn)物與至少一個具有至少雙功能的化合物交聯(lián)。
20.據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于在所述的方法中未處理的第一成分、中間產(chǎn)物和/或微粒，至少有一次分級是按大小和/或另一種可確定的特性進(jìn)行的。
21.據(jù)權(quán)利要求19和/或20的方法，其中至少雙功能的化合物是選自一組化合物中的一個例如二醛，特別是戊二醛，二羧酸，丙烯酸鹽，或丁二烯化合物；而可交聯(lián)聚合物是用縮合、加成或取代作用交聯(lián)的。
22.據(jù)權(quán)利要求19-21中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于對聚合物和/或交聯(lián)劑的處理和/或分級進(jìn)行兩次或數(shù)次。
23.據(jù)權(quán)利要求2-18中至少一項(xiàng)的微粒在測定技術(shù)中的應(yīng)用，特別是定性的、半定量的和定量的柱固相免疫測定。
24.據(jù)權(quán)利要求23的微粒的應(yīng)用，其特征在于可確定的特性是用手工或肉眼藉參比區(qū)和濃集區(qū)進(jìn)行定性或半定量評定的。
25.據(jù)權(quán)利要求23的微粒的應(yīng)用，其特征在于可確定特性是由技術(shù)測量定量地評價的，必要時將第二成分溶解和/或?qū)⒄麄€微粒溶于另一溶劑，或在不同條件下，諸如不同pH和/或不同鹽濃度下進(jìn)行。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25中至少一項(xiàng)的微粒的應(yīng)用，其特征在于，采用了至少兩個可確定的特性，例如利用磁性改進(jìn)混合，和/或其后將固相從液相分離，和/或吸收性(Absorption)定量。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-5中至少一項(xiàng)的微粒，用于藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性物質(zhì)的應(yīng)用，其特征為，至少將第二成分溶解和拆分。
28.據(jù)權(quán)利要求27的微粒的應(yīng)用，其特征在于，第二成分大小的窄的分布決定溶解所需時間，和/或第一成分的至少一種可確定特性的窄的分布決定其效應(yīng)在窄范圍內(nèi)。
29.據(jù)權(quán)利要求27或28的微粒的用途，作為活性物質(zhì)親合運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)載工具。
30.根據(jù)權(quán)利要求2-15中至少一項(xiàng)的微粒，用作化學(xué)和/或生化反應(yīng)中的催化劑的應(yīng)用。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的微粒的應(yīng)用，其特征在于，使用至少兩個可確定的特性，例如用于快速混合的磁性，和用于快速分離的重量。
全文摘要
由至少一種第一和至少一種第二成分構(gòu)成的耐貯藏微粒,其中:－至少一種可交聯(lián)聚合物作為外殼的第二成分,至少部分地包被和/或包圍作為核芯的該第一成分,以及－該第一成分具有至少一種可確定的特性,可藉以下方法獲得,－將該第一成分與可交聯(lián)聚合物反應(yīng),隨后將形成的產(chǎn)物與一交聯(lián)劑反應(yīng)使得具有耐貯藏性的第一成分留在第二成分內(nèi)。
文檔編號G01N33/58GK1207810SQ96199745
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月22日
發(fā)明者D·普拉克斯納, E·格羅馬科維斯凱爾, C·艾爾哈德特 申請人:阿比翁參股及管理股份有限公司