基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光沙門氏菌免疫層析檢測試紙條及應(yīng)用，本發(fā)明采用低噪聲激發(fā)式熒光染料作為標記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于沙門氏菌的免疫層析試紙條，檢測時，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強度檢測值實現(xiàn)樣本的定性及定量檢測，該試紙條適用于食品及病理樣本中沙門氏菌即時檢測，本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準定量及便攜的特點。
【專利說明】基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的 沙門氏菌免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出 入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時也對沙門氏菌的快速及高精度的定量檢測提出了更 高的要求。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測方法，世界各國學(xué)者進行 了大量研宄，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)、分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并 在實踐中不斷取得新進展。
[0003] 免疫層析技術(shù)是一項有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的 新型免疫檢測技術(shù)，當前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得 到廣泛應(yīng)用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝 酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當迀移至交聯(lián)標 記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標記抗體 復(fù)合物，經(jīng)標記物的顯色、發(fā)光或電化學(xué)反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性 免疫診斷。常用的標記物包括生色型探針（包括膠體金、膠體碳、著色微球等）和熒光分子 (如有機熒光染料、量子點、稀土元素配合物、上轉(zhuǎn)磷光顆粒等）。
[0004] 然而上述的標記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進而限制 了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見的利用酶標記催化生色底物的酶促反應(yīng)而 顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應(yīng)用于食品中沙門氏菌的檢測，通過單克隆 抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學(xué)方法低，且必須經(jīng)過增菌篩選 純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。
[0005] 對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從 而實現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué) 檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學(xué)方法無可比擬的優(yōu) 勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但這種 方法中存在標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且 只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了 免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。
[0006] 另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所 見甚少，同時更難以實現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的 限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定量檢測沙門氏菌的 問題，進而提供一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，并進一步公 開了其應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌 免疫層析試紙條，包括：
[0009] 底板以及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗 體承載膜和吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰部 位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的 檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；
[0010] 所述結(jié)合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與沙門氏菌特異性結(jié)合的 單克隆抗體；
[0011] 所述檢測線由可與所述沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線 由與所述沙門氏菌以及所述可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層形 成。
[0012] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，所述結(jié)合墊上噴 涂的所述可與沙門氏菌特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗沙門氏菌單克隆抗體（由上?；?耘生物提供）。
[0013] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，形成所述檢測線 的可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體為鼠抗沙門氏菌多克隆抗體（由上?；墼派?提供）。
[0014] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，形成所述質(zhì)控線 的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。
[0015] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，所述的低噪聲激 發(fā)式焚光染料為發(fā)射波長為650-1000nm。優(yōu)選的，所述的基于低噪聲激發(fā)式焚光標記的染 料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的熒光分子。
[0016] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，所述的低噪聲激 發(fā)式焚光染料為DyLight800(由Thermofisher公司提供）。
[0017] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，所述質(zhì)控線與所 述檢測線平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì)控線間距0. 5cm。
[0018] 本發(fā)明提供了一種制備所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析 試紙條的方法，包括如下步驟：
[0019] A)取以pH為7. 4的PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，染料與 沙門氏菌單克隆抗體以1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的標 記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記產(chǎn)物中添加 終濃度為1. 5%BSA、0. 15%Tween20和0. 15%。疊氮化鈉，4°C保存，備用；
[0020] B)在所述結(jié)合墊上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟A)中的所述標記 產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；
[0021] C)使用含5 %BSA，0. 1 %Tween20的PBS(pH7. 4)緩沖液噴涂在所述樣品墊上，室 溫風(fēng)干后，備用；
[0022] D)分別取所述沙門氏菌多克隆抗體和所述與沙門氏菌以及可與沙門氏菌特異性 結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機在所述抗體承載膜上劃所述檢測線和所述質(zhì)控 線，室溫風(fēng)干，備用；
[0023] E)將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿 所述底板的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得；
[0024] 本發(fā)明提供了一種由上述的制備方法制得的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門 氏菌免疫層析試紙條在定性及定量檢測沙門氏菌領(lǐng)域中的用途。
[0025] 本發(fā)明提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析 試紙條檢測沙門氏菌的方法，包括如下步驟：
[0026] a)以pH為7. 4的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液超聲破菌后作為待檢 樣，用所述的試紙條進行免疫層析；
[0027] b)熒光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的 熒光強度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述 檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
[0028] 所述的檢測沙門氏菌的方法，還包括制備標準曲線及定量檢測的步驟：其中：
[0029] 所述制備標準曲線的步驟包括：取沙門氏菌菌株標準品配制成1-100倍梯度濃度 的系列標準品；并將上述濃度系列標準品超聲破菌后分別用所述的試紙條進行免疫層析， 熒光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的熒光強度， 制作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的標準曲線，并擬合方程；
[0030] 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進行免疫層析檢測，利用 上述標準曲線及工作方程求得所述沙門氏菌濃度。
[0031] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：
[0032] (1)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，其發(fā) 射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域（波長為650-1100nm)的低噪聲激發(fā)式熒光探針具有較高的 信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光譜區(qū)自 發(fā)熒光，使得基于此類探針標記的分析檢測免受背景熒光干擾；因散射光強度與波長的四 次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的低噪聲激發(fā)式熒光探針受其干擾小。與常用的膠體金免 疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的免疫層析體系對靶標菌的靈敏度提 高約200倍；如沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為l*105CFU/mL，而本發(fā)明中 基于低噪聲激發(fā)式熒光染料的沙門氏菌免疫層析試紙條的最低檢出限為〇. 5*103CFU/mL;
[0033] (2)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條定性檢 測沙門氏菌的方法具有便攜的優(yōu)勢，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，本方法所涉的免疫層析 試紙條及低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個檢測過程可在45min內(nèi) 完成，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法5-6天的檢測周期及繁瑣的培養(yǎng)基 配制等過程具有顯著的時效性優(yōu)勢；相對于PCR及實時熒光定量PCR法等分子生物學(xué)方法 則在儀器的檢測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢；
[0034] (3)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條定量檢 測沙門氏菌的方法可對所述沙門氏菌進行定量檢測，傳統(tǒng)的免疫層析法依賴膠體金顆粒的 聚集效應(yīng)而生色以判讀結(jié)果，其顏色深淺雖與樣品中靶標菌的濃度存在一定的數(shù)量關(guān)系， 但無法進行準確定量，而本發(fā)明將低噪聲激發(fā)式熒光染料標記于特異性抗體上，檢測線的 熒光強度直接體現(xiàn)了與捕獲分子相結(jié)合的靶標菌的量，加之質(zhì)控線不隨樣本改變的熒光強 度作為內(nèi)參，通過掃描檢測線及質(zhì)控線上的熒光強度、計算比值，并與標準曲線比較即可得 出檢樣中靶標菌的濃度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0036]圖1是實施例1中所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條 的不意圖；
[0037]圖2是實施例2中所述的沙門氏菌低噪聲激發(fā)式熒光檢測圖；
[0038] 圖3是實施例2中所述定性檢測沙門氏菌方法的特異性試驗結(jié)果圖；
[0039] 圖4是實施例3中所述的沙門氏菌的標準曲線。
[0040] 圖中附圖標記表示為：1-樣品墊，2-結(jié)合墊，3-硝酸纖維素膜，4-檢測線，5-質(zhì)控 線，6-吸水墊，7-底板。

【具體實施方式】
[0041] 實施例1
[0042] 本實施例所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條如圖1 所示，其包括，底板7以及沿所述底板7的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊1、 結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6,且所述樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6之 間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜3上粘附于所述底板7的中 間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線4的質(zhì)控線5,所述檢測線4靠近所述結(jié)合墊2,所述質(zhì) 控線5靠近所述吸水墊6。所述質(zhì)控線4與所述檢測線5平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì)控 線間距0. 5cm。
[0043] 所述結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與沙門氏菌特異性結(jié)合 的單克隆抗體鼠抗沙門氏菌單克隆抗體（由上?；墼派锾峁?；所述檢測線4由可與所 述沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體鼠抗沙門氏菌多克隆抗體鼠抗沙門氏菌多克隆抗體 涂層形成；所述質(zhì)控線5由與所述沙門氏菌以及所述可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗 體均無關(guān)的羊抗鼠IgG(購自北京華大蛋白質(zhì)公司）多克隆抗體涂層形成。
[0044] 所述的低噪聲激發(fā)式焚光染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的NHS活 化的低噪聲激發(fā)式焚光染料DyLight800(由Thermofisher公司提供）作為焚光分子。
[0045] 上述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條的制備方法，包括 如下步驟：
[0046]A)取以pH為7.4的PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料 DyLight800(由美國ThermoFisher公司提供）與所述沙門氏菌單克隆抗體（由上海慧耘生 物科技有限公司提供）按質(zhì)量比為1:2混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得 的標記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析過夜，向所述標記好的抗體溶液標記 產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5%BSA、0. 15%Tween20和疊氮化鈉0. 1554,4°C保存，備用；
[0047] B)選取玻璃纖維素膜為所述結(jié)合墊2,在所述結(jié)合墊2上噴涂以層析緩沖液稀釋 1000倍后的上述步驟A)中的標記產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；
[0048]C)選取纖維素膜為所述樣品墊1，使用含5%BSA，0? 1 %Tween20的pH7. 4的PBS 緩沖液噴涂在所述樣品墊1上，室溫風(fēng)干后，備用；
[0049] D)選取硝酸纖維素膜為所述抗體承載膜3,分別取所述沙門氏菌多克隆抗體和所 述羊抗鼠IgG(購自北京華大蛋白質(zhì)公司）多克隆抗體用劃線機在所述抗體承載膜3上劃 所述檢測線4和所述質(zhì)控線5,室溫風(fēng)干，備用；
[0050]E)將上述步驟獲得的所述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述抗體承載膜3和所述吸水 墊6沿所述底板7的長度方向上依次粘附，具體為在底板7中間先鋪設(shè)抗體承載膜3,然后 在抗體承載膜3的與質(zhì)控線5相臨近的一端鋪吸水墊6,使吸水墊6與抗體承載膜3部分重 疊，然后在抗體承載膜3的與所述檢測線4相臨近的一端鋪所述結(jié)合墊2,使所述抗體承載 膜3與所述結(jié)合墊2的一端部分重疊，隨后在所述結(jié)合墊2的另一端再部分重疊的鋪設(shè)所 述樣品墊1，最后切割成0. 5cm寬，即得試紙條。
[0051] 實施例2
[0052] 本實施例提供了一種利用上述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層 析試紙條進行定性檢測沙門氏菌的方法，包括如下步驟：
[0053]a)取雞肉樣品 25g，剪碎，用 225mL的pH為 7. 4 的含 5%BSA，0. 1 %Tween20 的 PBS緩沖液稀釋樣品，取上清液作為檢樣，吸取lml上清液至EP管中，超聲破菌，直徑3mm探 頭，工作5s，休息15s，40%能量（由寧波先倡電子科技有限公司提供的超聲細胞粉碎機，型 號為XC-⑶型），共計30次循環(huán)，吸取100yL經(jīng)超聲處理的檢樣滴加到樣品墊1上，待吸收 干后再滴加50yL上述的PBS緩沖液，用所述的試紙條進行免疫層析；
[0054]b)室溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀（由北京博潤福得科技 發(fā)展有限公司提供）分別測定所述檢測線4和所述質(zhì)控線5區(qū)域的熒光強度，若所述質(zhì)控 線5區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線4區(qū)域同時出 現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性，附圖2給出了對上述樣品的定性檢測結(jié)果。
[0055] 所述定性檢測沙門氏菌方法的特異性試驗：分別取實驗室分離的沙門氏菌、金黃 色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌調(diào)制成0. 6X104CFU/mL 的菌液，然后按照上述的超聲處理方法進行破菌處理，吸取100UL經(jīng)超聲處理的樣本滴加 到樣品墊上，待吸收干后再滴加50yL上述的PBS緩沖液，室溫放置15min后，用便攜式近 紅外熒光掃描儀（由北京博潤福得科技發(fā)展有限公司提供）讀數(shù)，附圖3為所述定性檢測 沙門氏菌方法的特異性試驗結(jié)果圖，從圖中可以看出，除沙門氏菌樣品外，其余檢測的細菌 在檢測線位置均未出現(xiàn)發(fā)射峰，各菌的試紙條均在質(zhì)控線處出現(xiàn)發(fā)射峰，表明本方法對沙 門氏菌的檢測特異性好，與其他四個菌屬無交叉反應(yīng)。
[0056] 實施例3
[0057] 本實施例提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層 析試紙條定量檢測沙門氏菌的方法。
[0058] 制備標準曲線：取105CFU/mL的沙門氏菌純菌（實驗室分離株），用含PBS(PH7. 4) 稀釋液將所述純菌進行倍數(shù)系列稀釋，制成〇. 5*105CFU/mL、l*104CFU/mL、0. 5*104CFU/mL、 l*103CFU/mL、0. 5*103CFU/mL、l*102CFU/mL、10CFU/mL的樣品；然后依照實施例 2 中步驟a 中所述方法進行超聲破菌處理，吸取50yL樣本滴加到樣品墊1上，待樣品吸收后再滴加 50yL上述的PBS緩沖液，室溫靜置10分鐘，將上述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃 描儀（由北京博潤福得科技發(fā)展有限公司提供）中讀數(shù)。
[0059] 上述系列稀釋的沙門氏菌標準品分別進行檢測，掃描獲得檢測線4和質(zhì)控線5的 熒光值，同時出現(xiàn)檢測區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個稀釋度樣本平 行測量兩次，取平均值作為測量值，檢測結(jié)果見表1，以該值對相應(yīng)的樣品濃度制作標準工 作曲線，如圖4所示，并擬合得適用的標準曲線為y= 1.4927X+2. 5738,R2= 0.9416。
[0060] 表1 :不同濃度沙門氏菌標準品對應(yīng)檢測結(jié)果
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，其特征在于，包括： 底板（7)以及沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊（1)、結(jié)合 墊（2)、抗體承載膜（3)和吸水墊（6)，且所述樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、抗體承載膜（3)和吸 水墊（6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜（3)粘附于所述 底板（7)的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線（4)和質(zhì)控線（5)，所述檢測線（4)靠近 所述結(jié)合墊（2)，所述質(zhì)控線（5)靠近所述吸水墊（6); 所述結(jié)合墊（2)上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與所述沙門氏菌特異性結(jié) 合的單克隆抗體； 所述檢測線（4)由可與所述沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì)控線 (5)由與所述沙門氏菌以及所述可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體涂層 形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條，其 特征在于，所述結(jié)合墊（2)上噴涂的所述可與沙門氏菌特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗沙 門氏菌單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙 條，其特征在于，形成所述檢測線（4)的所述可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體為鼠 抗沙門氏菌多克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試 紙條，其特征在于，形成所述質(zhì)控線（5)的抗體為羊抗鼠 IgG多克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試 紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為777nm，激發(fā)波長為790nm 的焚光分子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙 條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料 DyLight800。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層 析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟： A) 取以pH為7. 4的PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，所述染料與 沙門氏菌單克隆抗體按質(zhì)量比為1:2混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的 標記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記產(chǎn)物中添 加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20和0. 15%。疊氮化鈉，4°C保存，備用； B) 在所述結(jié)合墊（2)上噴涂以層析緩沖液稀釋1000倍后的上述步驟A)中的所述標記 產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用； C) 使用含5% BSA，0. 1 % TWeen20的pH為7. 4的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊（1) 上，室溫風(fēng)干后，備用； D) 分別取所述沙門氏菌多克隆抗體和所述與沙門氏菌以及可與沙門氏菌特異性結(jié)合 的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機在所述抗體承載膜（3)上劃所述檢測線（4)和所述質(zhì) 控線（5)，室溫風(fēng)干，備用； E) 將上述步驟獲得的所述樣品墊（1)、所述結(jié)合墊（2)、所述抗體承載膜（3)和所述吸 水墊（6)沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
8. 權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層析試紙條 在定性及定量檢測沙門氏菌領(lǐng)域中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的沙門氏菌免疫層 析試紙條檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 以pH為7. 4的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS 緩沖液作為陰性對照，分別以利用權(quán)利要求1-6任一所述的試紙條進行免疫層析檢測； b) 熒光掃描所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控 線（5)區(qū)域的熒光強度，若所述質(zhì)控線（5)區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反 之則無效；若所述檢測線（4)區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，還包括制備標準曲線及 定量檢測的步驟：其中 所述制備標準曲線的步驟包括：取沙門氏菌菌株標準品配制成1-100倍梯度濃度的系 列標準品；并將上述濃度系列標準品分別用所述的試紙條進行免疫層析，熒光掃描所述檢 測線⑷和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線⑷和所述質(zhì)控線（5)區(qū)域的熒光強度， 制作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的標準曲線，并擬合方程； 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進行免疫層析檢測，利用上述 標準曲線及方程計算得到所述沙門氏菌濃度。
【文檔編號】G01N21/64GK104459128SQ201410809728
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】張捷, 謝雪欽, 萬曉楠, 陳廣全, 張惠媛, 康西西, 尚士進, 張曉光, 舒咬根 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院