改進(jìn)的六胺銀馬松套染法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的六胺銀馬松套染法，包括以下步驟：配制銀染試劑；將組織切片用Bouin液固定；切片依次浸入2.5%碘酒、5%硫代硫酸鈉、1.5%高碘酸；取銀染A液和銀染B液浸染切片，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；3%硫代硫酸鈉浸泡切片；蘇木素浸染；鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)；麗春紅染液浸染；1%磷鉬酸浸泡切片；經(jīng)梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。本發(fā)明提供了一種試劑調(diào)配合理、染色效果好且時(shí)間短、性能穩(wěn)定、套染色澤鮮艷的六胺銀馬松套染法，并在實(shí)驗(yàn)中取得了比現(xiàn)有方法更好的效果，改變了銀染色中組織容易出現(xiàn)過染，時(shí)間、溫度較難控制，背景顏色過高及套染別的染色色彩不夠鮮艷等問題。
【專利說明】改進(jìn)的六胺銀馬松套染法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及六胺銀馬松套染法，是腎組織穿刺活檢的病理診斷必要的特殊染色方法之一。特別地，本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的六胺銀馬松套染法，可以用于顯示腎組織中小球、小管、血管基底膜和組織免疫復(fù)合物沉積及纖維化等改變。
【背景技術(shù)】
[0002]六胺銀馬松套染法是從霉菌染色的六胺銀法演化形成的針對(duì)腎組織切片的染色方法，是六胺銀和馬松兩種染色方法的疊加染色。在腎小球疾病中，常導(dǎo)致腎小球基底膜的改變，基底膜是一層高度含水性凝膠體的襯膜，主要由粘多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，具有滲透性，常與纖細(xì)的結(jié)締組織纖維密切結(jié)合。六胺銀馬松套染法是使腎組織經(jīng)酸氧化后，基底膜內(nèi)的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺銀還原為黑褐色的金屬銀，從而使基底膜顯示出黑色的著色。該法是腎穿刺活檢病理診斷中是常規(guī)的特殊染色方法之一。它不僅能清晰顯示腎組織中小球的數(shù)目，勾畫出小球基底膜斷裂、增生、折疊等形態(tài)改變，還能準(zhǔn)確地顯示免疫復(fù)合物在基底膜沉積位置，還能顯示出腎小管萎縮狀態(tài)、血管壁增厚與否及炎細(xì)胞浸潤(rùn)的嚴(yán)重程度等。因此，六胺銀馬松套染法對(duì)于腎臟病理臨床診斷、分類和治療提供了重要的依據(jù)，是腎臟病理診斷必不可少且難度最大的特殊染色方法。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外的專業(yè)人士想盡了許多辦法改進(jìn)常用的基底膜銀染色方法，包括Gomori法、Jonej s法、矢島(Jenos)改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等,企圖取得更好的基底膜染色質(zhì)量，但是依然存在以下種種問題:銀染色中組織容易出現(xiàn)過染；時(shí)間、溫度較難控制；背景顏色過高；套染別的染色色彩不夠鮮艷等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的六胺銀馬松套染法，該方法中的銀染試劑調(diào)配合理、染色效果好、時(shí)間短、性能穩(wěn)定、套染染色色澤鮮艷，能夠更好地為腎臟病理臨床診斷、分類和治療提供重要的依據(jù)。
[0005]本發(fā)明所述的一種改進(jìn)的六胺銀馬松套染法，包括以下步驟:
[0006](I)配制銀染試劑，包括:
[0007]銀染A液:蒸餾水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml ;銀染B液:蒸餾水100ml, IOg硝酸銀；
[0008]5%硼砂:蒸懼水100ml, 5g硼砂；
[0009]15%六次甲基四胺:蒸餾水100ml，15g六次甲基四胺；
[0010]4%硼酸:蒸餾水100ml，4g硼酸；
[0011]1.5%高碘酸:蒸餾水100ml, 1.5g高碘酸；
[0012]麗春紅染液:麗春紅S0.7g，酸性品紅0.3g，蒸餾水100ml，冰醋酸Iml ；
[0013]1%苯胺藍(lán):苯胺藍(lán)lg，冰醋酸1ml，蒸餾水IOOml ；
[0014]1%磷鑰酸:磷鑰酸lg，蒸餾水IOOml ；[0015](2)將組織切片用Bouin液固定，脫蠟，入水；
[0016](3)切片浸入2.5%碘酒3分鐘，蒸餾水洗3次；
[0017](4)切片浸入5%硫代硫酸鈉5分鐘，蒸餾水洗3次；
[0018](5)切片浸入1.5%高碘酸15分鐘，氧化溫度在20_25°C之間，蒸餾水洗3次。
[0019](6)取銀染A液30ml過濾并于70°C預(yù)熱25分鐘；
[0020](7)將銀染B液0.82ml加入預(yù)熱好的銀染A液中，混勻放入切片，70°C浸染15分鐘后每5分鐘鏡下觀察基底膜的著色情況，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；蒸餾水洗3次；
[0021](8) 3%硫代硫酸鈉浸泡切片15秒，水洗3分鐘X 3次；
[0022](9 )蘇木素浸染15分鐘，水洗；
[0023]( 10)鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)；
[0024](11)麗春紅染液浸染12分鐘，水洗I分鐘X 3次；
[0025](12) 1%磷鑰酸浸泡切片I分鐘，直接入1%苯胺藍(lán)浸染4分鐘；
[0026](13)切片經(jīng)梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0027]根據(jù)本發(fā)明所述的六胺銀馬松套染法的進(jìn)一步特征，所述的蒸餾水為電子級(jí)超純水或雙蒸分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。
[0028]本發(fā)明所述的改進(jìn)的六胺銀馬松套染法，對(duì)于染液的試劑濃度比例關(guān)系、染色時(shí)間、染色溫度及套染染液的配比、步驟進(jìn)行了改良調(diào)整，摸索出一種試劑調(diào)配合理、染色效果好且時(shí)間短、性能穩(wěn)定、套染色澤鮮艷的方法，并在實(shí)驗(yàn)中取得了比現(xiàn)有方法更好的效果，改變了銀染色中組織容易出現(xiàn)過染，時(shí)間、溫度較難控制，背景顏色過高及套染別的染色色彩不夠鮮艷等問題。
[0029]染色過程中金屬銀的還原是關(guān)鍵步驟，往往決定著染色的成敗。胺銀染色試劑中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸銀的配比適當(dāng)，能防止產(chǎn)生過量的胺銀黑顆粒污染組織而影響組織病變的觀察。本發(fā)明是在不斷的摸索中調(diào)配出來胺銀染色試劑中六次甲基四胺、硼酸、硼砂、硝酸銀的最佳配比，較Gomori法、Jonej s法、矢島(Jenos)改良法、Gordon-Sweet法、Janes法等國(guó)內(nèi)外常用的銀染法減少了硝酸銀的含量。染液中銀離子的含量降低，減少了胺銀顆粒污染組織的可能。但是染液中銀離子減少使基底膜著色需要更長(zhǎng)的時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間的胺銀反應(yīng)容易使染液變渾濁并出現(xiàn)黑色的反光膜，氯化金調(diào)色時(shí)很難清除掉切片上黑色的反光膜，致使切片背景較臟，不利于染色結(jié)果的判斷。因此，本發(fā)明在調(diào)整配比的同時(shí)，調(diào)整了染色的溫度和染色的時(shí)間，使染液未形成渾濁和反光膜前，基底膜的染色就已經(jīng)完成，不需常規(guī)銀染中的氯化金調(diào)色去除多余的銀染顆粒。這種配比減少了腎組織棕黑色的背景著色，更有助于后面的雙重染色。
[0030]在染色的過程中腎組織經(jīng)酸氧化后，使基底膜內(nèi)的粘多糖暴露出醛基，醛基把六胺銀還原為黑褐色的金屬銀而使腎小球的基底膜著色的。組織氧化是染色成功的前提。氧化一定要充分才能使醛基暴露完全，若氧化不夠完全，切片銀著色較淺，影響結(jié)果判斷。本發(fā)明在氧化的過程提高了高碘酸的含量，延長(zhǎng)了高碘酸的反應(yīng)時(shí)間，充分暴露了基底膜內(nèi)的醛基，提高了染液的使用次數(shù)和有效期。
[0031]在銀染的過程中除了試劑的配方、反應(yīng)的溫度和時(shí)間以外，本發(fā)明使用的器皿應(yīng)預(yù)先用濃硫酸浸泡并沖洗干凈。染色過程中，染液不能接觸金屬物質(zhì)(如鑷子)等影響染色外在因素。關(guān)于配染液的水，本發(fā)明對(duì)比了實(shí)驗(yàn)室常用的幾種配試劑的水，包括:單蒸水、雙蒸水、通過水處理系統(tǒng)處理過的分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水和電子級(jí)超純水。實(shí)驗(yàn)表明，使用電子級(jí)超純水和分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水雙蒸處理后配銀染試劑背景最低，染色質(zhì)量最好。銀染液用合適的實(shí)驗(yàn)用水配制并按上述步驟、時(shí)間和溫度操作可以有效的防止銀染過染，時(shí)間、溫度較難控制，背景顏色過高等難以解決的問題。
[0032]在腎組織六胺銀染色之后常常進(jìn)行Masson雙重染色，其目的是為了在同一張切片中顯示腎小球內(nèi)的免疫復(fù)合物的沉積的部位、形態(tài)和病變范圍以及腎間質(zhì)纖維化的程度等。由于常規(guī)的六胺銀染色已將組織中許多嗜銀位點(diǎn)染成黑色，這會(huì)導(dǎo)致套染馬松三色時(shí)腎小球內(nèi)免疫復(fù)合物顯色顏色淺淡，基底膜、系膜、膠原纖維及胞質(zhì)、紅細(xì)胞顏色對(duì)比不鮮艷。本發(fā)明改變了經(jīng)典馬松染色的配方，將混合紅染液換成了麗春紅S與酸性品紅的配比染液，從而去除了混合紅中的亮綠。并且摸索出了合適的染色時(shí)間，提升組織中的紅細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)及免疫復(fù)合物的鮮艷程度并且提高了間質(zhì)中藍(lán)色膠原纖維的對(duì)比。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明所述的改進(jìn)的六胺銀馬松套染法的腎組織切片染色圖。
[0034]圖2為美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心病理科所采用的Jones-HE銀染色法的腎組織切片染色圖(該圖片來自廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心耿艦教授提供)。
[0035]圖3為寶雞市中心醫(yī)院采用Gomor1-masson銀染法的腎組織切片染色圖(馬寧，蔡媛.腎穿刺標(biāo)本六胺銀G馬松三色套染法介紹[J].2012，19(10):391)。
[0036]圖4為廣東省人民醫(yī)院病理科采用矢島(Jenos)改良銀染法的腎組織切片染色圖(駱新蘭，蔡秀，王朝杰，等.腎小球基膜六胺銀染色的比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，200520(4):493-494.)。
[0037]圖5為國(guó)內(nèi)各大醫(yī)院及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)腎組織六胺銀染色圖。圖片來源于患者在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院(即本 申請(qǐng)人:)就診時(shí)提供的病史資料，可根據(jù)患者的病理號(hào)到原醫(yī)院查找到患者的六胺銀染色的病理切片，從患者帶來的病理切片中看出各大醫(yī)院的染色結(jié)果。圖中，A、B是來自于廣州中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科(患者病理號(hào):K10590) ;C、D、E是來自于廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心(患者病理號(hào):KB1312967、KB1401240) ;F是來自于江西省兒童醫(yī)院病理科(患者病理號(hào):43174)。
[0038]圖6為不同的實(shí)驗(yàn)用水在相同條件下的胺銀反應(yīng)對(duì)比。據(jù)圖經(jīng)單因素方差分析，圖中電子級(jí)超純水及雙蒸分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水分別與一級(jí)用水、單蒸水相比P < 0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0039]本發(fā)明在這里可通過以下的具體實(shí)施例的詳細(xì)說明來得以更好的理解。需要明確的是，這些具體實(shí)施例僅是用作示例，而不是對(duì)在所附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的任何形式的限制。除非在這里另外特別定義，所有術(shù)語都采用它們的最寬的可能的解釋，包括從本說明書中暗示的含義，以及本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所能知曉的含義和/或在字典、論文等重所定義的含義。
[0040]以下是本文所采用的部分術(shù)語在本領(lǐng)域的解釋。[0041]脫蠟:石蠟切片染色必須用二甲苯脫去切片中的石蠟，作用是二甲苯可以溶解石蠟，以使染料易于進(jìn)入細(xì)胞和組織。
[0042]分化:在蘇木精染色之后，用水洗去未結(jié)合的染液，但在細(xì)胞核中結(jié)合過多的染料和細(xì)胞漿中吸附的染料必須用1%鹽酸酒精脫去，才能保證細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色的分明，把這個(gè)過程稱為分化。
[0043]返藍(lán):分化之后蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下則處于藍(lán)色離子狀態(tài)，呈藍(lán)色。所以分化后用水洗除去酸而終止分化，在用弱堿性水是蘇木精染上的細(xì)胞核變呈藍(lán)色，這一過程稱藍(lán)化或返藍(lán)。
[0044]脫水:切片染色結(jié)束后將切片由低濃度酒精過度到高濃度的酒精過度的過程，其作用是將組織中的水分置換成酒精，以便于二甲苯進(jìn)入組織細(xì)胞進(jìn)行透明。
[0045]透明:石蠟組織切片染色經(jīng)過脫水處理后必須經(jīng)二甲苯處理，使切片透明，才能用樹膠封片。
[0046]實(shí)施例1:本發(fā)明所述的六胺銀馬松套染法
[0047]1.試劑配方:
[0048]1.1銀染配方:
[0049]銀染A液:蒸餾水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml。該液體放于4°C冰箱保存，有效期為2個(gè)月。2個(gè)月后需重新配制。
[0050]銀染B液:蒸餾水100ml，IOg硝酸銀。該液體需避光于4°C冰箱保存，如發(fā)現(xiàn)液體有黑色沉淀，需重新配制。
[0051]1.2.15%硼砂:蒸餾水100ml，5g硼砂。該液體室溫，避光保存。
[0052]1.2.215%六次甲基四胺:蒸餾水100ml，15g六次甲基四胺，該液體放于4°C冰箱保
存，出現(xiàn)沉淀需重新配制。
[0053]1.2.34%硼酸:蒸餾水100ml，4g硼酸。該液體室溫保存。
[0054]1.2.41.5%高碘酸:蒸餾水100ml，1.5g高碘酸。該液體放于4°C冰箱保存，使用時(shí)需防止液體稀釋，染100張色切片后該液體需重新配制。
[0055]1.2.5麗春紅染液:麗春紅S0.7g,酸性品紅0.3g,蒸懼水100ml,冰醋酸lml。室
溫保存。
[0056]1.2.61%苯胺藍(lán):苯胺藍(lán)lg，冰醋酸1ml，蒸餾水100ml。室溫保存。
[0057]1.2.71%磷鑰酸:磷鑰酸lg，蒸餾水100ml。室溫保存。
[0058]2.步驟
[0059]2.1Bouin液固定的組織切片，脫蠟，入水。(預(yù)熱第5步，取銀染A液30ml過濾并于70°C預(yù)熱25分鐘)。
[0060]2.2切片浸入2.5%碘酒3分鐘，蒸餾水洗3次。
[0061]2.3切片入5%硫代硫酸鈉浸泡5分鐘，蒸餾水洗3次。
[0062]2.41.5%高碘酸浸泡15分鐘(氧化溫度在20_25°C之間)，蒸餾水洗3次。
[0063]2.5取出預(yù)熱好的銀染A液30ml (見2.1)。
[0064]2.6將銀染B液0.82ml加入預(yù)熱好的銀染A液中，混勻放入切片，70°C浸染，15分鐘后每5分鐘鏡下觀察基底膜的著色情況，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；蒸餾水洗3次；[0065]2.7切片入3%硫代硫酸鈉浸泡15秒，水洗3分鐘X 3次。
[0066]2.8蘇木素浸染15分鐘，水洗。
[0067]2.9鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)。
[0068]2.10麗春紅染液浸染12分鐘，水洗I分鐘X 3次。
[0069]2.111%磷鑰酸浸泡I分鐘直接入1%苯胺藍(lán)浸染4分鐘。不水洗直接脫水。
[0070]2.12切片經(jīng)梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0071]3.注意事項(xiàng)
[0072]3.1染色時(shí)請(qǐng)用立式染缸浸染,除銀染A、B液外其他液體均可重復(fù)使用。染缸、切片均須泡酸、蒸餾水沖洗數(shù)次方可備用。
[0073]3.2由于銀染著色的不可逆性，在染至15分鐘左右時(shí)要開始鏡下進(jìn)行性觀察染色效果，以腎小球基底膜清晰著色為好。銀染液不可重復(fù)使用，快到有效期的染液請(qǐng)縮短染色時(shí)間。
[0074]3.3第7步3%硫代硫酸鈉時(shí)間不可過長(zhǎng)，否則容易掉片。
[0075]3.4在上述實(shí)驗(yàn)步驟中，采用的蒸餾水為電子級(jí)超純水或雙蒸分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。
[0076]4.結(jié)果
[0077]基底膜為黑色，膠原纖維藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、紅細(xì)胞、免疫復(fù)合物紅色，胞核藍(lán)褐色。
[0078]實(shí)施例2:本發(fā)明所述的改進(jìn)的六胺銀馬松套染法與國(guó)內(nèi)外各大醫(yī)院及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)腎組織六胺銀染色的比較
[0079]圖1為本發(fā)明所述的改進(jìn)的六胺銀馬松套染法的腎組織切片染色圖。如圖1所示改進(jìn)的六胺銀馬松套染法對(duì)腎組織中的腎小球基底膜、腎小管基底膜、血管基底膜等部位黑色線條勾勒的清晰明顯，基底膜外的免疫復(fù)合物及腎小管細(xì)胞著色鮮艷、染色的背景干凈，色彩鮮明。
[0080]從染色效果看，該染色法優(yōu)于Jones-HE銀染色法(圖2)、Gomor1-masson銀染法(圖3)、矢島(Jenos)改良銀染法(圖4);并且優(yōu)于曾經(jīng)來我院(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)會(huì)診、讀片、展示的國(guó)內(nèi)各大醫(yī)院及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)所做的腎組織六胺銀染色(圖5)。
[0081]實(shí)施例3:不同的實(shí)驗(yàn)用水在相同條件下的胺銀反應(yīng)對(duì)比
[0082]選取單蒸水、雙蒸水、通過水處理系統(tǒng)處理過的分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水、分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水后雙蒸處理水、電子級(jí)超純水各30份樣本，分別加入本發(fā)明的銀染A液和銀染B液，于烤箱70°C進(jìn)行胺銀反應(yīng)1.5小時(shí)。將各樣本置于752型紫外分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定為680nm。取30例測(cè)量結(jié)果的均值，用電子級(jí)超純水銀染試劑液調(diào)0，對(duì)比結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后如圖6所示，可見使用電子級(jí)超純水和雙蒸分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水配銀染試劑吸光值最低，渾濁度最低，更適合腎組織六胺銀染色。
【權(quán)利要求】
1.一種改進(jìn)的六胺銀馬松套染法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配制銀染試劑，包括: 銀染A液:蒸餾水230ml，5%硼砂45ml，4%硼酸4ml，15%六次甲基四胺60ml ； 銀染B液:蒸餾水100ml, IOg硝酸銀； 5%硼砂:蒸懼水100ml, 5g硼砂； 15%六次甲基四胺:蒸餾水100ml，15g六次甲基四胺； 4%硼酸:蒸餾水100ml, 4g硼酸； 1.5%高碘酸:蒸懼水100ml, 1.5g高碘酸； 麗春紅染液:麗春紅S0.7g,酸性品紅0.3g,蒸懼水100ml,冰醋酸Iml ； 1%苯胺藍(lán):苯胺藍(lán)Ig,冰醋酸Iml,蒸懼水IOOml ； 1%磷鑰酸:磷鑰酸lg，蒸餾水IOOml ； (2)將組織切片用Bouin液固定，脫蠟，入水； (3)切片浸入2.5%碘酒3分鐘，蒸餾水洗3次； (4)切片浸入5%硫代硫酸鈉5分鐘，蒸餾水洗3次； (5)切片浸入1.5%高碘酸15分鐘，氧化溫度在20-25°C之間，蒸餾水洗3次； (6)取銀染A液30ml過濾并于70°C預(yù)熱25分鐘； (7)將銀染B液0.82ml加入預(yù)熱好的銀染A液中，混勻放入切片，70°C浸染15分鐘后每5分鐘鏡下觀察基底膜的著色情況，直至基底膜顯示清晰的黑色后終止；蒸餾水洗3次； (8)3%硫代硫酸鈉浸泡切片15秒，水洗3分鐘X3次； (9)蘇木素浸染15分鐘，水洗； (10)鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)； (11)麗春紅染液浸染12分鐘，水洗I分鐘X3次； (12)1%磷鑰酸浸泡切片I分鐘，直接入1%苯胺藍(lán)浸染4分鐘； (13)切片經(jīng)梯度酒精脫水后入二甲苯透明，中性樹膠封片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的六胺銀馬松套染法，其特征在于:所述的蒸餾水為電子級(jí)超純水或雙蒸分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK103926131SQ201410138429
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】周展眉, 王國(guó)保, 曹維, 楊滿球 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院