一種甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙及其制備方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)檢測敏感度低，準確率低，容易出現(xiàn)漏檢的問題，其解決的技術(shù)方案是，包括試紙殼和試紙條，試紙條裝在試紙殼內(nèi)，試紙條由樣品墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和背襯構(gòu)成，背襯中部粘貼有反應(yīng)膜，反應(yīng)膜上噴涂有檢測線和對照線，背襯尾部粘貼有吸水墊，吸水墊一端扣壓在反應(yīng)膜一端上，背襯上部粘貼有膠體金墊，膠體金墊一端扣壓在反應(yīng)膜另一端上，靠膠體金墊一端的背襯頭部粘貼有樣品墊，樣品墊一端扣壓在膠體金墊另一端上，本發(fā)明檢測敏感度好，準確率高，不容易出現(xiàn)漏檢，是流感病毒檢測試紙上的創(chuàng)新。
【專利說明】一種甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測試紙，特別是一種甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒簡稱流感，是由流感病毒引起的一種常見的急性呼吸道傳染病，以冬春季多見，臨床以高熱、乏力、頭痛、全身酸痛等全身中毒癥狀重而呼吸道癥狀較輕為特征。據(jù)2002年世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，估計全球每年流感病例達6億-12億。從上世紀初至今，有六次全球性流感大流行，分別是1918年“西班牙流感”、1957年“亞洲流感”、1968年“香港流感”、1977年“俄羅斯流感”、1999年-2000年的歐洲流感大流行事件以及2009年的“墨西哥流感”，每次流感大流行都導(dǎo)致數(shù)百萬以上的人死亡。除了這六次全球性流感疫情外，流感每年都會發(fā)生不同規(guī)模的小流行，盡管在波及范圍、死亡人數(shù)等方面都不像以上六次流感疫情如此嚴重，但是對當?shù)厝嗣竦纳敭a(chǎn)和經(jīng)濟發(fā)展都帶來了嚴重不良影響。如1976年美國新澤西因一名青年染上豬流感而引發(fā)了社會對爆發(fā)新疫癥的恐慌，于是開始大規(guī)模推行疫苗注射；再如1997年在香港爆發(fā)的H5N1禽流感疫情，不僅可以在禽類中傳播，還引起了人際間的傳播，香港受感染的人數(shù)為18人，其中6人死亡。由于這次疫情香港政府下令宰殺150萬只雞，對香港的經(jīng)濟帶來巨大的沖擊。
[0003]流感的流行給人民的生命和財產(chǎn)帶來了巨大的威脅，造成了較嚴重的社會影響，快速檢測試劑盒，可以在流感病毒流行時，在機場、海關(guān)等現(xiàn)場快速檢測、確定感染流感病毒的病人，為病人的治療和隔離防控提供依據(jù)。也可用于豬及家禽的流感病毒流行監(jiān)測，對流感病毒流行的防控具有重要意義。
[0004]流行性感冒是國 家衛(wèi)生部認定的乙級傳染病之一。繼SARS之后，我國衛(wèi)生部組織制定了《衛(wèi)生部應(yīng)對流感大流行準備計劃與應(yīng)急預(yù)案》，要求政府相關(guān)部門每年都要儲備大量的流感診斷檢測試劑；同時，醫(yī)院每年對呼吸道檢測試劑需求量約3億人份，而且這個數(shù)量還在不斷增加中。因此流感病毒檢測試劑盒作為常規(guī)檢測工具在各個醫(yī)療檢測窗口診斷中應(yīng)用越來越多。
[0005]隨著世界經(jīng)濟一體化的深入，全球人口流動性增加，海關(guān)、邊境、機場、車站等重要的人口集散地是各國、各地區(qū)防控傳染病的重要關(guān)卡。如我國衛(wèi)生部甲型HlNl流感臨床專家組對我國20個省市的61家醫(yī)療機構(gòu)于2009年5月10日至6月30日期間的426例新型甲型HlNl流感患者調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，有32.9%的患者于口岸篩查時發(fā)現(xiàn)；20.2%的患者因密切接觸甲型HlNl確診者而隔離，并于密切觀察期間發(fā)病。因此就需要一種盡可能不受實驗環(huán)境、實驗設(shè)備和實驗人員操作水平等因素影響的流感病毒現(xiàn)場快速檢測試劑盒用于海關(guān)、機場、車站等重要人口集散地，甚至是野外、農(nóng)場、社區(qū)、住戶等疫情感染終端人群的疫情監(jiān)測。
[0006]流感病毒是一種變異速率 非常快的RNA病毒，自然界中像流感病毒這樣變異頻繁、變異幅度大的生物是少有的。在流感病毒的8個基因中，HA變異最快，其次是NA。如甲型流感病毒的HA基因每年每個核苷酸變異的概率為3?4X 10-3，而細胞染色體DNA的突變率僅為10-8?10-10。流感病毒的易變異性造成了流感三年小流行、十年大流行的流行規(guī)律。而且每當因病毒抗原變異而出現(xiàn)新的病毒品種時，原有的檢測方法和預(yù)防手段失效而不能及時控制疫情的發(fā)生和傳播，造成了流感的大流行。以禽流感為例，1968年以來所發(fā)生的流行事件的不只是H5N1亞型毒株，還包括有H7N2，H7N3, H7N7和H9N2毒株等它們均可以感染人類。因此流感病毒檢測工作越及時、檢測結(jié)果越可靠，流感防控工作的效果也越好。
[0007]目前實時熒光定量PCR方法是檢測流感病毒靈敏度和準確率都比較高的方法，該方法在許多國家和地區(qū)已經(jīng)是鑒定流感感染陽性病例的確診性方法。但是實時熒光定量PCR方法的實驗檢測條件限制了該方法只能用于流感病毒的最終實驗室確定性檢測。而敏感度、準確率低于實時熒光定量PCR技術(shù)的免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)等方法由于操作簡便、成本低廉、對實驗條件要求低等特點被廣泛應(yīng)用在流感病毒檢測的第一線。但是，目前市場上銷售的流感病毒免疫膠體金檢測試劑盒區(qū)分甲型或者乙型流感病毒用的是抗流感病毒核蛋白的單克隆抗體，優(yōu)點在于可以很好地區(qū)分甲型和乙型流感病毒，但缺點在于核蛋白位于病毒核心內(nèi)，臨床標本直接檢測敏感度低，容易出現(xiàn)漏檢。流感病毒血凝素位于流感病毒表面，是進行快速檢測的理想靶點，但是由于流感病毒血凝素易于突變，常用于作為流感病毒亞型分類的依據(jù)，是否可以制備出與甲型各亞型均反應(yīng)的型特異性抗體，制備出高敏感性的快速檢測試紙是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙及其制備方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)檢測敏感度低，準確率低，容易出現(xiàn)漏檢的問題。
[0009]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，包括試紙殼和試紙條，試紙條裝在試紙殼內(nèi)，試紙條由樣品墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和背襯構(gòu)成，背襯中部粘貼有反應(yīng)膜，反應(yīng)膜上噴涂有檢測線和對照線，背襯尾部粘貼有吸水墊，吸水墊一端扣壓在反應(yīng)膜一端上，背襯上部粘貼有膠體金墊，膠體金墊一端扣壓在反應(yīng)膜另一端上，靠膠體金墊一端的背襯頭部粘貼有樣品墊，樣品墊一端扣壓在膠體金墊另一端上。
[0010]本發(fā)明是利用抗甲型流感病毒血凝素保守區(qū)的型特異性單克隆抗體制備的高敏感性甲型流感病毒快速檢測試紙，檢測敏感度好，準確率高，不容易出現(xiàn)漏檢，是流感病毒檢測試紙上的創(chuàng)新。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明的試紙條結(jié)構(gòu)主視圖。
[0012]圖2為本發(fā)明的試紙殼結(jié)構(gòu)主視圖。
[0013]圖3為本發(fā)明的使用狀態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。[0015]由圖1-3給出，本發(fā)明包括試紙殼和試紙條，試紙條裝在試紙殼8內(nèi)，試紙條由樣品墊1、膠體金墊2、反應(yīng)膜4和背襯7構(gòu)成，背襯7中部粘貼有反應(yīng)膜4，反應(yīng)膜4上噴涂有檢測線3和對照線5，背襯7尾部(左為頭、右為尾)粘貼有吸水墊6，吸水墊6 —端扣壓在反應(yīng)膜4 一端上,背襯7上部粘貼有膠體金墊2,膠體金墊2 —端扣壓在反應(yīng)膜4另一端上,靠膠體金墊2 —端的背襯7頭部粘貼有樣品墊I,樣品墊I 一端扣壓在膠體金墊2另一端上。
[0016]制備時，首先將反應(yīng)膜4粘貼到背襯7上，再將吸水墊6壓到反應(yīng)膜4靠近背襯末端的一側(cè)，膠體金墊2壓到反應(yīng)膜4的另一側(cè)，樣品墊I壓到膠體金墊2的另一側(cè)，樣品墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊皆用強力膠固定于背襯上，當整個背襯按要求都貼好后，用切條機沿背襯橫截面方向切成4_寬的條，即成甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙。
[0017]所述的樣品墊I由樣品處理液和玻纖膜構(gòu)成，每IOOOml樣品處理液中含有20g牛血清白蛋白(BSA)、5g曲拉通-100 (TritonX-1OO)和0.0lmol, pH為7.4的磷酸緩沖液(PBS)，其余為水制成，玻纖膜型號為CB08，把玻纖膜裁切成22mm寬的條，每100 μ L樣品處理液噴涂0.8cm長的玻纖膜，37°C干燥過夜，得樣品墊I ;
所述的膠體金墊2包括玻纖膜和金標抗體液,玻纖膜型號為CB08,將玻纖膜裁切成7mm寬的條，每100 μ L金標抗體液噴涂1.7cm長的玻纖膜，冷凍真空干燥或加入干燥劑自然涼干，然后靜置密閉容器平衡12小時，即成膠體金墊2 ；
金標抗體液的制備:
1)膠體金稀釋液的配制:每IOOOml膠體金稀釋液中含有IOg牛血清白蛋白、25g蔗糖、
0.5g吐溫-20 (T-20)、lg疊氮鈉(NaN3)和0.0lmol, pH為7.4的磷酸緩沖液，其余為水制成；
2)膠體金顆粒溶液的配制:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液50ml，微波加熱至煮沸，加入質(zhì)量濃度為1%檸檬酸三鈉水溶液600 μ L，加熱至出現(xiàn)酒紅色，再加入50ml、4°C預(yù)冷的電導(dǎo)率為18.25的純凈水，即成40nm膠體金顆粒溶液，膠體金顆粒溶液吸收峰波長為532_534nm ；Abs 大于 0.400 ；
3)膠體金標記抗體的配制:取膠體金顆粒溶液10ml，磁力攪拌條件下，加入體積濃度為30%的雙氧水水溶液32 μ L ;室溫磁力攪拌混合IOmin后，加入0.2Μ的碳酸鉀水溶液300 μ L,室溫磁力攪拌混勻IOmin后,加入0.2mg純化凍干的抗流感病毒單克隆抗體A1-6,抗流感病毒單克隆抗體A1-6凍干前緩沖液為0.01M, pH7.4的磷酸緩沖液；室溫磁力攪拌混勻60min后,加入0.1g牛血清白蛋白，室溫磁力攪拌混勻IOmin后,加入0.0lg聚乙二醇6000 (PEG6000),室溫磁力攪拌混勻30min，得金標抗體，將金標抗體移入離心管，在4°C，用Himac CR21G離心機濃縮,8000rpm,離心IOmin,棄去上清,酒紅色沉淀即為膠體金標記抗體；
4)金標抗體液的配制:膠體金標記抗體用膠體金稀釋液溶解以置換溶液體系，然后用膠體金稀釋液稀釋金標抗體，稀釋后的金標抗體標準為:最高吸收峰波長范圍532-534nm ；OD 大于 0.400Abs ；
所述的檢測線3和對照線5分別是由檢測抗體點膜液、對照抗體點膜液噴涂在反應(yīng)膜4上構(gòu)成:
O點膜稀釋液配制:是由0.0lmol/L、pH為7.4的磷酸緩沖液，0.15mol/L氯化鈉(NaCl), 10mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，lg/L疊氮鈉，30g/L的甲醇，余量為水制成；2)檢測抗體點膜液配制:將純化凍干的抗流感病毒單克隆抗體H1-24用點膜稀釋液稀釋至2mg/mL,抗流感病毒單克隆抗體H1-24純度大于90%,比活性大于10-5效價/mg蛋白；
3)對照抗體點膜液配制:將買來的山羊抗小鼠多抗(比活性大于10_7/mg蛋白)，用點膜稀釋液稀釋至0.8mg/mL ；
4)檢測線和對照線的制備:先將反應(yīng)膜貼到背襯的相應(yīng)位置，再用點膜機(韓感臺式點膜系統(tǒng)型號:TOTD)將檢測抗體點膜液及對照抗體點膜液劃到反應(yīng)膜上的相應(yīng)位置，檢測線和對照線的噴制均按每厘米檢測線用2μ L點膜液噴制，室溫晾干，即成；所述的反應(yīng)膜4的材質(zhì)是硝酸纖維素膜，型號為:MILLIPORE (美國)，Μ135 (有背襯)，制備時將反應(yīng)膜裁切成寬度為25mm的條；
所述的吸水墊6的材質(zhì)是加厚吸水紙，在一般的膠體金耗材公司即可買到，將加厚吸水紙裁切成寬度為26mm的條，然后將其粘貼到背襯相應(yīng)位置上即可。
[0018]所述的背襯7尺寸為77_X4mm。
[0019]所述的膠體金墊2尺寸為7mmX4mm。
[0020]所述的反應(yīng)膜4尺寸為25mmX4mm。
[0021]所述的檢測線3和對照線5尺寸為2-3mmX4mm。
[0022]所述的吸水墊6尺寸為26mmX4mm。
[0023]所述的樣品墊I 尺寸為22mmX4mm。
[0024]所述的試紙殼8上有樣本孔9和檢測結(jié)果區(qū)10。
[0025]所述的樣品墊I 一端扣壓住膠體金墊21mm,膠體金墊2 —端扣壓住反應(yīng)膜41mm,吸水墊6 —端扣壓住反應(yīng)膜41mm。
[0026]樣品墊上含有處理樣品成分的化學試劑，當含有流感病毒的樣品液滴到其上時，它會溶解樣品墊中的化學試劑，對樣品中的流感病毒進行裂解、調(diào)整反應(yīng)體系的離子強度和PH值等，并對非特異雜質(zhì)進行封閉，使其更符合抗原抗體反應(yīng)條件，有利于樣品中的病毒抗原與金墊上的抗體結(jié)合。金墊上含有膠體金標記的抗流感病毒特異性單克隆抗體及其相關(guān)化學試劑，顯示酒紅色。當這些膠體金標記的抗流感病毒特異性單克隆抗體在俘獲到流感病毒抗原后，隨著液體側(cè)向流，流感病毒抗原又與相應(yīng)的檢測線處的另一特異性抗流感病毒單克隆抗體結(jié)合而大量聚集，肉眼就可見紅色或粉紅色條帶。反應(yīng)膜上劃有檢測線和對照線，是免疫顯色反應(yīng)線的形成處。檢測線處固定有特異的抗流感病毒單克隆抗體，可以和隨液體側(cè)向流擴散過來的流感病毒抗原與膠體金標記的流感病毒單克隆抗體復(fù)合物結(jié)合，對流感病毒抗原形成雙抗體夾心，通過膠體金顯色，指示出檢測陽性帶。對照線處固定有羊抗鼠抗體，可以和未與檢測帶結(jié)合的膠體金標記的單克隆抗體結(jié)合(鼠源性單克隆抗體)，以確定反應(yīng)體系是正常的。吸收墊的作用是在反應(yīng)完全后對反應(yīng)體系多余液體進行吸收、存儲。
[0027]本發(fā)明甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙的組裝如下:背襯的作用是支撐整個試紙條，是一種常見的普通膠體金耗材，在金標耗材試劑公司都可以買到，背襯尺寸為77mmX 300mm。首先將反應(yīng)膜貼于背襯相應(yīng)位置，按反應(yīng)膜的制備方法完成反應(yīng)膜的制備后，將吸水墊參壓到反應(yīng)膜靠近背襯末端的一側(cè)，注意要參壓反應(yīng)膜Imm ;膠體金墊參壓到反應(yīng)膜的另一側(cè)，同樣要參壓反應(yīng)膜Imm ;樣品墊參壓到膠體金墊的另一側(cè)，同樣要參壓金墊Imm ;樣品墊區(qū)、膠體金墊區(qū)、反應(yīng)膜區(qū)和吸水墊區(qū)皆用強力膠固定于背襯上。當整個背襯按要求都貼好后，用切條機沿背襯橫截面方向?qū)⒃嚰埱谐?mm的窄條，這樣一個有檢測功能的試紙條就制備出來了。
[0028]本發(fā)明甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙檢測方法:
1.樣本收集
采集咽拭子時，病人坐下，頭后傾，張大嘴，由檢查者用壓舌板固定舌頭。用棉簽采集舌腭弓后，扁桃體隱窩至咽后壁，反復(fù)擦拭3?5次，收集粘膜細胞，避免觸及舌、口腔粘膜和唾液。采集鼻拭子時，將鼻拭子插入鼻孔分泌物較多處，輕輕轉(zhuǎn)動并推動鼻拭子，直至鼻甲(離鼻孔約2.5cm)受阻處，貼鼻壁旋轉(zhuǎn)拭子三次.采好樣品的拭子，置于預(yù)加有0.3 ml標本提取液的離心管中，漩渦振蕩混勻，置于4°C冰箱備用(樣品最多保存8h)。
[0029]2.檢驗方法
測試前請將所有試劑恢復(fù)至室溫，測試應(yīng)在室溫下進行。
[0030]I)樣本處理
a在離心管內(nèi)垂直加入300ul樣本提取液。
[0031]b將采樣后的鼻咽拭子插入樣本提取管的溶液內(nèi)，緊靠離心管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)約10次，使標本盡可能溶解在提取溶液中。
[0032]c沿離心管內(nèi)壁擠壓鼻拭子的棉簽頭，使液體盡可能留在管內(nèi)，取出并棄去鼻拭子。
[0033]d用鏇渦混合器混勻30秒,待用。
[0034]2)檢測程序
a沿鋁箔袋撕口處打開，將測試卡(即本發(fā)明試紙)取出平放。
[0035]b向測試卡的樣本孔中加入IOOul處理后的標本提取物。
[0036]c 15?20分鐘內(nèi)觀察顯示的結(jié)果，在20分鐘后顯示的結(jié)果無效。
[0037]3.檢驗結(jié)果的判讀(如圖3所示)
陽性:兩條紅色/粉色反應(yīng)線，即在檢測區(qū)(T)及質(zhì)控區(qū)(C)各出現(xiàn)一條紅色/粉色/棕色反應(yīng)線。
[0038]陰性:一條紅色/粉色反應(yīng)線，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紅色/粉色反應(yīng)線。
[0039]無效:質(zhì)控區(qū)(C)無紅色反應(yīng)線出現(xiàn)或檢測區(qū)(T)出現(xiàn)其他顏色的條帶，檢測無效，建議此時用新試卡重新檢測。
[0040]注:條帶顯色深淺與提取樣本中所含的被測物質(zhì)含量有關(guān)，不論顏色強度多少，都應(yīng)按照條帶是否顯色判斷結(jié)果。本發(fā)明內(nèi)含質(zhì)控過程，當C區(qū)出現(xiàn)紅色條帶，表明操作正確有效，否則測試無效。
[0041]表I PCR/ELISA/本發(fā)明膠體金檢測結(jié)果對照
【權(quán)利要求】
1.一種甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，包括試紙殼和試紙條，其特征在于，試紙條裝在試紙殼⑶內(nèi)，試紙條由樣品墊(I)、膠體金墊(2)、反應(yīng)膜(4)和背襯(7)構(gòu)成，背襯(7)中部粘貼有反應(yīng)膜(4)，反應(yīng)膜(4)上噴涂有檢測線(3)和對照線(5)，背襯(7)尾部粘貼有吸水墊(6)，吸水墊(6) —端扣壓在反應(yīng)膜(4) 一端上，背襯(7)上部粘貼有膠體金墊(2)，膠體金墊(2) —端扣壓在反應(yīng)膜(4)另一端上，靠膠體金墊(2) —端的背襯(7)頭部粘貼有樣品墊(1)，樣品墊(I) 一端扣壓在膠體金墊(2)另一端上。
2.權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙的制備方法，其特征在于，首先將反應(yīng)膜(4)粘貼到背襯(7)上，再將吸水墊(6)壓到反應(yīng)膜(4)靠近背襯末端的一側(cè)，膠體金墊(2)壓到反應(yīng)膜(4)的另一側(cè)，樣品墊(I)壓到膠體金墊(2)的另一側(cè)，樣品墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊皆用強力膠固定于背襯上，當整個背襯按要求都貼好后，用切條機沿背襯橫截面方向切成4_寬的條，即成甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙； 所述的樣品墊(I)由樣品處理液和玻纖膜構(gòu)成，每1000ml樣品處理液中含有20g牛血清白蛋白、5g曲拉通-100和0.01mol、pH為7.4的磷酸緩沖液，其余為水制成，把玻纖膜裁切成22_寬的條，每100 μ L樣品處理液噴涂0.8cm長的玻纖膜，37°C干燥過夜，得樣品墊(I); 所述的膠體金墊(2)包括玻纖膜和金標抗體液,將玻纖膜裁切成7mm寬的條,每100 μ L金標抗體液噴涂1.7cm長的玻纖膜，冷凍真空干燥或加入干燥劑自然涼干，然后靜置密閉容器平衡12小時，即成膠體金墊(2); 金標抗體液的制備: 1)膠體金稀釋液的配制:每1000ml膠體金稀釋液中含有IOg牛血清白蛋白、25g蔗糖、0.5g吐溫-20、Ig疊氮鈉和0.01mol、pH為7.4的磷酸緩沖液，其余為水制成； 2)膠體金顆粒溶液的配制:取質(zhì)量濃度為0.01%氯金酸水溶液50ml，微波加熱至煮沸，加入質(zhì)量濃度為1%檸檬酸三鈉水溶液600 μ L，加熱至出現(xiàn)酒紅色，再加入50ml、4°C預(yù)冷的電導(dǎo)率為18.25的純凈水，即成40nm膠體金顆粒溶液，膠體金顆粒溶液吸收峰波長為532_534nm ；Abs 大于 0.400 ； 3)膠體金標記抗體的配制:取膠體金顆粒溶液10ml，磁力攪拌條件下，加入體積濃度為30%的雙氧水水溶液32 μ L ;室溫磁力攪拌混合IOmin后，加入0.2Μ的碳酸鉀水溶液300 μ L,室溫磁力攪拌混勻IOmin后,加入0.2mg純化凍干的抗流感病毒單克隆抗體Α1-6,抗流感病毒單克隆抗體A1-6凍干前緩沖液為0.01M, pH7.4的磷酸緩沖液；室溫磁力攪拌混勻60min后，加入0.1g牛血清白蛋白，室溫磁力攪拌混勻IOmin后,加入0.01g聚乙二醇6000,室溫磁力攪拌混勻30min,得金標抗體,將金標抗體移入離心管,在4°C,用HimacCR21G離心機濃縮，8000rpm,離心10min,棄去上清,酒紅色沉淀即為膠體金標記抗體； 4)金標抗體液的配制:膠體金標記抗體用膠體金稀釋液溶解以置換溶液體系，然后用膠體金稀釋液稀釋金標抗體，稀釋后的金標抗體標準為:最高吸收峰波長范圍532-534nm ；OD 大于 0.400Abs ； 所述的檢測線(3)和對照線(5)分別是由檢測抗體點膜液、對照抗體點膜液噴涂在反應(yīng)膜⑷上構(gòu)成: O點膜稀釋液配制:是由0.01mol/L、pH為7.4的磷酸緩沖液，0.15mol/L氯化鈉，IOmoI/L乙二胺四乙酸，lg/L疊氮鈉，30g/L的甲醇，余量為水制成；2)檢測抗體點膜液配制:將純化凍干的抗流感病毒單克隆抗體H1-24用點膜稀釋液稀釋至2mg/mL,抗流感病毒單克隆抗體H1-24純度大于90%,比活性大于10-5效價/mg蛋白； 3)對照抗體點膜液配制:將比活性大于10_7/mg的山羊抗小鼠多抗用點膜稀釋液稀釋至 0.8mg/mL ； 4)檢測線和對照線的制備:先將反應(yīng)膜貼到背襯的相應(yīng)位置，再用點膜機將檢測抗體點膜液及對照抗體點膜液劃到反應(yīng)膜上的相應(yīng)位置，檢測線和對照線的噴制均按每厘米檢測線用2μ L點膜液噴制，室溫晾干，即成；所述的反應(yīng)膜(4)的材質(zhì)是硝酸纖維素膜，型號為:MILLIPORE，M135，制備時將反應(yīng)膜裁切成寬度為25mm的條； 所述的吸水墊(6)的材質(zhì)是加厚吸水紙,將加厚吸水紙裁切成寬度為26mm的條,然后將其粘貼到背襯相應(yīng)位置上即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的背襯(X)尺寸為77mmX4mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的膠體金墊⑵尺寸為7mmX4mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的反應(yīng)膜⑷尺寸為25mm X 4mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的檢測線⑶和對照線(5)尺寸為2-3mmX4mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的吸水墊(6)尺寸為26mm X 4mm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的樣品墊(I)尺寸為22mmX4mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的試紙殼(8)上有樣本孔(9)和檢測結(jié)果區(qū)(10)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒膠體金診斷檢測試紙，其特征在于，所述的樣品墊(I) 一端扣壓住膠體金墊⑵1mm，膠體金墊⑵一端扣壓住反應(yīng)膜⑷Imm,吸水墊(6)一端扣壓住反應(yīng)膜(4) 1_。
【文檔編號】G01N33/569GK103869067SQ201410128130
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】楊躍進, 胡軍, 鞏飚, 李元, 曹曉, 劉杰, 胡淮潔, 冉冉, 許姣 申請人:開封市疾病預(yù)防控制中心, 陜西瑞奇生物科技有限公司