開花作物授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法，包括柱頭染色、分離并收集花粉、載玻片的制作、掃描載玻片、利用計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量及顯微鏡下計(jì)數(shù)等步驟。本方法具有較高的準(zhǔn)確性和適用性，能夠較大程度地避免由于人為因素等造成的誤差，也可以經(jīng)適當(dāng)調(diào)整推廣至多種開花作物的柱頭花粉數(shù)量的統(tǒng)計(jì)上。
【專利說明】開花作物授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及開花作物授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桃是主要的溫帶水果之一，在全球范圍內(nèi)廣泛栽培，中國桃種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位。桃屬于時(shí)令性鮮果，不耐儲(chǔ)藏，而設(shè)施栽培技術(shù)可以通過改變影響桃樹生長的環(huán)境因子如光照、溫度、水分、CO2、土壤條件等，達(dá)到調(diào)節(jié)果實(shí)成熟期的目的，滿足消費(fèi)者對(duì)新鮮、無污染、反季桃的需求，同時(shí)，可為種植者帶來豐厚的利潤。
[0003]花期傳粉是影響開花作物座果結(jié)實(shí)的重要因素，桃花屬于典型的蟲媒花，昆蟲傳粉可以顯著提高桃產(chǎn)量。然而近十多年來，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，經(jīng)濟(jì)作物單一品種大規(guī)模種植模式(一縣一品或一村一品現(xiàn)象)逐步推廣，使得野生傳粉昆蟲喪失了周年棲息的食物源，往往導(dǎo)致主產(chǎn)區(qū)野生傳粉昆蟲數(shù)量急劇下降。桃樹花期較短，且主產(chǎn)區(qū)野生傳粉昆蟲較少，容易出現(xiàn)授粉不足現(xiàn)象。由于授粉不足而導(dǎo)致桃產(chǎn)量下降的現(xiàn)象在設(shè)施栽培中表現(xiàn)更為明顯。設(shè)施桃在生長過程中，尤其在花期前后，處于與外界相對(duì)隔離的環(huán)境中，空氣流動(dòng)性較差且缺乏自然傳粉昆蟲，因授粉受精不充分而導(dǎo)致的落花落果現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。為保障桃花充分授粉，提高產(chǎn)量，種植者在花期常采用人工方式或引入傳粉昆蟲為桃花授粉。雖然人工授粉可以顯著提高座果率，但是需要耗費(fèi)大量人力物力，與之相比，采用昆蟲為桃花授粉，不但可降低生產(chǎn)成本，而且可以提高桃產(chǎn)量，改善果實(shí)品質(zhì)，具有明顯優(yōu)勢(shì)。
[0004]在桃生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的傳粉昆蟲主要包括蜜蜂、熊蜂和壁蜂等幾大類，由于不同傳粉昆蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)習(xí)性等方面存在較大差異，導(dǎo)致其為桃樹授粉時(shí)效率不同，因而對(duì)桃樹最終產(chǎn)量造成影響；同時(shí)，授粉昆蟲配置數(shù)量也可影響桃樹座果情況。因此，在桃樹種植生產(chǎn)過程中，根據(jù)桃花開花生物學(xué)特點(diǎn)及種植環(huán)境，選擇傳粉效率較高的傳粉昆蟲并配備適當(dāng)數(shù)量的昆蟲進(jìn)行授粉，成為桃樹豐產(chǎn)栽培的必備環(huán)節(jié)。而在桃樹花期選擇合適指標(biāo)評(píng)價(jià)昆蟲的傳粉效率，并根據(jù)指標(biāo)及時(shí)對(duì)傳粉昆蟲的數(shù)量等進(jìn)行調(diào)控，無疑可以最大程度地提高桃樹產(chǎn)量。
[0005]目前對(duì)昆蟲傳粉效率的研究多集中在訪花頻率、訪花時(shí)間，接觸柱頭頻率，攜帶花粉量等指標(biāo)上。該類指標(biāo)雖然可以在一定程度上反映出不同昆蟲的訪花行為差異，但任一單個(gè)指標(biāo)均無法直接對(duì)桃的傳粉受精過程造成影響，不能有效地評(píng)價(jià)昆蟲傳粉效率。研究表明，植物雌蕊柱頭花粉沉降數(shù)量與座果率高度相關(guān)。在柱頭所能承受的花粉數(shù)量范圍內(nèi)，花粉沉降數(shù)量越多，越有利于受精過程的進(jìn)行，而成功的受精則是植物座果結(jié)實(shí)的前提。因此統(tǒng)計(jì)昆蟲訪花后桃花柱頭花粉沉降數(shù)量，可直接反映出昆蟲傳粉效率的高低。
[0006]目前檢測(cè)柱頭花粉沉降數(shù)量的方法主要包括直接在解剖鏡下觀察柱頭和使用鹽酸等溶液將花粉與柱頭分離，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)量。直接在顯微鏡下觀察柱頭并統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量需要鑒定者正確識(shí)別柱頭上的花粉粒，然而桃花花粉顏色與柱頭組織相似，并且花粉粒在柱頭萌發(fā)后吸附在柱頭表面不同位置，造成計(jì)數(shù)時(shí)難以觀察并辨別花粉粒，加之桃花柱頭上的花粉數(shù)量有時(shí)高達(dá)上千粒以上，導(dǎo)致工作量大，統(tǒng)計(jì)困難，不同鑒定者的統(tǒng)計(jì)結(jié)果往往存在較大誤差，無法保障結(jié)果的可靠性；利用特定溶液將花粉粒與柱頭分離，再使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，雖然避免了柱頭組織對(duì)花粉粒辨別的干擾并在一定程度上提高了可靠性，但是仍需要耗費(fèi)大量時(shí)間以肉眼統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量，且對(duì)人員操作性要求較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法，從而有效及快速評(píng)價(jià)傳粉昆蟲的傳粉效率。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法，包括柱頭染色、分離并收集花粉、載玻片的制作、掃描載玻片、利用計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量及顯微鏡下計(jì)數(shù)等步驟。
[0009]上述檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0010]I)柱頭染色:采集開花作物花期授粉后的柱頭置于離心管中，向離心管中加入孔雀石綠染色液進(jìn)行染色，收集染色液作為溶液I ;
[0011]2)分離并收集花粉:將柱頭轉(zhuǎn)移至另一盛有孔雀石綠染色液的平底試管中，利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎柱頭組織，實(shí)現(xiàn)花粉粒與柱頭的分離，收集染色液作為溶液II，用
0.85%-1.15% (優(yōu)選l%)NaCl溶液沖洗細(xì)胞破碎儀變幅桿上附著的花粉粒，收集沖洗液作為溶液III ;合并溶液1、II和III，用真空抽濾瓶將上述合并液中的花粉粒收集在濾膜上；
[0012]3)載玻片的制作及掃描:將花粉粒收集在濾膜上后，將濾膜載有花粉粒面朝上，平展貼服于滴有15%-40% (優(yōu)選30%)甘油溶液的載玻片上，制作成臨時(shí)裝片，用掃描儀將載玻片上的濾膜掃描為電子照片；
[0013]4)采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)濾膜上花粉粒數(shù)量，并將步驟2)中殘余的柱頭組織置于載玻片上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)殘留的花粉粒數(shù)量，濾膜上花粉粒數(shù)量與柱頭殘留的花粉粒數(shù)量之和，即為開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量。
[0014]在抽濾溶液分離花粉過程中，由于真空泵的使用，集液瓶中的連續(xù)負(fù)壓可形成抽動(dòng)力，在過濾裝置密閉性良好及過濾砂芯無堵塞的情況下，該力均勻地作用于濾膜表面，使得流經(jīng)濾膜的溶液與濾膜均勻接觸，從而確?；ǚ哿Ｅc溶液分離時(shí)受力均勻，花粉?？梢猿浞址稚⒌匚接跒V膜上；同時(shí)，在整個(gè)分離花粉過程中，由于經(jīng)過多次溶液抽濾，花粉粒不斷地懸浮分散、再吸附于濾膜上，提高了花粉粒的分散性，降低了花粉粒重疊的概率，避免了因花粉粒之間相互重疊可能導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)誤差。
[0015]前述的檢測(cè)方法，還包括用0.85%-1.15% (優(yōu)選l%)NaCl溶液沖洗步驟I)中所述的離心管，以收集附著于管壁上的花粉粒，作為溶液IV，以及用0.85%-1.15%(優(yōu)選l%)NaCl溶液沖洗步驟2)中所述的平底試管，以收集附著于管壁上的花粉粒，作為溶液V ;將溶液1、
I1、II1、IV和V合并后進(jìn)行真空抽濾。
[0016]本發(fā)明中使用的孔雀石綠染色液是由0.1%孔雀石綠溶液與0.85%-1.15% (優(yōu)選1%) NaCl溶液按1:400的體積比混合配制而成。
[0017]前述的檢測(cè)方法，步驟I)中染色時(shí)間為15h，染色溫度為37°C，以200rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)
行搖床震蕩染色。[0018]前述的檢測(cè)方法，步驟2)中利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎柱頭組織所設(shè)定的程序如下:全程超聲時(shí)間60s，超聲時(shí)間60s，間歇時(shí)間Os，溫度保護(hù)設(shè)定為50°C，超聲功率100W，變幅桿規(guī)格為Φ6。
[0019]前述的檢測(cè)方法，步驟3)中收集花粉所用真空抽濾瓶的過濾杯容積為300mL，集液瓶容積為2000mL，主體材質(zhì)為硼砂玻璃，砂芯過濾基座材質(zhì)為磨砂玻璃，過濾砂芯直徑為20mm ;濾膜材質(zhì)為尼龍，濾膜孔徑為10-30 μ m,濾膜形狀為20mm <直徑< 25mm的圓形，或20mm <邊長< 25mm的正方形；使用時(shí),將合并液倒入過濾杯中，經(jīng)真空抽濾,花粉粒吸附于濾膜上，殘余液體流經(jīng)濾膜和過濾砂芯，收集于集液瓶中。
[0020]前述的檢測(cè)方法，當(dāng)所述開花作物為桃時(shí)，步驟4)中采用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)濾膜上花粉粒數(shù)量，目標(biāo)顆粒色彩參數(shù)設(shè)定范圍為:色彩值120-150，飽和度70-255，亮度0-255，目標(biāo)顆粒大小設(shè)定值為40-80，圓形輪廓設(shè)定值為0.5-0.8。且步驟3)中濾膜孔徑為20 μ m。
[0021]本發(fā)明中涉及的開花作物花期授粉方式為昆蟲傳粉。
[0022]本發(fā)明提供的開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法，具有較高的準(zhǔn)確性和適用性，能夠較大程度地避免由于人為因素等造成的誤差，也可以經(jīng)適當(dāng)調(diào)整推廣至多種開花作物的柱頭花粉數(shù)量的統(tǒng)計(jì)上。
[0023](一)本方法在操作過程中能夠較大程度地降低或避免系統(tǒng)誤差。在收集花粉環(huán)節(jié)，收集了平底試管中的染色液、離心管中的染色液及沖洗液等中的花粉，有效提高統(tǒng)計(jì)結(jié)果準(zhǔn)確度，降低系統(tǒng)誤差。
[0024](二)本發(fā)明在花粉計(jì)數(shù)環(huán)節(jié)依據(jù)花粉本身特性，設(shè)定濾膜孔徑大小和軟件參數(shù)，提高了精確性，避免了由于觀察者個(gè)體間的差異造成的誤差。同時(shí)也可以選擇不同孔徑大小的濾膜及適當(dāng)調(diào)整軟件參數(shù)，將該方法推廣至其他作物的柱頭花粉數(shù)量的統(tǒng)計(jì)上，具有較強(qiáng)適用性。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0026]實(shí)施例檢測(cè)桃花柱頭花粉沉降數(shù)量的方法
[0027]包括以下步驟:
[0028]1、柱頭染色:在每只裝有樣品柱頭的1.5mL Eppendolf離心管中加入1.4mL孔雀石綠染色液(0.1%孔雀石綠與l%NaCl溶液按1:400體積比配制而成)，搖床震蕩染色15h(37°C，200rpm;較高的溫度使花粉粒容易著色，搖床震蕩確保染色均勻)，收集染色液作為溶液I。
[0029]2、分離花粉:使用潔凈鑷子取出柱頭，置于裝有IOmL孔雀石綠染色液的平底試管中，利用超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92-1I DN，中國)超聲處理柱頭組織(程序設(shè)定如下:全程時(shí)間60s，超聲時(shí)間60s，間歇時(shí)間Os，溫度保護(hù)設(shè)定為50°C，超聲功率100W，變幅桿規(guī)格為Φ6)，使花粉粒脫離柱頭，超聲結(jié)束后取出平底試管，收集染色液作為溶液II ;換另一潔凈平底試管置于變幅桿下端，防止變幅桿上殘留的染色液滴落而造成花粉粒數(shù)量損失，另外，用l%NaCl溶液沖洗變幅桿上附著的花粉粒，收集沖洗液作為溶液III。
[0030]3、收集花粉:經(jīng)過超聲處理，大部分花粉粒脫離柱頭并懸浮于染色液中，但仍有少數(shù)花粉?？赡芪皆谥^組織上以及盛裝器皿中，因此使用l%NaCl溶液沖洗柱頭、鑷子、離心管及平底試管，收集沖洗液作為溶液IV，合并上述溶液1、I1、III和IV，收集在過濾杯中進(jìn)行真空過濾，最后使用l%NaCl溶液沖洗過濾杯，再次進(jìn)行真空過濾，最終將柱頭表面花粉粒收集于濾膜上(真空過濾瓶型號(hào)為FB-20T，中國天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)，其中過濾杯規(guī)格300mL，集液瓶規(guī)格2000mL，主體材質(zhì)為硼砂玻璃，砂芯過濾基座材質(zhì)為磨砂玻璃，砂芯直徑為20mm ;過濾膜型號(hào)為03-20/3,其材質(zhì)為尼龍,孔徑20 μ m,瑞士賽發(fā)公司生產(chǎn)，將濾膜裁剪成20mmX20mm方塊，覆蓋在過濾砂芯上方，以承載花粉粒；真空抽濾泵型號(hào)為2522Z-02，美國WELCH公司生產(chǎn))。
[0031]將經(jīng)NaCl溶液沖洗的柱頭組織置于載玻片上，在顯微鏡下檢查是否仍有殘余花粉粒，若花粉殘余量少且在顯微鏡下可進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，則直接對(duì)殘余花粉粒進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄，若花粉殘余量過大，無法進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，則按照上述方法重新超聲處理柱頭。
[0032]4、掃描花粉:使用移液器在潔凈的載玻片中央滴30μ L30%甘油溶液，使用潔凈鑷子取出載有花粉粒的濾膜，平貼在載玻片中央，使甘油溶液浸濕濾膜，要求濾膜平整，無氣泡。使用可以掃描玻片的掃描儀將載玻片上的濾膜掃描為電子照片(掃描儀型號(hào)尼康Coolscan9000ED,日本)。
[0033]5、軟件計(jì)數(shù):利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)濾膜上花粉粒數(shù)量，具體參數(shù)設(shè)定如下:色調(diào)值為120-150，飽和度值為70-255，亮度:0-255，目標(biāo)顆粒物大小值為40-80，圓形輪廓值為
0.5-0.8,得出濾膜上花粉粒數(shù)量,與柱頭剩余花粉粒數(shù)量相加,得出柱頭花粉沉降數(shù)量。
[0034]本發(fā)明的一種用于桃花柱頭花粉沉降數(shù)量的檢測(cè)方法，依據(jù)桃花粉粒的形狀、大小及花粉粒及柱頭組織的不同染色特性進(jìn)行設(shè)計(jì)，在較大程度上避免了人為操作誤差，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性，也適用于其他開花作物柱頭花粉沉降數(shù)量的檢測(cè)。
[0035]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量的檢測(cè)方法，其特征在于，包括柱頭染色、分離并收集花粉、載玻片的制作、掃描載玻片、利用計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量及顯微鏡下計(jì)數(shù)的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: O柱頭染色:采集開花作物花期授粉后的柱頭置于離心管中，向離心管中加入孔雀石綠染色液進(jìn)行染色，收集染色液作為溶液I ; 2)分離并收集花粉:將柱頭轉(zhuǎn)移至另一盛有孔雀石綠染色液的平底試管中，利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎柱頭組織，實(shí)現(xiàn)花粉粒與柱頭的分離，收集染色液作為溶液II，用0.85%-l.15%NaCl溶液沖洗細(xì)胞破碎儀變幅桿上附著的花粉粒，收集沖洗液作為溶液III ；合并溶液1、II和III，用真空抽濾瓶將上述合并液中的花粉粒收集在濾膜上； 3)載玻片的制作及掃描:將花粉粒收集在濾膜上后，將濾膜載有花粉粒面朝上，平展貼服于滴有15%-40%甘油溶液的載玻片上，制作成臨時(shí)裝片，用掃描儀將載玻片上的濾膜掃描為電子照片； 4)采用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)濾膜上花粉粒數(shù)量，并將步驟2)中殘余的柱頭組織置于載玻片上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)殘留的花粉粒數(shù)量，濾膜上花粉粒數(shù)量與柱頭殘留的花粉粒數(shù)量之和，即為開花作物花期授粉后柱頭花粉數(shù)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述孔雀石綠染色液是由0.1%孔雀石綠溶液與0.85%-l.15%NaCl溶液按1:400的體積比混合配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟I)中染色時(shí)間為15h，染色溫度為37°C，以200rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行搖床震蕩染色。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)中利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎柱頭組織所設(shè)定的程序如下:全程超聲時(shí)間60s，超聲時(shí)間60s，間歇時(shí)間Os，溫度保護(hù)設(shè)定為50°C，超聲功率100W，變幅桿規(guī)格為Φ6。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)中收集花粉所用真空抽濾瓶的過濾杯容積為300mL，集液瓶容積為2000mL，主體材質(zhì)為硼砂玻璃，砂芯過濾基座材質(zhì)為磨砂玻璃，過濾砂芯直徑為20mm ;濾膜材質(zhì)為尼龍,濾膜孔徑為10-30 μ m,濾膜形狀為20mm<直徑< 25mm的圓形,或20mm <邊長< 25mm的正方形；使用時(shí)，將合并液倒入過濾杯中，經(jīng)真空抽濾，花粉粒吸附于濾膜上，殘余液體流經(jīng)濾膜和過濾砂芯，收集于集液瓶中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述開花作物為桃。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟4)中采用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)濾膜上花粉粒數(shù)量時(shí)，目標(biāo)顆粒色彩參數(shù)設(shè)定范圍為:色彩值120-150，飽和度70-255，亮度0-255，目標(biāo)顆粒大小設(shè)定值為40-80，圓形輪廓設(shè)定值為0.5-0.8。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)中濾膜孔徑為20μ m。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，開花作物花期授粉方式為昆蟲傳粉。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK103868842SQ201410047329
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】張紅, 安建東, 黃家興, 周志勇, 蓋琴寶 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所