一種微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，包括下列步驟：(1)樣品前處理；(2)富集和凈化；（3）LC-MS/MS檢測。本發(fā)明的方法操作簡便、定性定量能力較強，可作為檢測水質(zhì)量和評估食品安全風險的可靠方法。
【專利說明】一種微囊藻毒素的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，屬于儀器檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]藻類保健食品是一種主要由藻類單細胞植物粉為主要成分，加入少量賦形劑或單純用藻粉為原料制成的保健食品。目前主要的食用藻類以螺旋藻為代表。螺旋藻含有豐富的蛋白質(zhì)，礦物質(zhì)(鈣、鐵、鋅、磷、鎂和碘等)，維生素(B1、B2、B12、C、E、K等)和β -胡蘿卜素、Y -亞油酸、葉綠素以及各種對人體健康有用的氨基酸。
[0003]通過人工方法培養(yǎng)螺旋藻是目前生產(chǎn)藻類保健食品的主要方式，而可以產(chǎn)生毒素的銅綠微囊藻、綠色微囊藻、惠氏微囊藻、以及顫藻、魚腥藻等和螺旋藻都屬于藍藻。從理論上講，在嚴格的培養(yǎng)條件下可以控制產(chǎn)毒藍藻的生長。但是由于目前國內(nèi)螺旋藻生產(chǎn)企業(yè)的藻漿是在開放環(huán)境下培養(yǎng)、收獲的，在生產(chǎn)過程中，養(yǎng)殖池水和螺旋藻漿都極有可能受到產(chǎn)毒藍藻的污染，在收獲螺旋藻漿液的同時收獲了產(chǎn)毒藍藻，由于對螺旋藻漿的洗脫不能完全去除產(chǎn)毒藍藻，而由產(chǎn)毒藍藻產(chǎn)生的微囊藻毒素就會污染藻類保健食品，從而對人類健康造成嚴重危害。
[0004]微囊藻毒素以肝臟為靶器官，能促使腫瘤細胞的生長，是迄今為止已發(fā)現(xiàn)的最強肝癌促進劑之一。我國部分地區(qū)的原發(fā)肝癌發(fā)病率高與當?shù)鼐用耖L期接觸微囊藻毒素有關(guān)。微囊藻毒素是一類環(huán)狀七肽化合物，目前發(fā)現(xiàn)有大約60種異構(gòu)體，在我國富營養(yǎng)化水體中常見的種類為MC-LR和MC-RR，其中MC-RR最常見，而MC-LR毒性最大。
[0005]目前關(guān)于微囊藻毒素的提取和檢測方法也比較多，也有用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測，但之前的檢測方法中，樣品的前處理步驟毒素提取不完全，且有其他雜質(zhì)干擾。尤其是針對藻類樣品，目前現(xiàn)有前處理方法對于色素的去除非常有限，導(dǎo)致在質(zhì)譜檢測上出現(xiàn)較為明顯的基質(zhì)效應(yīng)，從而降低檢測靈敏度和準確度。此外，由于微囊藻毒素具有多肽類結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)中存在羥基與氨基等極性基團，極易生成[Μ+Η]+與[Μ+2Η]2+離子。
[0006]建立一種快速可靠的藻類保健食品中微囊藻毒素的檢測方法，對保證藻類保健食品的安全性，促進生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新，提高國產(chǎn)藻類保健食品質(zhì)量和檔次，保障人民群眾的身體健康具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種操作簡便、定性定量能力較強的微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0009]一種微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，包括下列步驟:
[0010](I)樣品前處理
[0011]準確稱取經(jīng)過粉碎、均質(zhì)過的藻類保健品1.0g，用10mL60%甲醇水溶液提取毒素，200rpm搖床震蕩60min,再超聲處理30min, 20°C以下8000rpm離心10min,取上清液；
[0012]以2mol/L甲酸調(diào)節(jié)上清液pH值至4.0，靜置3h可觀察到溶液中出現(xiàn)大量絮狀沉淀，20°C以下8000rpm離心10min,得到淺黃色上清液或無色透明液,溶液中加入稀氨水將PH值調(diào)至7.0,隨后加入超純水準確定容至30mL，此時得到較為純凈的粗提液；
[0013](2)富集和凈化
[0014]首先以IOmL甲醇和IOmL超純水活化C18固相萃取柱，活化過程流速控制在1_2滴/秒，取15mL粗提液注入C18固相萃取柱進行富集，流速控制在I滴/秒，接著再分別以20%和30%甲醇水溶液各IOmL淋洗C18固相萃取柱，以去除雜質(zhì)，最后以5mL70%甲醇水溶液(含有0.05%甲酸)洗脫微囊藻毒素，氮氣吹至近干，以50%乙腈水溶液定容至0.5mL，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測；
[0015]固相提取柱可以起到很好的富集、凈化效果，文獻報道多用甲醇洗脫，回收率較好。本發(fā)明中，在以純甲醇作為洗脫液的情況下發(fā)現(xiàn)MC-LR回收率較好，而MC-RR的回收率極低。在甲醇中添加0.05%濃度的甲酸后再次進行回收率實驗，發(fā)現(xiàn)MC-RR的回收率顯著改善。
[0016](3) LC-MS/MS 檢測
[0017]液相條件Waters Atlantis dC18 色譜柱(2.1mmX 150mm, 5 μ m),柱溫 30°C ;進樣量20 μ L ;流動相A為水(含有0.05%甲酸，5mmol/L甲酸銨)，B為95%乙腈(含有0.05%甲酸，5mmol/L甲酸銨)；梯度洗脫條件見表1:
[0018]表1梯度洗脫條件
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)樣品前處理 準確稱取經(jīng)過粉碎、均質(zhì)過的藻類保健品1.0 g，用10 mL 60 %甲醇水溶液提取毒素，200 rpm搖床震蕩60 min,再超聲處理30 min, 20 °C以下8000 rpm離心10 min,取上清液； 調(diào)節(jié)上清液PH值至4.0，靜置3 h可觀察到溶液中出現(xiàn)大量絮狀沉淀，20 °C以下8000 rpm離心10 min，得到淺黃色上清液或無色透明液，溶液中加入稀氨水將pH值調(diào)至6.8-7.2，隨后加入超純水準確定容至30 mL，此時得到較為純凈的粗提液； (2)富集和凈化 首先以10 mL甲醇和10 mL超純水活化C18固相萃取柱，活化過程流速控制在1-2滴/秒，取15 mL粗提液注入C18固相萃取柱進行富集，流速控制在I滴/秒，接著再分別以20%和30 %甲醇水溶液各10 mL淋洗C18固相萃取柱，以去除雜質(zhì)，最后以5 mL 70 %甲醇水溶液(含有0.05 %甲酸)洗脫微囊藻毒素，氮氣吹至近干，以50 %乙腈水溶液定容至0.5mL，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測；
(3)LC-MS/MS 檢測 液相條件 Waters Atlantis dC18 色譜柱(2.1 mmX 150 πιπι,5μηι),柱溫 30 °C ;進樣量20 μ L ;流動相A為水(含有0.05%甲酸，5 mmol/L甲酸銨)，B為95 %乙腈(含有0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)；梯度洗脫； 質(zhì)譜條件離子化方式為電噴霧離子化正模式(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);碰撞氣壓力(CAD):8 ;氣簾氣壓力(CUR):15 ;電噴霧電壓(IS):5000 V ;離子源溫度(TEM):600 °C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，步驟(I)溶液中加入稀氨水將PH值調(diào)至7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，步驟(I)中以2 mol/L甲酸調(diào)節(jié)上清液pH值至4.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微囊藻毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，步驟(3)中以[M+2H]2+離子作為母離子。
【文檔編號】G01N30/02GK103940921SQ201410011060
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】吳振興, 賈俊濤, 肖西志, 鄧明俊, 靜平, 許艷麗 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心