專利名稱：一種快速檢測egcg的電化學傳感器的電聚合制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及活性成分分析檢測領域技術，具體是一種快速檢測EGCG的電化學傳感器及其電聚合制備方法。
背景技術：
沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)主要存在與茶屬植物中，以綠茶中含量最高，是綠茶茶多酚的主要成分，也是綠茶兒茶素的主成分，占綠茶中兒茶素總量的50 %左右。EGCG具有廣泛的生物活性，如清除自由基、抗氧化、抗癌、延遲衰老、預防心血管疾病、抗突變、降脂減肥和防輻射、增強口腔健康等多種保健和藥理作用，是茶中的主要活性成分。茶的品質和價格在一定程度上由EGCG的含量決定，因此，建立一種快速便捷的檢測茶及其制品中EGCG含量的方法具重要的現實和經濟意義。
目前，茶葉成分分析多采用高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳(CE)法。2010年，楊志勇等利用毛細管電泳-安培檢測法同時測定烏龍茶湯中生理活性成分糖、氨基酸和EGCG的含量；2010年，王琳等用HPLC-DAD同時檢測了茶葉中10種兒茶素單體、沒食子酸、可可堿、咖啡堿和茶堿等有效生化成分的含量。上述兩種方法均有準確、高效的特點。但是這兩種檢測方法都需要對分析樣品進行復雜的前處理，耗費時間長，不適于EGCG成分的現場分析檢測。因此，發(fā)展建立一種實時檢測EGCG含量的方法是十分必要的。分子印跡技術具有優(yōu)越的預定性、識別性以及實用性，同時因其制備的分子印跡聚合物具有親和力和選擇性高、抗惡劣環(huán)境能力強、穩(wěn)定性好、使用壽命長等優(yōu)點，使得分子印跡技術在仿生傳感器領域形成廣泛的應用。但目前用電聚合法制備EGCG分子印跡膜傳感器及其應用研究尚未見報道。本發(fā)明以鄰苯二胺為功能單體，以EGCG為模板分子，基于CHI 660D電化學工作站，用電聚合法，構建了對EGCG具有專一選擇特性的分子印跡電化學傳感器，并以K3[Fe (CN) ]6為印跡電極和測試液間的探針，實現了對茶湯樣品中EGCG含量的快速檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現有EGCG分析檢測技術的不足，通過表面分子印跡技術、膜技術與電化學傳感器的交叉研究，基于聚鄰苯二胺膜修飾電極，采用電化學聚合法制備出EGCG分子印跡傳感器。該電化學傳感器可以實現快速，實時，現場和在線檢測EGCG，具有成本低、靈敏度高、分析速度快、重復性高等優(yōu)點。本發(fā)明涉及一種快速檢測EGCG的電化學傳感器的電聚合制備方法，按照下述步驟進行
(I)玻碳電極的預處理玻碳電極依次用粒徑為O. 3 Mm和O. 05 Mm的氧化鋁拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗掉表面附著的氧化鋁粉末后，依次置于超純水、無水乙醇中超聲洗滌3-5min，循環(huán)3-6次，洗去電極表面的殘留物之后；對電極進行電化學活化，即將電極置于含5mmol/L K3 [Fe (CN)6]和O. 2 mol/L KCl的磷酸緩沖液，(預先充氮氣5-10 min以脫除溶液中的氧氣)中，于0-0. 8 V電壓范圍內進行循環(huán)伏安掃描，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應，如得到的循環(huán)伏安圖具有標準可逆的氧化還原峰(峰電流比約為1:1，峰電流差值小于90 mV),則預處理成功。(2 )電聚合印跡膜修飾電極以玻碳電極為工作電極,鄰苯二胺(ο -PD )為功能單體，氯化鉀為支持電解質；將三電極體系(玻碳電極為工作電極，Pt電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極)置于含5-10 mmol/L鄰苯二胺、O. 1-0.4 mmol/LEGCG和O. 2 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 4. 5-5. 5)中，基于CHI 660D電化學工作站，循環(huán)伏安掃描聚合速度為25-75 11^/8、電位范圍為0-0.8 V時，循環(huán)掃描聚合循環(huán)10-25圈。當電極表面與鄰苯二胺接觸，發(fā)生氧化還原反應，故有電流響應；當鄰苯二胺的氨基與EGCG分子上的酚羥基發(fā)生作用，阻礙了鄰苯二胺與電極的接觸，使電極表面產生的峰電流響應越來越小，直到接近于 O。即得到嵌有EGCG的不導電聚合膜電極。將嵌有EGCG的不導電聚合膜電極作為工作電極、Pt電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，將三電極體系分別置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和O. 2 mol/L KCl的測試液(pH 4. 5-5. 5)中，基于CHI 660D電化學工作站，使用循環(huán)伏安法(CV)對印跡電極和非印跡電極進行表征。其初始電壓范圍在-0.2-0. 8V內，掃描速率為100 mV/s，靜息時間為2 s,靈敏度為1X10_5 A/V。聚合后的印跡玻碳電極和非印跡玻碳電極均無氧化還原峰，說明聚合后的玻碳電極表面覆蓋著緊密的聚合膜，此聚合膜阻止了 K3[Fe(CN)6]探針分子進入其表面發(fā)生氧化還原反應，故沒有任何氧化還原峰的存在。而單純的玻碳電極具有明顯的一對氧化還原峰。(3)模板分子洗脫將步驟(2)中所得嵌有EGCG的不導電聚合膜電極置于甲醇/乙酸溶液(7:1-10:1，V: V)中,60-200 r/min磁力攪拌下洗脫5_15 min,萃取出模板分子EGCG后，在聚鄰苯二胺膜上形成具有特殊識別位點的空穴，即得到EGCG分子印跡膜修飾電極，并用氮氣吹干，備用。EGCG的電化學傳感器是以EGCG分子印跡膜修飾電極探針為工作電極、Pt電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，將三電極體系分別置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0. 2mol/L KCl的測試液(pH 4. 5-5. 5)中，基于CHI 660D電化學工作站，用示差脈沖伏安法(DPV)掃描，K3Fe(CN)6*子可以通過孔穴擴散至傳感器表面，并發(fā)生電化學反應產生電流響應值。如果測試液中含有EGCG分子，EGCG會特異地與孔穴位點結合，阻止了 K3Fe (CN)6分子進入空穴，導致峰電流響應值變小，所以可通過峰電流響應值的變化反映EGCG分子的濃度。每次檢測結束后將分子印跡電極在甲醇/乙酸(7:1-10:1，V:V)溶液中洗脫10-13min，即可進行下一次檢測。
本發(fā)明的有益效果
(1)本發(fā)明將分子印跡聚鄰苯二胺膜修飾到玻碳電極表面的方法操作簡單，用電化學方法直接將不導電的分子印跡膜修飾到電極表面，減少了其他物質對電化學信號的干擾；
(2)本發(fā)明所述分子印跡膜修飾電極由于其表面具有特異性識別EGCG的空穴，大大提高了傳感器的檢測選擇性，有效的避免模板分子的結構類似物對檢測結果的影響；
(3)本發(fā)明所述分子印跡膜修飾電極表面的分子印跡膜對模板分子EGCG具有預富集作用，有效提高了分析方法的靈敏度，檢測范圍為5·0Χ10_7-1·0Χ10_4 mol/L，最低檢測限為 I. 6 X 10 7 mol/L ；
(4)本發(fā)明所述分子印跡膜修飾電極對EGCG響應迅速，檢測速度快，完成一個樣品的測定只需要10-16 min，可在短時間內完成大量樣品的檢測；
(5)本發(fā)明所述的分子印跡膜修飾電極還具有制備簡單、成本低、重復性好等優(yōu)點；
(6)本發(fā)明所述分子印跡膜修飾電極做為感應元件的電化學傳感器可用于實時監(jiān)測茶及其制品的加工過程中EGCG含量的變化情況，并為預測茶及其制品的質量提供參考。


圖I EGCG分子印跡膜修飾電極制作圖解；
圖2 EGCG電化學傳感器對不同濃度EGCG樣品的PDV響應，(A) DPV響應曲線；(B)標準曲線。
具體實施例方式實施例I
玻碳電極依次用粒徑O. 3 Mffl和O. 05 Mffl氧化鋁拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗掉表面附著的氧化鋁粉末后，依次置于超純水、無水乙醇中超聲洗滌3 min，循環(huán)3次，洗去電極表面的殘留物之后，對電極進行電化學活化，即將電極置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和O. 2 mol/LKCl的磷酸緩沖液(預先充氮氣8 min去除氧氣)中，于0-0. 8 V電壓范圍內進行循環(huán)伏安掃描，直
到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應。以玻碳電極為工作電極，鄰苯二胺(o-PD)為功能單體，氯化鉀為支持電解質。將三電極體系置于含5 mmol/L鄰苯二胺，O. I mmol/L EGCG和0.2mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 2)中，基于CHI 660D電化學工作站，在掃描速度為50mV/s、電位范圍為0-0. 8 V時，循環(huán)掃描電聚合15圈，即得到EGCG為模板的不導電聚合膜電極。將所得電
極置于40 mL甲醇/乙酸(9:1，V: V)中磁力攪拌(120 r/min)洗脫10 min,萃取出EGCG分子后，氮氣吹干，即得到EGCG分子印跡膜修飾電極，具體制備過程如圖1，其中“ ”代表印跡分子EGCG，“I”代表K3 [Fe (CN) 6]。實際樣品檢測稱取千島玉茶0.2003 g置于燒杯中，用80°C超純水100 mL浸泡3h，離心過濾之后用超純水稀釋10倍得茶湯；依次向茶湯中加入濃終度分別為5 mmol/L和
0.2 mol/L的K3 [Fe (CN)6]和KC1。以分子印跡膜修飾電極作為工作電極，Pt電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極?；贑HI 660D電化學工作站，用示差脈沖伏安法(DPV)掃描樣品，響應時間為11 min，其峰電流值為7.833 μΑ，根據圖2A不同濃度EGCG的PDV響應曲線和圖2Β標準曲線計算樣品中EGCG的含量為4. 178Χ 1(T2 mmol/L。為了進一步驗證方法的準確度，在以上樣品中加入EGCG標準溶液，進行加標回收測定，檢測方法同上。其加標量為0.01 mmol/L，加標回收率98. 6%。實施例2
玻碳電極依次用粒徑0.3 Mffl和0.05 Mffl氧化鋁拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗掉表面附著的氧化鋁粉末后，依次置于超純水、無水乙醇中超聲洗滌5 min，循環(huán)6次，洗去電極表面的殘留物。之后對電極進行電化學活化，即將電極置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0. 2 mol/L KCl的磷酸緩沖液(預先充氮氣10 min去除氧氣)中，于0-0. 8 V電壓范圍內進行循環(huán)伏安掃描，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應。以玻碳電極為工作電極，鄰苯二胺(o-PD)為功能單體，氯化鉀為支持電解質。將三電極體系置于含10 mmol/L鄰苯二胺，O. 3 mmol/LEGCG和O. 2 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 5)中，基于CHI 660D電化學工作站，在掃描速度為50 11^/8、電位范圍為0-0.8 V時，循環(huán)掃描聚合20圈，即得到EGCG為模板的不導電聚合膜電極。將所得電極置于30 mL甲醇/乙酸(8:1，V:V)中磁力攪拌(100 r/min)洗脫15 min，萃取出EGCG分子后，氮氣吹干，即得到EGCG分子印跡膜修飾電極，具體制備過程如圖I，其中“ + ”代表印跡分子EGCG，“_，，代表K3[Fe (CN) 6]。實際樣品檢測稱取龍井茶O. 2010 g置于燒杯中，用80°C超純水100 mL浸泡3 h，離心過濾之后用超純水稀釋10倍得茶湯；依次向茶湯中加入濃終度分別為5 mmol/L和O. 2mol/L的K3[Fe (CN)6]和KC1。以分子印跡膜修飾電極作為工作電極，Pt電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極?；贑HI 660D電化學工作站，用示差脈沖伏安法(DPV)掃描樣品，響應時間為11 min，其峰電流值為7. 978 μΑ，根據圖2Α不同濃度EGCG的PDV響應曲線和圖2Β標準曲線計算樣品中EGCG的含量為4. 633 X IO-2 mmol/L。 為了進一步驗證方法的準確度，在以上樣品中加入EGCG標準溶液，進行加標回收測定，檢測方法同上。其加標量為0. 01 mmol/L，加標回收率102. 2%。實施例3
玻碳電極依次用0. 3 Mm和0. 05 Mm氧化招懸池液麂皮上拋光成鏡面,用蒸懼水沖洗掉表面附著的氧化鋁粉末后，依次置于超純水、無水乙醇中超聲洗滌5 min，循環(huán)6次，洗去電極表面的殘留物。之后對電極進行電化學活化，即將電極置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和
0.2 mol/L KCl的磷酸緩沖液(預先充氮氣10 min去除氧氣)中，于0-0. 8 V電壓范圍內進行循環(huán)伏安掃描，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應。以玻碳電極為工作電極，鄰苯二胺(o-PD)為功能單體，氯化鉀為支持電解質。將三電極體系置于含10 mmol/L鄰苯二胺，0.3 mmol/LEGCG和0. 2 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 5)中，基于CHI 660D電化學工作站，在掃描速度為50 11^/8、電位范圍為0-0.8 V時，循環(huán)掃描聚合20圈，即得到EGCG為模板的不導電聚合膜電極。將所得電極置于30 mL甲醇/乙酸(8:1，v:v)中磁力攪拌(100 r/min)洗脫15 min，萃取出EGCG分子后，氮氣吹干，即得到EGCG分子印跡膜修飾電極，具體制備過程如圖I，其中“ ”代表印跡分子EGCG，“_，，代表K3[Fe (CN) 6]。實際樣品檢測稱取白茶0. 2005 g置于燒杯中，用80°C超純水100 mL浸泡3 h，離心過濾之后用超純水稀釋10倍得茶湯；依次向茶湯中加入濃終度分別為5 mmol/L和0. 2mol/L的K3[Fe (CN)6]和KC1。以分子印跡膜修飾電極作為工作電極，Pt電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極。基于CHI 660D電化學工作站，用示差脈沖伏安法(DPV)掃描樣品，響應時間為11 min，其峰電流值為7. 481 μΑ，根據圖2Α不同濃度EGCG的TOV響應曲線和2Β圖標準曲線計算樣品中EGCG的含量為3. 065 X IO-2 mmol/L。為了進一步驗證方法的準確度，在以上樣品中加入EGCG標準溶液，進行加標回收測定，檢測方法同上。其加標量為0.01 mmol/L，加標回收率99. 3%。
權利要求
1.一種快速檢測EGCG的電化學傳感器的電聚合制備方法，其特征在于按照下述步驟進行 (1)玻碳電極的預處理玻碳電極依次用粒徑為0.3 Mm和0. 05 Mm的氧化鋁拋光成鏡面，用蒸餾水沖洗掉表面附著的氧化鋁粉末后，依次置于超純水、無水乙醇中超聲洗滌3-5min，循環(huán)3-6次，洗去電極表面的殘留物之后；對電極進行電化學活化，即將電極置于預先充氮氣5-10 min以脫除溶液中的氧氣的含5 mmol/L K3 [Fe (CN) 6]和0. 2 mol/L KCl的磷酸緩沖液中，于0-0. 8 V電壓范圍內進行循環(huán)伏安掃描，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應，如得到的循環(huán)伏安圖具有標準可逆的氧化還原峰即峰電流比約為1:1，峰電流差值小于90 mV,則預處理成功； (2)電聚合印跡膜修飾電極以玻碳電極為工作電極，鄰苯二胺(o-PD)為功能單體，氯化鉀為支持電解質；將玻碳電極為工作電極，Pt電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極的三電極體系置于pH 4. 5-5. 5的含5-10 mmol/L鄰苯二胺、0. 1-0. 4 mmol/LEGCG和0. 2mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液中，基于CHI 660D電化學工作站，循環(huán)伏安掃描聚合速度為25-75 mV/s、電位范圍為0-0. 8 V時，循環(huán)掃描聚合循環(huán)10-25圈；當電極表面與鄰苯二胺接觸，發(fā)生氧化還原反應，故有電流響應；當鄰苯二胺的氨基與EGCG分子上的酚羥基發(fā)生作用，阻礙了鄰苯二胺與電極的接觸，使電極表面產生的峰電流響應越來越小，直到接近于0;即得到嵌有EGCG的不導電聚合膜電極； 將嵌有EGCG的不導電聚合膜電極作為工作電極、Pt電極為對電極、Ag/AgCl電極為參比電極，將三電極體系分別置于pH 4. 5-5. 5的含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0. 2 mol/L KCl的測試液中，基于CHI 660D電化學工作站，使用循環(huán)伏安法對印跡電極和非印跡電極進行表征； 其初始電壓范圍在-0.2-0. 8V內，掃描速率為100 mV/s，靜息時間為2 S，靈敏度為1X I (T5 A/V ； (3)模板分子洗脫將步驟(2)中所得嵌有EGCG的不導電聚合膜電極置于體積比為7:1-10:1的甲醇/乙酸溶液中，60-200 r/min磁力攪拌下洗脫5-15 min,萃取出模板分子EGCG后，在聚鄰苯二胺膜上形成具有特殊識別位點的空穴，即得到EGCG分子印跡膜修飾電極。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測EGCG的電化學傳感器的電聚合制備方法，涉及農產品活性成分分析檢測領域技術。該方法主要包括玻碳電極的預處理、玻碳電極表面的電聚合成膜、模板分子的洗脫，即得到EGCG分子印跡膜修飾電極；結合電化學工作站該傳感器可用于含有EGCG真實樣品的快速檢測。本發(fā)明具有如下優(yōu)點選擇性高，操作效率高，傳感器的穩(wěn)定性好，可以循環(huán)使用，成本低廉、適合快速、實時、現場檢測。本發(fā)明適用于茶及其制品中主要活性成分EGCG含量的快速檢測以及茶或茶制品的品質評價。
文檔編號G01N27/30GK102809592SQ20121024154
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月13日 優(yōu)先權日2012年7月13日
發(fā)明者段玉清, 羅孝平, 張海暉, 秦宇, 蔡健榮, 馬海樂 申請人:江蘇大學