專利名稱：乳腺癌診斷學(xué)的制作方法
乳腺癌診斷學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳腺癌診斷學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳腺癌是人中最常見的癌之一，且會在US和歐洲通常影響達8分之一的在她們的生命時間的女性。Women’s Health Initiative (WHI)和 Million Women Study 顯不了激素替代治療(HRT)相關(guān)于增加的偶發(fā)和致死的乳腺癌的風(fēng)險。尤其是，百萬女性在HRT和避孕藥中使用的合成黃體酮衍生物(孕酮)諸如乙酸甲羥孕酮(MPA)顯著地增加發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險。NF- κ B配體的受體活化物(RANKL,也被稱為ODF, TRANCE, OPGL, TNFSFl I)和其受體RANK (TRANCE-R，TNFRSF11A)對于破骨細胞的發(fā)育和活化必要。RANKL抑制在為潛在地百萬患者預(yù)防骨損失的批準的邊緣。已克隆及表征RANK和RANKL( US6，017，729，EP087399
8,EP0911342, US5, 843, 678, W098/46751, W098/54201)o 已在人中的原發(fā)性乳腺癌和乳腺癌細胞系中觀察到RANKL和RANK 二者表達，且已建議，RANKL/RANK系統(tǒng)可無對增殖或死亡感受性的效應(yīng)地調(diào)控上皮腫瘤的骨轉(zhuǎn)移14。Terpos et al.，Bloodl02 (3) (2003): 1064-1069 描述了用于多發(fā)性骨髓瘤，導(dǎo)致骨損傷及干擾骨髓中血細胞產(chǎn)生的癌的 發(fā)展的預(yù)后的標記物。Hashimoto et al., Cancer&Chemotherapy7 (31) (2004): 1027-1033 (摘要)提及，反映破骨細胞和成骨細胞活性的骨代謝標記物(包括可溶性RANKL和0PG)提供骨疾病的嚴重性和預(yù)后的信息。 W02005/060627A2涉及通過測量RANKL水平來測定非-創(chuàng)傷性骨斷裂的風(fēng)險的方法。在該方法中使用的工具是例如針對RANK或RANKL的抗體。W000/43553A1公開了通過測定雌激素-相關(guān)的標記物水平來就乳腺癌篩選女性的方法。在此方法中測定的標記物是自乳腺導(dǎo)管流體獲得的芳香酶，芳香酶活性，雌激素合成的副產(chǎn)物和在雌激素合成的上游作用的蛋白效應(yīng)子。Beleut et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of Americal07 (7) (2010): 2989-2994 提供了導(dǎo)致乳腺增殖的機理的調(diào)查。主要是，黃體酮驅(qū)動乳腺上皮細胞的增殖。Leibbrandt et al., European Journal of Clinical Investigation 39(10)(2009):842-850是成骨細胞和破骨細胞上RANK，RANKL和OPG的功能的綜述。Reid et al., Molecular Cancer8 (49) (2009): 1-10 公開了 OPG產(chǎn)生由內(nèi)皮細胞刺激。Bo-Ying et al., Annals of Surgical 0ncologyl7 (6) (2010): 1675-1681 描述了涉及增加的前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移的TNFRSF11B基因中特定多態(tài)性的鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的目標在于提供鑒定癌的診斷方法和手段。本發(fā)明涉及癌中RANKL的特定作用，其為診斷及預(yù)測癌和癌發(fā)展的使用。根據(jù)第I方面，本發(fā)明提供檢測癌或預(yù)測發(fā)展癌的患者或測定患癌患者中癌的進展速度的方法，包括測定所述患者樣品中的RANKL活性和/或OPG濃度。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，RANK/RANKL通路相關(guān)于癌發(fā)展，和可用于檢測癌及預(yù)測癌發(fā)作。發(fā)現(xiàn)RANKL負責(zé)保護細胞免于致癌突變，由于其在由DNA損傷誘導(dǎo)的該突變之后預(yù)防細胞死亡。盡管轉(zhuǎn)化突變，細胞存活是癌細胞的一種關(guān)鍵性質(zhì)。此活性中RANKL的新發(fā)現(xiàn)的作用允許RANKL活性和/或OPG濃度與癌發(fā)展關(guān)聯(lián)。由此，可估計患者具有或發(fā)展癌的似然性。本發(fā)明也涉及通過測定受試者樣品中的RANKL活性或OPG濃度來鑒定或預(yù)測受試者發(fā)展癌細胞的風(fēng)險的方法。根據(jù)本發(fā)明“預(yù)測”應(yīng)不以絕對意義，即以可以100%確定度預(yù)測患者會明確地發(fā)展癌的含義解釋，但本發(fā)明涉及估計患者發(fā)展癌的風(fēng)險。類似地，“檢測乳腺癌”也不要求可通過測定RANKL活性鑒定全部癌患者，但患者可具有高的具有癌的變化。因此，測定RANKL活性可首先導(dǎo)致鑒定癌，可能之后是更侵襲性測試。本發(fā)明基于結(jié)果，RANKL活性-以及其天然的配體OPG的濃度-可與癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，由此，在優(yōu)選的實施方式中，可根據(jù)發(fā)明的方法包括該關(guān)聯(lián)。其例如可能關(guān)聯(lián)陰性對照的數(shù)據(jù)(例如發(fā)展或不發(fā)展癌的患者的數(shù)據(jù))和/或陽性對照(發(fā)展癌的患者的數(shù)據(jù))數(shù)據(jù)，及將該陰性或陽性對照數(shù)據(jù)與患者樣品的RANKL活性比較。此外，為了改善診斷力，監(jiān)測RANKL活性，即例如以至少或至多例如I周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，I個月，2個月，3個月，4個月，5個月，6個月，7個月，8個月，9個月，10個月，11個月或12個月或更多的特定間隔測量不同時間點的患者樣品中的RANKL活性是可能的。在2個或更多時間點的RANKL活性的變化可指示癌發(fā)展。在特定實施方式中，其優(yōu)選在月經(jīng)周期中相同的時間監(jiān)測RANKL活性值，由于RANKL活性可被雌性性激素影響。例如，優(yōu)選的是，在排卵之后固定的量的天測量樣品的R·ANKL活性。在優(yōu)選的實施方式中，癌是依賴于生長用激素的癌。該激素可為性激素，諸如雌性性激素如黃體酮或雌激素。癌細胞可具有激素受體，尤其黃體酮受體或雌激素受體。雌激素受體的例是ESRl (包含ERa鏈)，ESR2 (包含ER-β鏈)或，諸如混合的ER-a和ER-β鏈的雜聚體受體。該受體的存在可指示細胞中激素信號傳導(dǎo)的需求。尤其是，此信號傳導(dǎo)可為RANKL-介導(dǎo)的。RANKL由激素的活化保護癌或癌前細胞免于DNA損傷誘導(dǎo)的細胞死亡。由此這些激素可經(jīng)增加的RANKL活性支持癌，其可因此用于診斷或預(yù)測本發(fā)明的癌。根據(jù)本發(fā)明診斷的優(yōu)選的類型的癌是在發(fā)展，尤其乳腺癌或前列腺癌期間具有性激素依賴性的癌。其他類型的癌包括霍奇金氏淋巴瘤；非-霍奇金氏淋巴瘤；B細胞急性成淋巴細胞白血病/淋巴瘤；T-細胞急性成淋巴細胞白血病/淋巴瘤；外周T-細胞白血病，成年T-細胞白血病/T-細胞淋巴瘤；ΝΚ細胞腫瘤；大粒狀淋巴細胞白血?。焕筛駹枬h斯細胞組織細胞增多癥；骨髓樣瘤形成；急性髓性白血??；急性前髓細胞性白血?。患毙运鑶魏思毎园籽?；急性單核細胞性白血病；骨髓增生異常綜合征；及慢性骨髓增生病癥。在尤其優(yōu)選的實施方式中，癌是選自肺癌，乳腺癌，乳腺癌，黑色素瘤，肉瘤，前列腺癌，頭頸癌，未知的原發(fā)性來源的癌，淋巴瘤，白血病，腎癌，及胃腸癌。根據(jù)本發(fā)明癌可為原發(fā)性癌。如在本文顯示，甚至達臨床癌表現(xiàn)之前2年，可診斷癌性發(fā)展，由此癌可通過測定RANKL活性來預(yù)測。因此，原發(fā)性癌可診斷或預(yù)測。此外，診斷或預(yù)測復(fù)發(fā)癌的發(fā)展也是可能的。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)RANKL水平在達發(fā)展癌之前2年特殊地不同于陰性對照。例如發(fā)現(xiàn)血清中的RANKL水平在可例如由常規(guī)活組織檢查診斷的臨床顯現(xiàn)癌發(fā)作之前12 24個月顯著地增加。意外地，RANKL血清水平在顯現(xiàn)癌之前5 12個月降低。由與在特定時間發(fā)展癌的患者之前取的樣品的陽性對照數(shù)據(jù)比較，關(guān)聯(lián)樣品數(shù)據(jù)及預(yù)測未來癌發(fā)展是可能的，且甚至直到癌的臨床癥狀的時間可由常規(guī)手段，諸如由活組織檢查檢測。RANKL是調(diào)控樹突細胞及破骨細胞的功能的細胞表面受體RANK的知道的配體。根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)癌發(fā)展中的進一步機理。RANKL驅(qū)動激素影響的癌發(fā)展。該激素可在任何個體中具有正常激素背景或可已人工施用(諸如在激素替代治療中，在絕經(jīng)期治療中或作為避孕藥)。此外，已研究及表征癌中此配體的細胞機理和活性。RANKL效應(yīng)，“RANKL活性”，包括RANKL與RANK結(jié)合和其得到到活化。RANK顧名思義還活化IKK α，Ικβα ,P-NF κ B和eyeIinDI或活化Id2_p21，MAPK Erk和p38通路。此通路由于RANKL的任何上調(diào)可用作發(fā)明的診斷方法的指示。同樣修飾任何這些因子的活性可用于在本文進一步所述的治療性方法。因此，此通路的任何成員的任何上調(diào)或活化可用來估計“RANKL活性”。多數(shù)這些蛋白是細胞內(nèi)的，且通過使用細胞樣品評價它們的濃度是可能的。替代性地或除了估計蛋白濃度之外，例如通過測定細胞，尤其是乳腺組織細胞中的mRNA濃度來測定這些蛋白的表達是可能的。因此本發(fā)明包括通過測定RANK，IKK-a，IkB_ α，P-NF-κ-B，CyclinDl(Id2-p21,MAPK Erk或p38)中的任何一種的信號傳導(dǎo)來測定RANKL活性。任何這些因子的信號傳導(dǎo)和活化可例如通過檢測和/或定量活化的RANK，IKK- α，IkB- α，P-NF- κ -B和/或CyclinDl或Id2-p21，MAPK Erk和/或p38的量來測量。活化的形式的這些蛋白可例如通過測定這些蛋白的磷酸化的形式或通過測定蛋白聚集物來測定。陰性或陽性對照的比較總是可輔助鑒定一種或更多這些蛋白的增加的活化。但是，就可接近性原因，優(yōu)選測定患者的血或血清樣品中的RANKL濃度。RANK不是RANKL的唯一受體。骨保護素(OPG)是可減少RANKL活性(RANKL與RANK結(jié)合和其經(jīng)IKK α，I K B α，P-NF κ B和cyclinDl的信號傳導(dǎo)通路)的分泌的誘餌受體。此夕卜，RANKL上調(diào)OPG表達和可導(dǎo)致增加的OPG濃度，尤其是在血或血清樣品中。OPG可通過與其結(jié)合減少游離的RANKL的濃度。在本發(fā)明的一些實施方式中，RANKL濃度可以其游離的，可溶性形式測定。在其他實施方式中，總RANKL濃度(除了 OPG結(jié)合的RANKL之外的游離的RANKL)可為癌的指示。盡管，RANKL活性是乳腺癌發(fā)展的成因，RANKL濃度的上調(diào)進而也可上調(diào)其可發(fā)揮診斷或預(yù)測癌的診斷標記物的作用的調(diào)控配體0PG。因此，為診斷目的，術(shù)語“測定RANKL活性”包括確定RANKL信號傳導(dǎo)通路中或任何RANKL濃度中的任何上調(diào)。無論在哪提及RANKL活性，代之以或之外使用OPG濃度也任選地是可能的。在尤其優(yōu)選的實施方式中，將OPG和RANKL的組合用作發(fā)明的預(yù)測或診斷的標記物，尤其可使用樣品中RANKL隨OPG量之間的比。導(dǎo)致降低的游離的可溶性RANKL的增加的OPG濃度最可能是可已在癌發(fā)展中起始了第I步驟的增加的RANKL濃度的之前期的結(jié)果(無增加的OPG緩沖效應(yīng))。因此，與在癌發(fā)作的不同階段期間不同RANKL濃度的發(fā)現(xiàn)一致，導(dǎo)致臨床癌的發(fā)展，OPG是癌發(fā)展的類 似倒轉(zhuǎn)標記物。因此本發(fā)明涉及OPG作為癌的診斷或預(yù)后的診斷標記物的用途。
在優(yōu)選的實施方式中，增加的RANKL活性或RANKL血清濃度用于估計癌會在12 24個月之內(nèi)發(fā)展(最可能)。降低的血清RANKL濃度可用于預(yù)測癌在5 12個月之內(nèi)發(fā)作，優(yōu)選與陰性對照比較檢測增加和減小二者。優(yōu)選將RANKL的減小及OPG的增加用作發(fā)明的診斷或預(yù)測/預(yù)后的指示。在優(yōu)選的實施方式中，比較性陽性對照用于估計直到癌會最可能發(fā)展的時間。陰性和陽性對照值可用于關(guān)聯(lián)分析，優(yōu)選之后是測定統(tǒng)計學(xué)意義的統(tǒng)計學(xué)分析，例如使用Student氏T-檢驗比較組。RANKL活性優(yōu)選通過測定樣品中RANKL和/或RANK的量來測定。盡管，可分析RANKL/RANK級聯(lián)之內(nèi)的任何信號傳導(dǎo)因子，以預(yù)測乳腺癌發(fā)展的發(fā)作，優(yōu)選測定RANKL和/或RANK本身的量。通常RANKL或RANK的量指稱樣品體積中的濃度或替代性地作為樣品中量/細胞。尤其在RANKL的情況中，優(yōu)選測定尤其血或血清樣品中的溶質(zhì)RANKL濃度。細胞樣品優(yōu)選包含可診斷或指示進一步癌發(fā)展的組織的患者的細胞。優(yōu)選細胞包括乳腺細胞。可由本領(lǐng)域知道的方法，尤其是通過結(jié)合配體及檢測該結(jié)合事件來估計RANKL, RANK或RANKL信號傳導(dǎo)通路的任何其他成員的濃度量。優(yōu)選的配體是針對RANKL或RANK或信號傳導(dǎo)通路的任何細胞蛋白的抗體?？?RANKL-抗體是可商購的，例如地舒單抗，及公開于US2008/107597。為了測定細胞內(nèi)蛋白，破壞細胞-膜或均質(zhì)化細胞樣品或使用細胞內(nèi)標記物是通常必需的。優(yōu)選結(jié)合事件通過使用標記物，尤其熒光標記物檢測。在進一步實施方式中，通過優(yōu)選RANKL單獨或一種或更多這些因子的組合測定RANKL mRNA水平或RANKL信號傳導(dǎo)通路中的任何因子，包括RANK，IKK α，I κ B α，P-NF κ B和cyclinDl的mRNA水平的濃度來估計RANKL活性是可能的。任何這些因子和尤其是RANKL的增加的表達是作為發(fā)展癌的成因的增加的RANKL活性的直接指示，由此可用于診斷或預(yù)測癌。 此外，RANKL活性可與癌，尤其激素-驅(qū)動的癌如乳腺或前列腺癌的進展和擴展相關(guān)。癌可具有上皮來源。優(yōu)選該關(guān)聯(lián)相比發(fā)展以特定速度進展的癌的患者的陽性對照樣品制造。患者優(yōu)選是哺乳動物，尤其優(yōu)選的是靈長類動物，甚至更優(yōu)選人，尤其是雌性?；颊呖删哂谢蚩梢丫哂杏么菩孕约に氐闹委?。黃體酮和尤其是其合成衍生物(孕酮)用于絕經(jīng)后女性中組合的激素替代治療(HRT)，起初為降低發(fā)展雌激素-驅(qū)動的子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險，及為改善絕經(jīng)癥狀。乙酸甲羥孕酮(MPA)是在激素避孕藥中最常和最久使用的孕酮及通常用于HRT。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，癌發(fā)展中的RANKL活性受性激素，包括雌性性激素如雌激素或黃體酮，尤其是由黃體酮或其衍生物(孕酮)影響。因此，在優(yōu)選的實施方式中，患者由激素治療，優(yōu)選接收激素替代治療，優(yōu)選用黃體酮或孕酮，或用激素避孕藥接收激素替代治療。孕酮的例是甲羥孕酮(或其乙酸鹽，例如17-乙酸鹽)，炔諾酮，炔孕酮，異炔諾酮，乙酸炔諾酮，二乙酸炔諾醇，左炔諾孕酮，炔諾孕酮，去氧孕烯，孕二烯酮，諾孕酯，屈螺酮，地諾孕素，nesteron,乙酸諾美孕酮，曲美孕酮，他那羅吉，乙酸甲地孕酮，妊娠素，依托孕烯。激素或衍生物優(yōu)選具有孕酮性效應(yīng)。天然的激素水平可足以在細胞中誘導(dǎo)癌性突變的癌性RANKL保護。激素也可在受試者中人工增加。在激素替代治療中或通過使用激素避孕藥，一般是性激素的激素水平上調(diào)，導(dǎo)致增加的黃體酮水平，其可根據(jù)本發(fā)明與經(jīng)RANKL通路的癌的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。因此，接收激素或激素避孕藥或已由激素或激素避孕藥治療的患者處于增加的發(fā)展癌的風(fēng)險。對于這些患者，測定上述RANKL活性特別是癌，癌發(fā)展或癌進展的預(yù)測。尤其是發(fā)現(xiàn)，通過包括測定月經(jīng)周期的激素或雌性性激素或其功能衍生物(諸如孕酮)和優(yōu)選將此數(shù)據(jù)包括進與RANKL活性值在一起的關(guān)聯(lián)中，尤其是相比陰性和/或陽性對照，可改善發(fā)明的癌的診斷，預(yù)測或癌的進展的預(yù)測的預(yù)測值。此外，或作為替代，測定樣品中RANKL配體的濃度也是可能的。此通過包括與配體可能結(jié)合的RANKL的信息來允許游離的血清RANKL濃度的測定的修正。優(yōu)選的RANKL的配體是RANKL的血清配體，諸如0PG。因此，在還優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法包括確定患者樣品中月經(jīng)周期的激素或其功能衍生物或RANKL配體的血清濃度。RANKL配體可為被RANKL濃度體內(nèi)調(diào)控的RANKL調(diào)控蛋白，諸如OPG。該激素的一例是黃體酮和黃體酮衍生物的例是孕酮，諸如乙酸甲羥孕酮(MPA)。尤其是高孕酮或黃體酮水平(例如血清濃度>0.3ng/ml)和RANKL活性可與癌發(fā)展相關(guān)。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供通過估計RANKL活性和黃體酮的值(和/或孕酮水平)二者，尤其其血清濃度來測定發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險?；蛘撸虼送?，本發(fā)明也包括確定所述患者樣品中，優(yōu)選血清樣品中骨保護素(OPG)的量。骨保護素是可減少游離的血清RANKL濃度的分泌的天然的RANKL配體。此外，OPG可響應(yīng)血清中增加的RANKL濃度而上調(diào)，由此OPG是癌，或發(fā)展癌的風(fēng)險的替代性的或另外的指示物。尤其是，為發(fā)明的癌的診斷或預(yù)測，優(yōu)選測定RANKL活性和OPG的濃度，及相比陰性和/或陽性對照關(guān)聯(lián)樣品的濃度和活性。為該關(guān)聯(lián)，可使用任何添加，減少或骨保護素和RANKL之間的比。在優(yōu)選的實施方式中(新-發(fā)作)癌通過測定骨保護素與RANKL的比來診斷或預(yù)測。意外地，通過使用骨保護素的血清濃度和游離的可溶性RANKL的血清濃度，該比在血清數(shù)據(jù)中達到非常高的統(tǒng)計學(xué)意義。游離的可溶性RANKL是根據(jù)本發(fā)明測定的RANKL的優(yōu)選的物質(zhì)。檢測RANKL的手段包括結(jié)合配體，尤其抗-RANKL抗體，其特異于RANKL。適合的抗體公開于US2008/107597及可商購，例如抗體地舒單抗?！?RANKL-抗體〃包括任何功能相當(dāng)體和其衍生物，包括抗體片段諸如Fab,F(ab)2,Fv或單鏈抗體(scAb)。特異性結(jié)合RANKL活性關(guān)聯(lián)的蛋白和因子，尤其RANKL和RANK和RANKL信號傳導(dǎo)通路中的任何蛋白的抗體也包括在本發(fā)明中?？贵w可通過用全長蛋白，蛋白的可溶性形式，或其片段免疫來產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體可為多克隆或單克隆，或可為重組抗體，諸如嵌合抗體，其中輕和重鏈上的鼠恒定區(qū)被人序列取代，或CDR-移植的抗體，其中僅互補測定區(qū)具有鼠來源。本發(fā)明的抗體也可為，例如，由能產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物的免疫制備的人抗體(W093/12227)?？贵w對于檢測生物學(xué)樣品中的RANKL有用，由此允許產(chǎn)生蛋白的細胞或組織的鑒定。本發(fā)明也提供用于檢測RANKL，RANKL配體諸如0PG，和/或雌性性激素，尤其黃體酮，孕酮和雌激素的試劑盒。試劑盒可包含添加劑，檢測劑，洗滌溶液和/或具有各種pH值和離子強度的緩沖劑(Tris,乙酸鹽或磷 酸鹽緩沖劑),增溶劑諸如吐溫或聚山梨酯,載體諸如人血清白蛋白或明膠，防腐劑諸如硫柳汞或芐基醇，及抗氧化劑諸如抗壞血酸或偏亞硫酸氫鈉。特定試劑盒組成的選擇會依賴于許多因素，包括使用的樣品。
試劑盒可包含RANKL的檢測劑，及生理學(xué)RANKL配體和/或孕酮的檢測劑。優(yōu)選的組合具有RANKL和生理學(xué)RANKL配體的檢測劑；或RANKL和雌性性激素的檢測劑?！z測劑"是指檢測和/或定量樣品中的特定分析物的劑。生理學(xué)RANKL配體可為0PG。激素可為孕酮，尤其黃體酮。RANKL檢測劑可為RANKL結(jié)合配體，包括合成配體和小分子。優(yōu)選RANKL結(jié)合配體是抗-RANKL-抗體。RANKL結(jié)合配體可，諸如由熒光或放射性同位素標記。此試劑盒可用于以上詳細描述的測定，預(yù)測或預(yù)后癌，癌發(fā)展或鑒定癌細胞的本發(fā)明的方法。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明定義如下:1.檢測乳腺癌或預(yù)測發(fā)展乳腺癌的患者或測定患乳腺癌的患者中乳腺癌的進展速度的方法，包括測定所述患者樣品中的RANKL活性。2.根據(jù)定義I的方法，其特征在于RANKL活性通過測定樣品中RANKL和/或RANK的量來測定。3.根據(jù)定義I或2的方法，其特征在于RANKL活性通過測定下列之任何一種的信號傳導(dǎo)來測定:RANK，IKK-α，IkB-α，P-NF-κ -B, CyclinDl。4.定義1，2或3的方法，其特征在于樣品包括患者細胞。5.定義3的方法，其中細胞包括乳腺細胞。6.根據(jù)定義4或5的方法，其特征在于細胞包括激素受體，所述激素受體選自:黃體酮受體，雌激素受體，優(yōu)選選自ESRl, ESR2或異源二聚體受體。7.定義I或2的方法，其特征在于RANKL在所述患者的血清樣品中測定。8.定義I 7之任一項的方法，其特征在于癌是乳腺癌。9.定義I 7之任一項的方法，其特征在于癌是前列腺癌。10.定義I 9之任一項的方法，其特征在于患者由激素治療。11.定義10的方法,其中患者由激素治療替代治療或用激素避孕藥治療。12.定義10或11的方法，其中激素是黃體酮或孕酮。13.定義I 12之任一項的方法，還包括確定患者樣品中月經(jīng)周期的激素或其功能衍生物或RANKL配體的血清濃度。14.定義13的方法，其中RANKL配體是被RANKL濃度體內(nèi)調(diào)控的RANKL配體或RANKL調(diào)控蛋白。15.定義13的方法，包括測定樣品中的黃體酮和/或孕酮水平。16.定義13 15的方法，其中發(fā)展乳腺癌或診斷癌的風(fēng)險由至少RANKL活性值和黃體酮和/或孕酮水平二者估計。17.定義13或16的方法，包括測定所述患者樣品中骨保護素的量。18.定義13 17的方法，其中樣品是血清樣品。19.定義12 18的方法，其特征在于新-發(fā)作乳腺癌通過測定骨保護素與RANKL的比來診斷或預(yù)測。20.試劑盒，其包含RANKL的檢測劑，及生理學(xué)RANKL配體和/或孕酮的檢測劑。21.根據(jù)定義20的試劑盒，包含RANKL和雌 性性激素的檢測劑。22.根據(jù)定義20或21的試劑盒，其中RANKL配體是0PG。
23.根據(jù)定義20的試劑盒，包含RANKL和雌性性激素的檢測劑。24.根據(jù)定義23的試劑盒，其中激素是黃體酮。25.根據(jù)定義20 24之任一項的試劑盒，其中RANKL檢測劑是RANKL結(jié)合配體。26.根據(jù)定義25的試劑盒，其中RANKL結(jié)合配體是抗-RANKL-抗體。27.根據(jù)定義25或26的試劑盒，其中RANKL結(jié)合配體被標記。本發(fā)明還由以下圖和例例證，不限于該特定例。

圖1.黃體酮-衍生MPA經(jīng)RANK引發(fā)體內(nèi)RANKL表達和乳腺上皮細胞增殖。a,在安慰劑處理和MPA移植之后3天對照同窩仔和RANK".雌性的乳腺中的上皮增殖。增殖通過原位Ki67免疫染色測定。b，c，對照中MPA-處理的乳腺中干細胞-富集的⑶24+CD49high群(MaSC)的顯著的增加，但ΚΑΝΚΔ_乳腺中則不是。b，顯示來自MPA-或假-處理的8周齡處女雌性的乳腺MaSC的系陰性(⑶31—(內(nèi)皮細胞)⑶45—(造血細胞)TER199_ (紅細胞系細胞))的⑶24和⑶49表達的代表性的FACS譜。C，自MPA-或假-處理的處女RANf和同窩對照雌性的乳腺的MaSC-富集的⑶24+⑶49high群的定量。對于全部 MaSC 實驗，小鼠用 MPA 處理 3 天.n=4/ 組 +/-sem。*Ρ〈0.05 ;***Ρ〈0.001 (Student 氏 t檢驗)。圖2.RANK控制孕酮-驅(qū)動的乳腺癌的發(fā)生率和發(fā)作。a，MPA/DMBA致癌方案。給未生育過的，6周齡雌性小鼠皮下移植MPA粒及如指示用DMBA 經(jīng)口 治療 8 周。b，用 MPA 粒和 DMBA 處理的 MMTV-Crerankflraiet^Λ 雌性(ΚΑΝΚΛ.)(η=14)和齡-匹配的同窩對照雌性(η=19)中可觸及的乳腺腫瘤的發(fā)作，如顯示于圖2a。數(shù)據(jù)顯不為在最后DMBA攻擊之后無腫瘤 的小鼠的百分率。對照的中位腫瘤發(fā)作在最后DMBA治療之后是11天和對于RANK"_雌性是30天。C，在最后DMBA治療之后22天自對照同窩仔和RANK".雌性分離的乳腺腫瘤的代表性的組織切片。顯示細胞角蛋白5染色。放大X20。d, e，在最終DMBA治療之后第7天(d)及第22天(e)對照和RANK"_雌性中癌原位和侵襲性乳腺癌的數(shù)。數(shù)據(jù)顯示為平均值/小鼠+/-sem。n=3小鼠/基因型。對于各小鼠分析全部10個乳腺。*P〈0.05(Student氏t檢驗)。下圖顯示在對照雌性中典型侵襲性腺癌的代表性的組織切片。對于RANK"_雌性，顯示正常腺泡形態(tài)(第7天)和癌原位(第22天)。顯示H&E染色的切片及對于增殖標記物Ki67的免疫染色。放大X 20。圖3.RANK誘導(dǎo)NF κ B信號傳導(dǎo)，不依賴于固著地生長及保護免于輻射-誘導(dǎo)的上皮凋亡。a，響應(yīng)RANKL刺激(I μ g/ml)在分離的原發(fā)性小鼠乳腺上皮細胞(MEC )中磷酸化的(P) IKK α，總IKK α，磷酸化的(P) p65NF κ B,總p65NF κ B,磷酸化的(P) I κ B α，及總ΙκΒα的蛋白印跡。β-肌動蛋白顯示為裝載對照。b，對在對照，狀爾"_和IKKa "_雌性中發(fā)展的合并的晚期階段乳腺癌(對于各泳道n=4)中IKK a，IKK β , IKK Y ,磷酸化的(P) 65即1^8，總？65即1^8，磷酸化的(？)11^80，及總Ik Ba的蛋白印跡。β-肌動蛋白顯示為裝載對照C，在對照，RANK"mam和IKK α Δ.雌性中發(fā)展的晚期階段乳腺癌中RANK，CyclinDl和p21mRNA的表達。表達通過qRT-PCR測定。數(shù)據(jù)是平均值+/_sem。n=4/組。d，測定軟-瓊脂集落形成。響應(yīng)用RANKL (I μ g/ml)或EGF (100ng/ml)刺激的軟瓊脂中人SKBR3乳腺癌細胞的生長。在含RANKL的培養(yǎng)中18天之后形成的不依賴于固著地，大集落，其由誘餌受體OPG (I μ g/ml)防止。對照是未刺激的SKBR3細胞。e，用MPA粒和DMBA治療的ΙΚΚα Δω (η=10)和齡匹配的同窩對照(η=11)雌性中可觸及的乳腺腫瘤的發(fā)作。數(shù)據(jù)顯示為在最后DMBA攻擊之后無腫瘤的小鼠的百分率。對照的中位腫瘤發(fā)作是在最后DMBA治療之后10天，對于IKK α Δ_雌性是在最后DMBA治療之后24天。f，g Y -輻射(5Gray)在假操作的或移植MPA粒的對照和RANK".雌性同窩仔中誘導(dǎo)乳腺上皮細胞凋亡。凋亡通過對有活性的胱天蛋白酶3的免疫染色來檢測。f，對代表性的乳腺切片顯示上皮細胞的凋亡性核(箭標)。放大X40。g，乳腺上皮凋亡的定量。對各小鼠計數(shù)最少5000個核。結(jié)果顯示的是平均值 +/-sem。n=3 小鼠 / 組。*Ρ〈0.05 ;**Ρ〈0.02 (Student 氏 t 檢驗)。圖4.RANK控制癌干細胞自我更新及人乳腺癌患者中的RANKL/0PG血清水平。a,自與在e中相同的同群的血清樣品中sRANKL和黃體酮的分析。然而，血清黃體酮和RANKL之間無關(guān)聯(lián)可見于對照組(p=0.43)，在血清采樣后12 24個月發(fā)展乳腺癌的女性中sRANKL和血清黃體酮水平之間有清楚的關(guān)聯(lián)。p=0.047 (Spearman排序測試)。在血清測試之后6 12個月之內(nèi)發(fā)展乳腺癌的女性中血清黃體酮和RANKL水平無關(guān)聯(lián)(p=0.76)。數(shù)據(jù)顯示為血清黃體酮的函數(shù)(低〈0.2ng/ml;中等0.2 0.3ng/mL;高>0.3ng/mL)。b，自在她們的隨訪期間未發(fā)展乳腺癌的182個健康絕經(jīng)后女性和在她們的血清收集之后5 12個月發(fā)展ER陽性乳腺癌的41個健康齡-匹配的女性預(yù)期地收集的UKCT0CS血清樣品中的OPG-sRANKL比的分析。在血清采樣之后第I年之內(nèi)發(fā)展乳腺癌的女性中框標繪圖顯不顯著地更高 的OPG-sRANKL比。ρ=0.022 (Mann Whitney U測試)。c,自182個健康絕經(jīng)后女性和在她們的血清收集之后12 24個月發(fā)展ER陽性乳腺癌的57個健康齡-匹配的女性的UKCT0CS血清樣品中OPG-sRANKL比的分析。觀察到無顯著差異。圖5.與K5_Cre小鼠交配的RANKflM雌性在懷孕中顯示缺陷小葉-肺泡發(fā)育。a，相比對照同窩仔的乳腺，與K5_Cre交配的未生育過的及泌乳(LI) RANKflM雌性的乳腺組織的全包埋分析。自小葉-肺泡結(jié)構(gòu)的孕育野生型雌性(箭標)中的肺泡，然而此發(fā)育在K5-Cre RANKflM雌性中的發(fā)育不全的肺泡芽(箭標)中被阻攔。b，源于RANKfiwΛ和RANKfl°xM ；K5-Cre+雌性的純化的乳腺上皮細胞的DNA印跡。在將基因組DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夾于兩個1x P位置之間RANK等位基因(fI/+; 9.6kb)和刪除的RANK等位基因(Λ ;3.9kb)。c，在第I天的哺乳(LI)顯示正常小葉-肺泡結(jié)構(gòu)的自對照BALBc nude (nu/nu)雌性的乳腺，用野生型乳腺組織移植的“清除的”nu/nu小鼠中在LI的正常小葉-肺泡結(jié)構(gòu)，及在用RANKflM ；K5-Cre乳腺組織移植的“清除的”nu/nu小鼠中在LI的缺陷小葉-肺泡發(fā)育的全包埋分析。也顯示在手術(shù)清除之后nu/nu小鼠的脂肪墊。全部放大率X5。圖6.懷孕的MMTV-Cre，RANKfl7 Δ雌性中泌乳乳腺的正常形成。a,未生育過的同窩對照和RANKflM ;顯示正常肺泡/管上皮結(jié)構(gòu)的MMTV-Cre雌性的乳腺組織的H&E分析。放大XlO (頂部)和X40 (下圖)。b，相比對照同窩仔的乳腺，與MMTV-Cre交配的未生育過的及泌乳(LI)RANKflM雌性的乳腺組織的全包埋分析。MMTV-Cre介導(dǎo)的RANK缺失未影響泌乳乳腺的形成。C，源于RANKfl°xM和RANKfiwΔ ;MMTV_Cre雌性的純化的乳腺上皮細胞的DNA印跡。在將基因組DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夾于兩個1xP位置之間RANK等位基因(fI/+; 9.6kb)和刪除的RANK等位基因(Λ ； 3.9kb)。RANKflox7Δ ；MMTV-Cre 動物此后表示為 RANf。圖7.MPA在乳腺中誘導(dǎo)RANKL表達和上皮增殖。a-c，在安慰劑處理和MPA移植之后3天對照同窩仔和RANf雌性的乳腺中上皮增殖的定量，如顯示于圖1d。a，數(shù)據(jù)顯示為相比假-操作的相應(yīng)基因型的雌性的總Ki67+上皮細胞的相對變化。計數(shù)至少1000個乳腺上皮細胞/小鼠。n=3小鼠/基因型。**P〈0.005 ；***Ρ〈0.001 (Student氏t檢驗)。b，在MPA皮下移植之后第3天自對照同窩仔和RANf雌性的乳腺的原位Ki67免疫染色的細胞/腺泡的定量。然而，在對照雌性中， 80%的腺泡顯示中到高增殖跡象，RANKΛ_雌性中多于60%的腺泡呈現(xiàn)非常低的增殖速度。C，為控制動情期-依賴性背景增殖水平，分析超排卵的及假操作的對照同窩仔和RANK".雌性。計數(shù)至少1000個細胞/乳腺。n=3/基因型。在b及c中，數(shù)據(jù)顯示為具有低(〈20%的上皮細胞是Ki67+)，中(20 80%的上皮細胞是Ki67+)和高(>80%的上皮細胞是Ki67+)數(shù)的增殖細胞+/-sem的腺泡/管的百分率。***P〈0.001 ;*P〈0.03 (Student氏t檢驗)。d，在腹膜內(nèi)注射PBS或RANKL (I μ g)之后I天對照同窩仔和RANK"mam雌性的乳腺中的上皮增殖。原位Ki67免疫染色測定增殖。放大X 40。e，腹膜內(nèi)注射PBS或RANKL (Iyg)之后I天上皮增殖的定量。顯示Ki67陽性細胞+/-sem的平均百分率。*P〈0.03 ；n=5(Student氏t檢驗)。圖8.RANf小鼠中孕酮-驅(qū)動的乳腺癌的存活曲線。a, b，MPA誘 導(dǎo)乳腺上皮細胞中RANKL表達。將未生育過的野生型雌性用DMBA或油媒質(zhì)的口腔強飼治療，用慢-釋放MPA粒皮下移植，或用假手術(shù)治療。a，在移植/ 口腔強飼之后3天由qRT-PCR在純化的乳腺上皮細胞中測定RANKL mRNA。數(shù)據(jù)顯示為相比安慰劑處理+/-sem的倍數(shù)變化。n=3小鼠/組。b，在用油媒質(zhì)，DMBA，MPA或假手術(shù)治療之后3天由蛋白印跡在自純化的乳腺上皮細胞的細胞裂解物上檢定可溶性(s) RANKL蛋白(19kDa)的表達。肌動蛋白顯示為裝載對照。注意到，僅MPA但不DMBA或油媒質(zhì)單獨誘導(dǎo)RANKLmRNA和蛋白表達。C，在用MPA粒和DMBA治療的RANf (n=14)和有MMTV-Cre (Cre+對照；n=l3)或無MMTV-Cre (Cre-對照；n=9)的齡-匹配的同窩對照雌性中可觸及的乳腺腫瘤的發(fā)作，如顯示于圖2a。數(shù)據(jù)顯示為在最后DMBA攻擊之后無腫瘤的小鼠的百分率。Cre+和Cre-對照組之間發(fā)現(xiàn)無顯著差異。在最后DMBA治療之后，對于Cre+對照的中位腫瘤發(fā)作是9天，對于Cre-對照是11天，及對于ΚΑΝΚΔ_雌性是30天。d，源于RANKfl°x/+ ；MMTV-Cre+和RANKfl°xM ；MMTV-Cre+ (RANK^am)雌性的MPA/DMBA-誘導(dǎo)的乳腺腫瘤的代表性的DNA印跡。在將基因組DNA用PvuII和SphI消化之后指示野生型或夾于兩個1x P位置之間RANK等位基因(fl/+;9.6kb)和刪除的RANK等位基因(Λ ;3.9kb)。源于RANK"_雌性的全部腫瘤顯示幾乎完全缺失。e，對在用MPA/DMBA治療之后RANK"_ (n=9)和齡-匹配的同窩對照雌性(n=9)的總體存活的Kaplan Mayer分析。在最后DMBA治療之后，對于對照，中位存活是48天；和對于RANK".雌性，中位存活是93天。圖9.RANf雌性中鱗狀腺癌的發(fā)展。a, b，在最后DMBA治療之后7 (a)及21 (b)天自對照同窩仔和RANK"_雌性分離的乳腺腫瘤的代表性的組織切片。顯示H&E和E-鈣粘素染色，指示來自對照同窩仔和RANK".雌性的腫瘤的管腺癌的典型特征。細胞角蛋白14 (K14)表達展示對照和RANK".雌性二者中基底細胞來源。但是，RANK"_雌性趨向于顯示鱗狀化生的特征。全部放大率X20。
圖10.在Mx-CreRANKfl°xedM和NeuTRANf小鼠中的乳腺癌發(fā)作。
a,用 MPA 粒和 DMBA 治療的 Mx-Crerankflra￡edM (n=4)和齡匹配的 Mx_Crerank+M 同窩對照雌性(n=6)中可觸及的乳腺腫瘤的發(fā)作，如顯示于圖2a。Mx-驅(qū)動的Cre重組酶由8天的4聚1:C腹膜內(nèi)注射(200ml PBS中的200 μ g)活化。數(shù)據(jù)顯示為在最后DMBA攻擊之后無腫瘤的小鼠的百分率。未發(fā)現(xiàn)顯著差異。b，非-刪除的RANKflraied等位基因(fl/+)及在在Mx_Crerankfl°xedM小鼠中誘導(dǎo)缺失(Δ )之后的DNA印跡。c,在在Mx-Crerankfl°xedM小鼠中誘導(dǎo)缺失(Λ )之后各種器官的DNA印跡。而各缺失程度(50 100%)可見于胸腺，心臟，肝和脾臟，在純化的乳腺上皮細胞(MEC)中未誘導(dǎo)RANKflt5xed等位基因的缺失。圖11.MEC中的RANKL/RANK下游信號傳導(dǎo)。a,遺傳確認的控制在懷孕期間泌乳乳腺的RANKL-RANK介導(dǎo)的形成的信號傳導(dǎo)通路的示意輪廓。b，對響應(yīng)RANKL刺激(I μ g/ml)的分離的原代小鼠乳腺上皮細胞中磷酸化的(P)AKT，總 AKT，磷酸化的(P)ERKl/2，總 ERK1/2，磷酸化的(P)p38_MAPK，及 p38_MAPK 的蛋白印跡。數(shù)據(jù)是4個實驗的代表。圖12.MPA 經(jīng) RANKL/RANK 活化 NF κ B 通路及引發(fā) CyclinDl 表達。a,由MPA的NF κ B通路和CyclinDl表達的活化。給未生育過的ΚΑΝΚΔ_和同窩對照雌性皮下移植慢-釋放MPA?；蛴眉偈中g(shù)處理。a，檢測在MPA處理之后3天RANK".和同窩對照雌性的乳腺上皮細胞中磷酸化的(P)I κ Ba的原位免疫染色。b，在MPA處理之后3天來自RANK-301和同窩對照雌性的分離的乳腺上皮細胞中CyclinDl和RANKL的蛋白印跡分析。為分子大小比較顯示重組體，鼠sRANKL蛋白。β-肌動蛋白顯示為裝載對照。圖13.RANKL/RANK下游信號傳導(dǎo)通路。a，對響應(yīng)RANKL刺激(I μ g/ml)的人SKBR3乳腺癌細胞中磷酸化的(P)p65NF κ B，總p65NF κ B,磷酸化的(P) I κ B α，總I κ B α，磷酸化的(P) ERK1/2，總ERKI/2,磷酸化的(Ρ)ρ38-ΜΑΡΚ，及ρ38-ΜΑΡΚ的蛋白印跡。數(shù)據(jù)是3個實驗的代表。b，在正常生長培養(yǎng)基(對照，補充10%FCS的DMEM)中或在RANKL (I μ g/ml)的存在下培養(yǎng)的SKBR3乳腺癌細胞的生長曲線。通過經(jīng)3天計數(shù)活細胞(錐蟲藍-排除)測定細胞數(shù)。C，用MPA粒和DMBA治療的NFATcl"mam (n=10)和齡匹配的同窩對照(n=16)雌性中可觸及的乳腺腫瘤的發(fā)作。數(shù)據(jù)顯示為在最后DMBA攻擊之后無腫瘤的小鼠的百分率。未發(fā)現(xiàn)顯著差異。d，自NFATcl".和同窩對照雌性的純化的乳腺上皮細胞(MEC)和MPA-驅(qū)動的乳腺腫瘤中NFATclmRNA表達的定量。mRNA通過qRT-PCR測定。數(shù)據(jù)顯示為相比對照的倍數(shù)變化(+/-sem)。n=5/組。*Ρ〈0.05 (Student 氏 t 檢驗)。圖14.RANKL保護原發(fā)性鼠乳腺上皮細胞和人SKBR3乳腺癌細胞免于響應(yīng)Y -輻
射凋亡。a，對在RANKL刺激的存在(I μ g/ml)或缺失下，響應(yīng)Y -輻射(2Gray)的分離的原發(fā)性小鼠乳腺上皮細胞中￥取4乂，磷酸化的(？)0^1，總Chkl，p53和β-肌動蛋白的蛋白印跡分析。b，C，在RANKL的缺失或存在(I μ g/ml)下Y -輻射(2Gray)之后，碘化丙錠(PI)染色的b，乳腺上皮細胞和c，SKBR3人乳腺癌細胞的FACS分析。數(shù)據(jù)是至少3個實驗的代表。在亞-Gl區(qū)呈現(xiàn)DNA含量<2n的凋亡細胞。在指示的時間點給出亞_G1 (M1)，G1_期(M2)，S/G2/M-期(M3)中的細胞以及DNA含量Mn的多倍體細胞的百分率。圖15.RANKL保護原發(fā)性鼠乳腺上皮細胞和人SKBR3乳腺癌細胞免于響應(yīng)多柔比星的凋亡。a, b,與遺傳毒性劑多柔比星(Dox, I μ Μ)，在RANKL的存在(I μ g/ml)或缺失下溫育的a，乳腺上皮細胞和b，SKBR3人乳腺癌細胞的FACS分析。數(shù)據(jù)是至少3個實驗的代表。在多柔比星治療之后24和36小時給出亞-Gl (Ml), Gl-期(M2)，S/G2/M-期(M3)中的細胞以及DNA含量Mn的多倍體細胞的百分率。C，在RANKL刺激的存在(I μ g/ml)或缺失下Y -輻射(2Gray)之后6小時促-凋亡性基因Bim，Puma和Noxa的mRNA表達。數(shù)據(jù)顯示為相比對照的倍數(shù)變化(+/-sem)。n=3。*P〈0.05 ;**P〈0.005 (Student 氏 t 檢驗)。圖16.1KKa介導(dǎo)免于輻射-誘導(dǎo)的上皮凋亡的MPA-誘導(dǎo)的保護。a, b，在IKKa Δ_雌性中響應(yīng)Y-輻射的乳腺上皮細胞凋亡的減少的誘導(dǎo)。對同窩對照和IKKa Λ_雌性假操作或移植MPA粒和Y-照射(5Gray)。在Y -輻射之前3天移植MPA粒。在輻射之后24小時，通過有活性的胱天蛋白酶3的免疫染色檢測凋亡。a，對于代表性的乳腺切片，顯示上皮細胞的凋亡性核(箭標)。放大X40。b，乳腺上皮凋亡的定量。對于各小鼠計數(shù)最少5000個核。結(jié)果顯示的是平均值+/-sem。n=3小鼠/組。*P〈0.05(Student 氏 t 檢驗)。圖17.在血清采樣之后5 12個月之內(nèi)，而非12 24個月之內(nèi)發(fā)展乳腺癌的女性的RANKL/0PG比變化。a,自在她們的隨訪期間未發(fā)展乳腺癌的182個健康絕經(jīng)后女性和在她們的血清收集之后5 12個月發(fā)展ER陽性乳腺癌的41個健康齡-匹配的女性，自UKCTOCS (UKCollaborative Trial of Ovarian Cancer Screening)的預(yù)期地收集的血清樣品中個體RANKL和OPG水平的分析。由活組織檢查診斷乳腺癌的發(fā)展。這些女性中無人在樣品收集時間處于激素替代治療。顯示OPG和sRANKL水平以及OPG-sRANKL比的框標繪圖。相比未發(fā)展乳腺癌的女性，在血清測試之后第I年之內(nèi)發(fā)展乳腺癌的女性具有顯著地更高OPG水平(P=0.041;Mann Whitney U 測試)以及顯著地增加的 OPG-sRANKL 比(ρ=0.022;MannWhitney U測試)。b，自UKCT0CS，自在她們的隨訪期間未發(fā)展乳腺癌的182個健康絕經(jīng)后女性和在她們的血清收集之后12 24個月發(fā)展ER陽性乳腺癌的57個健康齡-匹配的女性的預(yù)期地收集的血清樣品中個體RANKL和OPG水平的分析。顯示OPG和sRANKL水平以及OPG-sRANKL比的框標繪圖。無顯著差異(Mann Whitney U測試)?？驑死L圖指示中位比水平和四分位數(shù)間范圍。圖18.蛋白印跡的定量。在至少3個獨立蛋白印跡/實驗實施光密度測定法。對于蛋白印跡，數(shù)據(jù)顯示于圖lb，圖lc，圖3a和圖3b。將指示的蛋白的表達值對β_肌動蛋白裝載對照標準化。對于磷酸化的定量，數(shù)據(jù)標準化到相應(yīng)總蛋白條帶。*Ρ〈0.05 ;**Ρ〈0.001 (Student氏t檢驗)。實施例實施例1:小鼠已最近產(chǎn)生Rankflrared小鼠、簡言之，為產(chǎn)生攜帶Rank的無效等位基因(rank"等位基因)的小鼠，將rankflMred小鼠與β-肌動蛋白-Cre普遍存在的刪除者小鼠交配。在產(chǎn)生MMTV-CrerankΔ/ 1°Μ<1小鼠之前，將攜帶rankfl°xed或rank"等位基因的小鼠以及MMTV-Cre小鼠與BALBc背景回交7次。MMTV-NeuT小鼠由Guido FornijMilan友情提供。MMTV-Cre (stock#003553)和 Mx-Cre 小鼠(stock#003556)從 Jackson 實驗室得到。K5-Cre，IKK a floxed 和NFATclflraied小鼠已之前描述2_4。小鼠基因型通過PCR和DNA印跡分析測定。在全部實驗中，僅使用自相同的繁殖的同窩仔小鼠。全部小鼠根據(jù)學(xué)院指南飼養(yǎng)及維持。腫瘤和Cre效應(yīng)中RANK缺失。在ΚΑΝΚδ_雌性中發(fā)展的腫瘤的DNA印跡顯示RANK缺失，盡管觀察到一些殘留的野生型條帶(圖8c)，其可解釋為其他細胞類型和/或逃脫者細胞的存在。未觀察到Cre-陰性對照雌性和表達MMTV-Cre轉(zhuǎn)基因的同窩仔中腫瘤發(fā)作的差異，指示Cre表達本身不改變MPA/DMBA乳腺腫瘤模型中的腫瘤發(fā)生率(圖8d)。實施例2:MPA/DMBA-誘導(dǎo)的乳腺致癌如描述實施MPA/DMBA治療5，6。簡言之，將6周齡雌性小鼠用氯胺酮-賽拉嗪麻醉，和在右側(cè)皮下手術(shù)移植慢-釋放MedroxyprogesteroneAcetat (MPA)粒(50mg, 90天釋放；Innovative Research of America)。由口腔強飼施用6次貫穿隨后8周200 μ IDMBA (5mg/ml，棉籽油中稀釋的)，如顯示于圖2a。通過觸診測定乳腺腫瘤的發(fā)作。未觀察到Cre-陰性對照雌性和表達MMTV-Cre轉(zhuǎn)基因的同窩仔中腫瘤發(fā)作的差異，指示Cre表達本身不在MPA/DMBA乳腺腫瘤模型中改變腫瘤發(fā)生率。實施例3:乳腺組織移植物為移植研究，如所述從未生育過的3周齡供體分離乳腺上皮組織，及移植到3周齡宿主nu/nu小鼠的清除的乳腺脂肪墊(內(nèi)源性上皮缺乏)7。在手術(shù)之后3周，使宿主交配及分離乳腺組織用于分析。實施例4:組織 學(xué)，全包埋和免疫組織化學(xué)為組織分析，切下5 μ m切片，及用蘇木素和伊紅(H&E)染色。如所述實施乳腺的全包埋染色8。為免疫過氧化物酶染色，將石蠟-嵌入的切片脫水，及通過使用IOmM檸檬酸鹽緩沖劑或微波照射暴露抗原性表位。將切片與針對細胞角蛋白5，細胞角蛋白14，E-鈣粘素，抗-Ki67 (Novocastra)和抗-有活性的胱天蛋白酶3 (細胞信號傳導(dǎo))的抗體溫育，及通過使用綴合了過氧化物酶的第二抗體可視化。將組織形態(tài)測定指標(增殖和凋亡)計算為陽性上皮細胞除以上皮細胞總數(shù)的數(shù)，對于Ki67染色，每切片計數(shù)的不少于1000個核；及對于有活性的胱天蛋白酶3染色，每切片計數(shù)的不少于5000個細胞。實施例5:蛋白印跡不處理人上皮乳腺腫瘤細胞系SKBR3和原發(fā)性非-轉(zhuǎn)化的小鼠乳腺上皮細胞，或用重組鼠RANKIZrf刺激9。從對照和突變小鼠分離腺癌，和制備總蛋白裂解物。使用標準流程實施蛋白印跡。簡言之，將印跡用在IxTBS0.1%吐溫-20 (TBST)中的5%BSA中阻斷I小時，及與第一抗體于4°C溫育過夜(在TBST中根據(jù)生產(chǎn)流程稀釋)。使用與小鼠RANKL(AF462;R&D)，細胞周期蛋白 Dl (Santa Cruz#Sc-8396), β -肌動蛋白(Sigma)，磷酸化的(P)NFk B (#3033)，NF-κ B (#4767)，磷酸化的(P) I κ B α (#2859), Ικβα (#4814)，磷酸化的(P) ΙΚΚα (#2681)，ΙΚΚα (#2678), ΙΚΚβ (#2678), IKKy (#2685)，磷酸化的(P)Akt (#3787), Akt (#9272)，磷酸化的(P) Erkl/2 (#9101), Erkl/2 (#9102)和 p38_MAPK(#9212),p53 (#2524)，磷酸化的(P)Chkl (#2348), Chkl (#2345)(全部自細胞信號傳導(dǎo))，P38-MAPK (AF869;R&D)，及 Y H2Ax (Serl39#07_164Millipore)具有反應(yīng)性的第一抗體。將印跡在TBST中洗滌30分鐘3次，與綴合了 HRP的第2抗體(1:2000, Promega)于室溫溫育I小時，在TBST中洗滌30分鐘3次，及通過使用ECL可視化。實施例6:qRT-PCR
腫瘤的總RNA通過使用RNeasy Mini Kit(Qiagen),根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明制備。使總RNA (2yg)經(jīng)歷定量(q) RT-PCR分析。使用以下引物:β-肌動蛋白正向引物:5’ -GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG-3’ ；β -肌動蛋白反向引物:5 ’ -CCTGAACCCTAAGGCCAACCG-3 ’。RANKL 正向引物:5 ’ -CTGAGGCCCAGCCATTTG-3 ’RANKL 反向引物:5 ’ -GTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCTTG-3 ’RANK 正向引物:5 ’ -CTTGGACACCTGGAATGAAG-3 ’RANK 反向引物:5，-CAGCACTCGCAGTCTGAGTT-3 ’CyclinDl 正向引物:5’ -CTGTGCGCCCTCCGTATCTTA-3’CyclinD l 反向引物:5’ -GGCGGCCAGGTTCCACTTGAG-3’p21 (Cdknla)正向引物:5，-GTGGCCTTGTCGCTGTCTT-3，p21 (Cdknla)反向引物:5，-GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG-3’tRANKL 正向引物:5 ’ -GCGCCGGGCCAGCCGAGACTAC-3 ’RANKLl 正向引物:5，-GTCCCACACGAGGGTCCGCTGC-3 ’RANKL2 正向引物:5，-TGCGCACTCCGGCGTCCCG-3 ’RANKL3 正向引物:5，-CCGAGACTACGGCGGATCCTAACAG-3 ’RANKLcom.反向引物:5’ -TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAGCCCC-3’Puma 正向引物:5 ’ -CCGCCTGATGCCCTCCGCTGTAT-3，Puma 反向引物:5，-CGGGCCCACTCCTCCTCCTCCAC-3 ’Noxa 正向引物:5，-ACTTTGTCTCCAATCCTCCG-3 ’Noxa 反向引物:5，-GTGCACCGGACATAACTGTG-3 ’Bim 正向引物:5’ -GTTGAACTCGTCTCCGATCC-3’Bim 反向引物 5’ -GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3，實施例7=DNA損傷應(yīng)答為測量細胞周期停滯和凋亡，將原發(fā)性小鼠乳腺上皮細胞和SKBR3人乳腺癌細胞以100000個細胞/孔的細胞-密度接種到6-孔板，及允許生長24小時。然后將細胞用多柔比星(ΙμΜ)或Y-輻射(2Gray)在重組RANKL (I μ g/ml)的缺失或存在下處理。細胞周期停滯和死細胞的數(shù)通過使用碘化丙錠染色測定。為了測定體內(nèi)乳腺上皮細胞死亡，將對照和RANK"mam同窩仔雌性用5Gray (Gy)的總劑量進行Y-照射。6小時后，分離乳腺，及就指示凋亡的有活性的胱天蛋白酶3 (細胞信號傳導(dǎo))免疫染色。實施例8:預(yù)期人群研究基于預(yù)期群的UKCT0CS研究的募集細節(jié)見ref1CI。受試者是United KingdomCollaborative Trial of Ovarian Cancer Screening (UKCT0CS),對于卵巢癌的最大多-中心隨機化的控制的試驗中的參與者。試驗在England, Wales和Northern愛爾蘭設(shè)置為 13NHS trust,及由在 UCL 的 Gynecological Cancer Research Centre 配位。年齡是50 74的女性由27參與Primary Care Trusts的齡/性別注冊隨機邀請。接受邀請的女性用關(guān)于試驗的書面及口頭信息提供。在2001和2005之間，隨機分配總202638個年齡是50 74的絕經(jīng)后女性，以就卵巢癌篩選或無篩選。全部女性在募集時提供血樣品，及此外，50640個女性每年給系列血樣品。此試驗注冊為ISRCTN22488978及用ClinicalTrials.gov編號NCT00058032。獲得書面同意，其包括:到她們的醫(yī)療記錄的訪問，和在未來研究中使用她們的數(shù)據(jù)/樣品。各女性在募集時提供樣品，及填寫關(guān)于醫(yī)療和家族歷史的基本問卷調(diào)查。隨訪問卷調(diào)查在募集之后3.5年發(fā)送給參與女性，問在接合試驗之后是否她們發(fā)展任何癌。who在隨訪問卷調(diào)查上自身-報道乳腺癌的女性或由Office of NationalStatistics (ONS)標記為發(fā)展了乳腺癌的女性還通過她們的治療醫(yī)師隨訪。選擇用ER-陽性侵襲性乳腺癌診斷的女性，在募集時不具有HRT治療及具有通過隨機化到試驗的診斷之前至少5 24個月給出的血清樣品用于分析(98例)。乳腺癌病例是齡匹配的，及與無乳腺癌歷史(182對照)及具有在相同的天和臨床收集的她們的血清樣品的女性匹配。將在中心收集的血樣品以2，500rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘,及在Grienger凝膠管中運行過夜,及次日在中心UKCT0CS實驗室處理。血清以500 μ I等分，然后熱密封，編條碼，及在液氮箱中的特定容器中存儲。僅在使用之前解凍樣品。倫理批準由Joint UCL/UCLH Committees on the Ethicsof Human Re-search 提供(REC 參考號:06/Q0505/102)。實施例9:乳腺癌患者使用的UKCT0CS (UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening)同群1(1包含來自在她們的隨訪期間未發(fā)展乳腺癌的182個健康絕經(jīng)后女性和在她們的血清收集之后5 24個月發(fā)展雌激素受體(ER)陽性乳腺癌的98個健康齡-匹配的女性的預(yù)期地收集的血清樣品。在這98個女性中，41個在第I年之內(nèi)發(fā)展乳腺癌，和57個女性在血清樣品收集之后12 24個月發(fā)展乳腺癌。這些女性中無人在樣品收集時間處于激素替代治療。實施例10:黃體酮測定
第I溫育:將30 μ L樣品-在生物素化的單克隆黃體酮-特異性抗體和用釕復(fù)合物標記的黃體酮衍生物的存在下-與達那唑溫育，以釋放黃體酮。自樣品的黃體酮與用于抗體結(jié)合位點的標記的黃體酮衍生物競爭。 第2溫育:在添加鏈霉親和素-包被的微粒之后，復(fù)合物便經(jīng)生物素和鏈霉親和素的相互作用與固相結(jié)合。結(jié)合到固相的標記的黃體酮衍生物的量與樣品的黃體酮含量成反比例。 將反應(yīng)混合物將吸入到測量細胞中，其中微粒磁性地捕獲到電極表面。然后用ProCell移出未結(jié)合的物質(zhì)。施加到電極的電壓然后誘導(dǎo)由光電倍增管測量的化學(xué)發(fā)光發(fā)射。 結(jié)果經(jīng)校準曲線測定，其是由2-點校準和經(jīng)試劑條碼提供的主曲線儀器-特別產(chǎn)生。試劑-工作溶液M鏈霉親和素-包被的微粒(透明封頭)，I瓶，6.5mL:鏈霉親和素-包被的微粒，0.72mg/mL ;防腐劑。Rl抗-黃體酮-Ab-生物素(灰封頭)，I瓶，IOmL:生物素化的單克隆抗-黃體酮抗體(小鼠)0.15mg/L，磷酸鹽緩沖劑25mmol/L，pH7.0 ;防腐劑。R2黃體酮-肽-Ru(bpy)2+(黑封頭)，I瓶，SmL:偶聯(lián)于用釕絡(luò)合物標記的合成肽的黃體酮(植物來源)，10ng/mL ;磷酸鹽緩沖劑25mmol/L, pH7.0 ;防腐劑。實施例11:統(tǒng)計學(xué)全部值在本文作為 平均值sem給出。由Student氏t檢驗進行組之間的比較。對于腫瘤發(fā)作的Kaplan-Meier分析,實施時間等級測試。P0.05被接受為統(tǒng)計學(xué)地顯著。除了 Log RANK測試之外,實施post-hoc power分析(PS Power andSample Size Calculations,在 biostat.me.vanderbilt.edu/PowerSampleSize 的網(wǎng)頁中)，以計算等同腫瘤發(fā)作時間給出的實驗動物數(shù)的正確地拒絕無效假說的概率。對于涉及RANK".動物的研究，無效假說可以0.933的概率(力)拒絕，及對于ΙΚΚα Λ_動物為0.766的概率。與此無效假說的測試關(guān)聯(lián)的I型誤差概率是0.05。人數(shù)據(jù)通過使用配對的t檢驗,Mann Whitney U測試,或Spearman排序測試分析,如所示。實施例12:RANKL/RANK損傷的小鼠為了檢查腫瘤發(fā)生中RANKL/RANK的潛在作用，在乳腺上皮細胞中使用誘導(dǎo)性RANK等位基因的K5-Cre和MMTV-Cre介導(dǎo)的切除刪除RANK (K5_Cre rankfW Δ小鼠和MMTV-Crerankfl°xM小鼠)。兩個小鼠系呈現(xiàn)健康及呈現(xiàn)正常骨結(jié)構(gòu)和淋巴結(jié)形成。如所預(yù)期，K5-Cre rankfloxM小鼠在青春期呈現(xiàn)明顯正常乳腺發(fā)育；但是，這些小鼠在懷孕期間未發(fā)育乳-分泌小葉肺泡結(jié)構(gòu)(圖5a，b)。使用移植實驗，這些效應(yīng)是細胞自主的(圖5c)。在MMTV-Crerankflox7Δ小鼠中，未生育過的雌性中的乳腺發(fā)育和懷孕中乳-分泌小葉肺泡結(jié)構(gòu)的形成呈現(xiàn)正常(圖6a C)。為了排除K5-Cre rankfl°xM小鼠中可以正常生理影響特定細胞群的發(fā)育效應(yīng)的任何問題，因此使用MMTV-Crerankfl°xM小鼠用于全部進一步實驗。這些MMTV-Crerankfl°xM突變小鼠在下文稱為RANf。實施例13:孕酮施用后RANKL活化的機理在野生型群中，MPA (孕酮)處理引發(fā)乳腺上皮細胞的大量增殖。乳腺上皮細胞的MPA-誘導(dǎo)的增殖在RANf雌性中顯著地減少(圖1a;圖7a C)。因此，RANKL腹膜內(nèi)注射到未生育過的雌性引發(fā)乳腺上皮細胞經(jīng)RANK的增殖(圖7d，e)。最近已報道，內(nèi)源性黃體酮在懷孕15及發(fā)情周期1 6期間影響Lin-CD24+CD49fhi干細胞的數(shù)。在兩個研究中，基于體內(nèi)全身Ab阻斷研究和RT-PCR表達牽涉RANKL/RANK系統(tǒng)，但是，不知道是否此是乳腺上皮細胞中RANKL-RANK的直接效應(yīng)而非次要效應(yīng)。因此檢定是否孕酮諸如MPA也可擴展Lin-⑶24+⑶49fhi細胞。MPA處理導(dǎo)致Lin-⑶24+⑶49fhi細胞的2倍擴展。該擴展未在MPA-處理的RANK"_雌性中發(fā)生(圖1b, C)。這些數(shù)據(jù)提供RANKL/RANK系統(tǒng)控制Lin-⑶24+⑶49fhi細胞的擴展的第I個遺傳證明。實施例14:孕酮對對照和RANK/RANKL缺陷小鼠中經(jīng)RANK/RANKL的癌發(fā)展的影響在The Women’s Health Initiative (WHI)和 Million Women Study 中，孕酮的使用已流行病學(xué)地與乳腺癌的發(fā)作和發(fā)生率關(guān)聯(lián)。孕酮-驅(qū)動的乳腺癌可在雌性小鼠中建模，其中在DNA損傷劑二甲基苯[a]蒽(DMBA)的存在下慢釋放MPA粒的移植引發(fā)乳腺癌(圖2a;圖 8a, b)。在對照雌性中，MPA/DMBA治療誘導(dǎo)可觸及的乳腺腫瘤的快速發(fā)作。有趣地，在RANK"mam雌性小鼠中，觀察到MPA/DMBA-誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)作的顯著延遲(圖2b;圖8c，d)。RANK".雌性上延遲的腫瘤發(fā)作也導(dǎo)致顯著地增強的存活(圖Se)。在RANK"_雌性中發(fā)展的腫瘤的DNA印跡確認RANK的有效缺失(圖8c)。在對照和RANK"mam雌性中發(fā)展的全部腫瘤呈現(xiàn)表達E-鈣粘素的細胞角蛋白(CK)5和CK14陽性基底細胞亞型的管腺癌的典型組織病理學(xué)(圖2c，圖9a，b)。但是，RANK".雌性中出現(xiàn)的管腺癌常發(fā)展鱗狀化生的擴展的區(qū)(圖 2c,圖 9a, b)。實施例15:在依賴于RANKL介導(dǎo)的孕酮信號的DNA損傷之后的癌發(fā)作由于RANK"_在乳腺癌中顯示延遲的發(fā)作。接下來分析在DMBA攻擊之后早期階段的乳腺腫瘤的發(fā)生率。MPA再次用來模擬黃體酮背景，以引發(fā)RANKL/RANK信號傳導(dǎo)。在最后DMBA治療之后I周，全部表達RANK的對照雌性已呈現(xiàn)多原位癌和甚至侵襲性乳腺腫瘤。相反，在最后DMBA攻擊之后I周RANK".動物中觀察到非常少癌是原位和絕不任何侵襲性乳腺癌(圖2d)。在最后DMBA攻擊之后3周，癌原位的發(fā)生率在對照和RANK"_雌性之中類似，但侵襲性癌在RANK"_雌性中仍非常稀有(圖2e)。而且，增殖一般在自RANK".雌性的腫瘤中減少(圖2d，e)。多個其他組織，包括肝，心臟，肌肉和造血隔室，但不在乳腺上皮細胞中RANK的缺失，使用Mx-CrerankfWfl°x小鼠未大大延遲MPA/DMBA-誘導(dǎo)的乳腺癌的發(fā)作(圖1Oa C)，提示RANK/RANKL損傷的效應(yīng)在乳腺上皮細胞中是顯性的。實施例16=RANKL信號傳導(dǎo)乳腺上皮細胞中經(jīng)IKKa -NFk B-CyclinDl的RANKL-RANK信號傳導(dǎo)示于圖11a。RANKL刺激的確在原發(fā)性小鼠乳腺上皮細胞(MEC)中導(dǎo)致P65NFk B和I κ Ba磷酸化(圖3a)。此夕卜，MEC的RANKL刺激引發(fā)p38-MAPK和ERK的磷酸化(圖lib)。為了直接顯示是否RANK介導(dǎo)孕酮下游NF K B-CyclinDl體內(nèi)活化，將小鼠用MPA攻擊。3天MPA治療導(dǎo)致磷酸化的I K Ba的核蓄積，指示有活性的NF K B通路，及乳腺上皮細胞中CyclinDl蛋白表達的誘導(dǎo)，二者在1^^1^_雌性中嚴重減少(圖12a, b)。而且，在自對照和RANf雌性分離的MPA/DMBA-誘導(dǎo)的乳腺癌中，我們發(fā)現(xiàn)，NF K B通路的損傷的活化(圖3b)及細胞周期蛋白Dl的下調(diào)的mRNA表達(圖3c)。在這些原發(fā)性腫瘤中，也觀察到p21mRNA的上調(diào)(圖3c)，由Id2通路轉(zhuǎn)錄抑制的基因17。Id2通路是乳腺上皮細胞中RANKL/RANK的第2個遺傳上確認的下游通路17。為了延伸這些發(fā)現(xiàn)到人，檢定人SKBR3乳腺腫瘤細胞。RANKL刺激誘導(dǎo)了 NFk B，P38-MAPK和ERK活化和SKBR3細胞中的增殖(圖13a，b)。為了進一步測試RANKL刺激的效應(yīng)，評定這些細胞以不依賴 于固著的方式生長的能力，其與體內(nèi)致瘤性良好關(guān)聯(lián)18。重要的是，類似于EGFR刺激，觀察到RANKL誘導(dǎo)軟瓊脂中SKBR3細胞的生長(圖3d)，即。RANK信號傳導(dǎo)不僅引發(fā)增殖，而且作為轉(zhuǎn)化劑誘導(dǎo)不依賴于固著地生長。在破骨細胞中，除了 NFk B通路之外，鈣神經(jīng)素-NFATcl信號傳導(dǎo)通路已發(fā)現(xiàn)對于RANKL-RANK介導(dǎo)的骨誘裂發(fā)生必要。NFATcl也可在RANKL-介導(dǎo)的骨誘裂發(fā)生期間由Id2通路調(diào)控。為了評定是否這些關(guān)鍵RANKL-RANK活化通路是也在MPA/DMBA-誘導(dǎo)的乳腺癌中運作，產(chǎn)生 MMTV-CrenfatcIflox7Δ (NFATcl^am)和 MMTV-CreIkk a fWflox (IKK α Δη Μ)小鼠以刪除乳腺上皮細胞中的NFATcl和IKKa。兩種突變小鼠株在檢定的任何器官呈現(xiàn)健康及呈現(xiàn)無明顯的缺陷。當(dāng)用MPA/DMBA攻擊時，IKKa Λ_小鼠呈現(xiàn)乳腺癌的延遲的發(fā)作(圖3e)。在自IKK α Δ_小鼠的腫瘤中，發(fā)現(xiàn)Ι{(Κ β和IKK Y的正常表達，但減少的NF K B活化，如由增加的I K B蛋白水平及降低的P65NFk B磷酸化(圖3b)及NF κ B靶基因細胞周期蛋白Dl的下調(diào)的mRNA表達(圖3c)測定，提示這些腫瘤中NFk B信號傳導(dǎo)的確需要IKKa。如所預(yù)期，Id2通路基因p21未影響自IKKa Δ.小鼠的腫瘤(圖3c)。觀察到對照和NFATclΔη Μ小鼠之間腫瘤發(fā)作中無顯著差異(圖13c，d)，提示下游信號傳導(dǎo)需求在破骨細胞祖先和乳腺上皮細胞中不同。由此，乳腺上皮細胞中IKKa，但不NFATcl的缺失影響乳腺癌的發(fā)作。實施例17:由于DNA損傷的孕酮驅(qū)動的癌發(fā)展
為了分析對DNA損傷諸如細胞周期停滯和凋亡的細胞應(yīng)答中RANKL的作用，將小鼠原發(fā)性乳腺上皮細胞(MEC)和RANKL-響應(yīng)人乳腺癌細胞系SKBR3用DNA損傷劑多柔比星或Y -輻射處理。RANKL處理未改變Y H2AX和p53的誘導(dǎo)或Chkl，功能DNA損傷應(yīng)答的原型標記物的活化(圖14a)。而且，在用Y-輻射(圖14b，c)或多柔比星(圖15a，b)進行DNA損傷之后，RANKL未改變早期細胞周期停滯。意外地，RANKL處理導(dǎo)致顯著保護免于響應(yīng)Y-輻射(圖14b，c)和多柔比星-誘導(dǎo)的DNA損傷(圖15a，b)的細胞死亡。機理上，在RANKL的存在下未發(fā)生促-凋亡性分子Bim, Puma和Noxa的Y -福射-誘導(dǎo)的上調(diào)(圖15c)。已在體內(nèi)顯示，雌性小鼠的Y-輻射導(dǎo)致乳腺上皮細胞凋亡的5倍誘導(dǎo)19。因此，此之前建立的系統(tǒng)用于評定黃體酮-RANKL/RANK軸對Y -輻射-誘導(dǎo)的細胞死亡的效應(yīng)。MPA(孕酮)誘導(dǎo)的RANKL/RANK的確體內(nèi)保護免于乳腺上皮細胞的Y-輻射-誘導(dǎo)的凋亡。乳腺上皮細胞上RANK表達的損失消除MPA對Y -輻射-誘導(dǎo)的細胞死亡的保護性效應(yīng)(圖3f，g)。而且，IKKa通路涉及在Y-輻射之后乳腺上皮的MPA-誘導(dǎo)的保護(圖16a，b)。由此，除了促進細胞周期進展之外，MPA可在DNA損傷之后經(jīng)RANKL/RANK和IKK α信號傳導(dǎo)保護免于細胞死亡。實施例18:作為乳腺癌患者中診斷標記物的RANKL本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示，孕酮可誘導(dǎo)RANKL/RANK，其然后驅(qū)動乳腺癌。為了確認人乳腺癌患者中的這些研究，分析參與預(yù)期UKCTOCS (UK Collaborative Trial of OvarianCancer Screening)研究的女性中的RANKL和黃體酮血清水平(實施例9)。此同群提供了在乳腺癌表現(xiàn)之前研究可溶性RANKL，黃體酮和OPG的血清水平中的變化的獨特機會。驚人地，盡管在對照女性中，黃體酮水平和血清RANKL之間無關(guān)聯(lián)，在血清收集后12 24個月發(fā)展乳腺癌的女性中有統(tǒng)計學(xué)地顯著關(guān)聯(lián)(P=0.047，Spearman排序測試)(圖4a)。實際上,在高孕酮組之內(nèi)的女性之中，血清RANKL在發(fā)展乳腺癌的組中顯著地更高(p=0.01，單尾的Wilcoxon秩和檢驗)(圖4a)。由此，RANKL的高血清水平和高血清黃體酮可用于預(yù)測乳腺癌的未來發(fā)作。在血清采樣之后5 12個月之后發(fā)展乳腺癌的女性中的關(guān)聯(lián)不同。與此相比，此組顯示在sRANKL和OPG的血·清水平中顯著改變，其相關(guān)于發(fā)展乳腺癌的未來似然性(圖4b;圖17a)。用OPG無該改變見于絕不發(fā)展乳腺癌或在血清采樣之后12 24個月之間發(fā)展乳腺癌的UKCTOCS參與者(圖4c;圖17b)。RANKL/0PG中的這些血清改變呈現(xiàn)為反直觀的。但是，此發(fā)現(xiàn)與之前數(shù)據(jù)一致。例如，已報道在骨關(guān)節(jié)炎患者中，在受影響的骨中的RANKL mRNA水平確實地與骨破壞關(guān)聯(lián)，但與血清RANKL水平相反地關(guān)聯(lián)11。而且，對于血清RANKL水平和骨質(zhì)疏松癥顯示類似現(xiàn)象:低血清RANKL水平相關(guān)于絕經(jīng)后女性中的非-創(chuàng)傷性斷裂的10倍更高風(fēng)險2°。而且，增加的OPG相關(guān)于不處于激素取代治療的絕經(jīng)后女性中增加的骨損失21。乳腺癌中這些血清變化的機理可反映針對發(fā)展微型腫瘤和/或不同身體隔室之內(nèi)RANKL/0PG的再分布/隔離的補償性機理。為了避免診斷或預(yù)后中數(shù)據(jù)的錯整合，優(yōu)選比較樣品數(shù)據(jù)與在陰性(不發(fā)展癌的患者)對照上的陽性(患者和/或發(fā)展的癌的患者)。實施例19:討論基于這些結(jié)果，以下分子情景如何孕酮諸如MPA驅(qū)動乳腺癌是明顯的:黃體酮和孕酮(及可能內(nèi)源性黃體酮系統(tǒng)的去調(diào)節(jié)諸如在絕經(jīng)前期)在乳腺中最前引發(fā)RANKL的誘導(dǎo)。RANKL經(jīng)乳腺上皮細胞上的RANK驅(qū)動這些細胞進入細胞周期及，重要地，保護小鼠以及人乳腺上皮細胞免于響應(yīng)DNA損傷包括Y-輻射的凋亡。而且，RANKL-/RANK控制乳腺癌干細胞的自我更新和不依賴于固著地生長。由此，孕酮-誘導(dǎo)的RANKL/RANK給損傷的乳腺上皮提供生長和存活優(yōu)勢，起始乳腺癌的前提22。這些效應(yīng)是，至少部分，經(jīng)IKK a -NF K B信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)具有一些引起興趣的含義。例如，孕酮已相關(guān)于具有異常乳房X射線照片的增加的風(fēng)險23。由于乳房X射線照片檢測微-鈣化，以及腺密度和RANKL/RANK在骨代謝/礦化中具有關(guān)鍵作用12，13，可推測RANKL/RANK貢獻于該損傷的鈣化和/或腺密度。這是有趣的，因為發(fā)現(xiàn)顯現(xiàn)乳腺癌發(fā)作之前和之后(5 12個月)女性血清中改變的RANKL/OPG比，證明RANKL/0PG血清水平是對于癌的檢測有用的生物標記。在本文數(shù)據(jù)也顯示，增加的RANKL和黃體酮血清水平可在腫瘤診斷之前12 24個月預(yù)測未來乳腺癌。百萬女性在避孕藥中采用黃體酮-衍生物及用于激素替代治療。該激素已與發(fā)展乳腺癌的增加的風(fēng)險流行病學(xué)地關(guān)聯(lián)。參考文獻1.Hanadaj R.et al.Central control of fever and female body temperatureby RANKL/RANK.Nature462, 505-9(2009).
2.Tarutanij M.et al.Tissue-specific knockout of the mouse Pig-a genereveals important roles for GPI—anchored proteins in skin development.ProcNatlAcadSci U S A94,7400-5(1997).
3.Gareusj R.et al.Normal epidermal differentiation but impairedskin—barrier formation upon keratinocyte-restricted IKKl ablation.Nat CellBiol9，461-9(2007).
4.Aliprantisj A.0.et al.NFATclin mice represses osteoprotegerin duringosteoclastogenesis and dissociates systemic osteopenia from inflammation incherubism.J Clin Invest118,3775-89 (2008).
5.Aldazj C.M.，Liao, Q.Y.，LaBatej M.&Johnston，D.A.Medroxyprogesteroneacetate accelerates the development and increases the incidenceof mouse mammary tumors induced by dimethylbenzanthracene.Carcinogenesis17, 2069-72(1996).
6.Caoj Y., Luoj J.L.&Karin, M.1kappaB kinase alpha kinase activity isrequired for self-renewal of ErbB2/Her2_transformed mammary tumor-1nitiatingcells.ProcNatlAcadSci USA104，15852—7(2007).
7.Robinson, G.W.&Hennighausen, L.1nhibins and activins regulate mammaryepithelial cell differentiation through mesenchymal-epitheIial interactions.Developmentl24, 2701-8(1997).
8.Fata, J.E.et a 1.The osteoclast differentiation factorosteoprotegerin-ligand is essential for mammary gland development.Celll03，41-50(2000).
9.Lacey，D.L.et al.0steoprotegerin ligand is a cytokine that regulatesosteoclast differentiation and activation.Cell93, 165-76(1998).
10.Menonj U.et al.Sensitivity and specificity of multimodal andultrasound screening for ovarian cancer, and stage distribution of detectedcancers:results of the prevalence screen of the UK Collaborative Trial ofOvarian Cancer Screening (UKCTOCS).Lancet Oncol10，327-40(2009).
11.Findlay, D.et al.Circulating RANKL is inversely related to RANKL mRNAlevels in bone in osteoarthritic males.Arthritis Res TherlOj R2(2008).
12.Kong, Y.Y.et a 1.0PGL is a key regulator ofosteoclastogenesis,lymphocyte development and lymph-node organogenesis.Nature397, 315-23(1999).
13.Dougallj W.C.et al.RANK is essential for osteoclast and lymph nodedevelopment.Genes Devl3, 2412-24 (1999).
14.Jones, D.H.et al.Regulation of cancer cell migration and bonemetastasis by RANKL.Nature440, 692-6(2006).
15.Asselin-Labatj M.L.et al.Control of mammary stem cell function bysteroid hormone signalling.Nature.
16.Joshij P.A.et al.Progesterone induces adult mammary stem cellexpansion.Nature.
17.Kimj N.S.e t al.Receptor activator of NF-kappaB ligandregulates the proliferation of mammary epithelial cells via Id2.Mol CellBiol26， 1002-13(2006).
18.Freedman, V.H.&Shin, S.1.Cellular tumor i gen i c i ty in nudemice: correlation with cell growth in sem1-solid medium.Cell3, 355-9(1974).
19.Ewan, K.B.et al.Transforming growth factor-betalmediates cellularresponse to DNA damage in situ.Cancer Res62，5627-31 (2002).
20.Schettj G.et al.Soluble RANKL and risk of nontraumatic fracture.JAMA291, 1108-13(2004).
21.Jorgensen, L.et al.Bone loss in relation to serum levels ofosteoprotegerin and nuclear factor-kappaB Iigand: the Tromso Study.0steoporoslnt21, 931—8.
22.Hanahanj D.&Weinberg, R.A.The hallmarks of cancer.CelllOOj57-70(2000).
23.McTiernanj A.et al.Estrogen-plus-progestin use and mammographicdensity in postmenopausal WomemWomeni s Health Initiative randomized trial.JNatl Cancer Inst97，1366-76 (2005).
權(quán)利要求
1.檢測癌或預(yù)測發(fā)展癌的患者或測定患癌患者中癌的進展速度的方法，包括測定所述患者樣品中RANKL活性和/或OPG的量。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于RANKL活性通過測定樣品中RANKL和/或RANK的量來測定。
3.權(quán)利要求I的方法，其特征在于RANKL活性通過測定下列之任何一種的信號傳導(dǎo)來測定RANK，IKK-α，IkB-α，P-NF-κ -B, CyclinDl。
4.權(quán)利要求I 3之任一項的方法，其特征在于樣品包含患者細胞，尤其是乳腺細胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于細胞包含激素受體，所述激素受體選自黃體酮受體，雌激素受體，優(yōu)選選自ESRl, ESR2或異源二聚體受體。
6.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于RANKL在所述患者的血清樣品中測定。
7.權(quán)利要求I 6之任一項的方法，其特征在于癌是乳腺癌或前列腺癌。
8.權(quán)利要求I 7之任一項的方法，其特征在于患者由激素治療，優(yōu)選接收激素替代治療，優(yōu)選用黃體酮或孕酮，或用激素避孕藥接收激素替代治療。
9.權(quán)利要求I 5之任一項的方法，還包括測定患者樣品中月經(jīng)周期的激素或其功能衍生物或RANKL配體，優(yōu)選被RANKL濃度體內(nèi)調(diào)控的RANKL配體或RANKL調(diào)控蛋白的血清濃度。
10.權(quán)利要求9的方法，包括測定樣品中的黃體酮和/或孕酮水平。
11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于由RANKL活性和黃體酮和/或孕酮水平的至少兩個值估計發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險。
12.權(quán)利要求9的方法，包括測定所述患者樣品中，優(yōu)選血清樣品中骨保護素的量，尤其優(yōu)選的是其中新-發(fā)作乳腺癌通過測定骨保護素與RANKL的比來診斷或預(yù)測。
13.試劑盒，其包含RANKL的檢測劑，及生理學(xué)RANKL配體，尤其OPG的檢測劑，和/或孕酮的檢測劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測癌或預(yù)測發(fā)展癌的患者或測定患癌患者中癌的進展速度的方法和手段，包括測定所述患者樣品中RANKL活性和/或OPG的量。
文檔編號G01N33/574GK103238067SQ201180045587
公開日2013年8月7日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月22日
發(fā)明者J·派寧格, D·斯克拉梅克, G·斯徹特, M·維德斯克溫德特, I·J·加科布斯, U·梅諾恩 申請人:分子生物技術(shù)院有限公司