專利名稱：一種基于化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物生態(tài)學(xué)與分析化學(xué)領(lǐng)域，是一種基于兩步化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
昆蟲綱直翅目幢總科動(dòng)物飛幢(Locusta migratoria)是一種廣泛分布于東半球的重大農(nóng)業(yè)害蟲，已知全球有9個(gè)亞種，其中我國(guó)有東亞飛蝗、亞洲飛蝗和西藏飛蝗三個(gè)亞種，是引發(fā)我國(guó)蝗災(zāi)爆發(fā)的罪魁禍?zhǔn)?。飛蝗存在著多型性現(xiàn)象(polymorphism)，在自然界中具有不同的生態(tài)型，即群居型和散居型。兩型之間可以相互轉(zhuǎn)化，這稱之為飛蝗的型變現(xiàn)象?；葹?zāi)爆發(fā)的主要特征就是散居型飛蝗型變?yōu)槿壕有?，以及群居型飛蝗集群的大規(guī)模異地遷飛。研究證實(shí)，飛蝗的型變是由生態(tài)環(huán)境因素與內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用、共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，從而使得兩型飛蝗在形態(tài)、生理、體色與行為等方面都存在著顯著的差異。體液中的代 謝物是機(jī)體基因型、內(nèi)分泌與外部環(huán)境共同作用的產(chǎn)物，是機(jī)體生物功能與狀態(tài)的直接反應(yīng)，兩型飛蝗之間的生物差異必然在血淋巴代謝物上有所體現(xiàn)。因此，建立一種便捷高效的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法，將有助于深入探討飛蝗型變的生物規(guī)律和中國(guó)蝗災(zāi)的爆發(fā)機(jī)制，進(jìn)而有可能為新型生態(tài)友好型生物、化學(xué)農(nóng)藥的開發(fā)提供新的作用靶點(diǎn)。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索得知，目前已知的一種分析蝗蟲血淋巴中內(nèi)源性代謝物的技術(shù)由E. M. Lenz 等人發(fā)明(《Insect biochemistry and molecular biology》雜志 2001 年第 32期51-56頁(yè))，該發(fā)明使用500兆赫茲(MHz)核磁共振技術(shù)對(duì)沙漠蝗4齡期若蟲血淋巴中的代謝物進(jìn)行了檢測(cè)。除此之外，尚未見其他對(duì)飛蝗血淋巴內(nèi)小分子代謝物進(jìn)行代謝指紋分析的報(bào)道。Lenz等人所發(fā)明的技術(shù)，能檢測(cè)到包括氨基酸、碳水化合物和有機(jī)酸等多種類型的代謝物，但該發(fā)明也存在顯而易見的缺陷1)該發(fā)明的技術(shù)核心是500MHz核磁共振儀，造價(jià)與運(yùn)行成本高昂，遠(yuǎn)非一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室所能擁有，滿足不了大多數(shù)生物實(shí)驗(yàn)室的研究需要；2)由于蝗蟲血淋巴中的代謝物組成復(fù)雜，化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，導(dǎo)致該發(fā)明采集到的代謝指紋中存在著嚴(yán)重的譜峰重疊現(xiàn)象，這不單對(duì)代謝物結(jié)構(gòu)解析提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，而且也干擾了峰面積的積分結(jié)果，進(jìn)而影響代謝物相對(duì)含量測(cè)定的準(zhǔn)確度；3)更為關(guān)鍵的是，該技術(shù)獲取的代謝信息有限，只從沙漠蝗血淋巴中解析出了 20余種代謝物，生物信息覆蓋面狹窄，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了從系統(tǒng)生物學(xué)層面上理解飛蝗生理代謝功能的需要。而氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為一種常規(guī)而強(qiáng)大的分析手段，相對(duì)于核磁共振技術(shù)具有以下應(yīng)用優(yōu)勢(shì)1)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的造價(jià)與運(yùn)行費(fèi)用低廉，廣泛易得，其在哺乳動(dòng)物生物體液代謝物分析中的應(yīng)用價(jià)值業(yè)已被廣泛證實(shí)。2)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)集分離與檢測(cè)于一身，對(duì)復(fù)雜體系具有強(qiáng)大的分離和結(jié)構(gòu)解析能力，能大大降低生物譜中的代謝物重疊現(xiàn)象，從而獲得更為準(zhǔn)確的相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果和更為可信的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果。3)相對(duì)于核磁共振技術(shù)而言，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的靈敏度更高，這將有助于檢測(cè)到更多痕量存在的代謝物，提高代謝信息的覆蓋度，從而有助于更為全面地了解飛蝗的代謝狀態(tài)。通過進(jìn)一步的文獻(xiàn)檢索，迄今為止，尚未見基于化學(xué)衍生和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)開展飛蝗血淋巴代謝指紋檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有蝗蟲血淋巴代謝物檢測(cè)技術(shù)的不足，提出了一種基于化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法，以期快速地獲取飛蝗血淋巴內(nèi)小分子代謝物的組成種類與相對(duì)含量信息，進(jìn)而為認(rèn)識(shí)飛蝗型變的生物規(guī)律與中國(guó)蝗災(zāi)的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。本方法便捷高效，反應(yīng)條件溫和，重復(fù)性高，代謝物覆蓋范圍廣，適應(yīng)多中心、大樣本和多批次分析研究的需要。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下一種基于化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法(I)取50 μ L血淋巴，室溫解凍后，使用含有IOOng/μ L香草酸內(nèi)標(biāo)的 乙醇-乙腈混合溶劑(9/1，ν/ν)進(jìn)行代謝物提取，渦旋lmin，超聲2min，4°C下15000g離心15min，吸取120 μ L上清液并減壓干燥5h ;實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理念與多元統(tǒng)計(jì)分析表明該溶劑體系對(duì)于血淋巴代謝物具有最佳的提取效率，所反映的生物學(xué)信息最為完整全面，且重現(xiàn)性良好。(2)取50 μ L鹽酸甲氧胺-吡啶溶液(20mg/mL)加入到前述所得的提取物中，超聲Imin溶解，渦旋混勻，40°C恒溫水浴中肟化衍生90min ;再加入50 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺試劑，渦旋混勻，40°C恒溫水浴中硅烷化衍生60min。先肟化再硅烷化的兩步化學(xué)衍生方法能抑制代謝譜中的多重峰現(xiàn)象，減少代謝譜的復(fù)雜程度，從而有助于代謝物結(jié)構(gòu)鑒定，并保證代謝物定量測(cè)定的準(zhǔn)確度。(3)最后加入20 μ L含有800ng/μ L油酸甲酯的正庚烷溶液補(bǔ)充體積，渦旋混勻后備氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。油酸甲酯作為外標(biāo)能用于監(jiān)控大樣本分析時(shí)的質(zhì)譜靈敏度變化，為開展多中心實(shí)驗(yàn)時(shí)評(píng)價(jià)分析性能的穩(wěn)定性提供數(shù)據(jù)。氣相色譜的分離條件為DB-5MS色譜柱(O. 25μηι,0· 25mmX25m),載氣為氦氣，恒定流量模式操作，流速I. 2mL/min,采用程序升溫程序起始70°C維持3min,5°C /min升至170°C，4°C /min 升至 270°C，10°C /min 升至 300°C并維持 5min，進(jìn)樣體積 I μ L，分流比 30，該色譜分離條件能使血淋巴中復(fù)雜的代謝物間獲得良好的分離。質(zhì)譜檢測(cè)條件為電子轟擊電離源(EI)，電離電壓70eV，離子源溫度250°C，溶劑切割時(shí)間6. 5min,電子倍增管檢測(cè)器電壓為I. 0KV，質(zhì)荷比掃描范圍為33-500m/z，質(zhì)譜掃描速率O. 4s/譜圖(即質(zhì)譜掃描速率為每O. 4s 一張譜圖)。本發(fā)明方法的反應(yīng)條件溫和，能減少對(duì)熱不穩(wěn)定代謝物的潛在破壞。且方法便捷高效，重復(fù)性好，儀器要求低，適合于開展多中心、大樣本分析的需要，能廣泛用于各種蝗蟲的代謝組學(xué)研究工作。


圖I本發(fā)明中確定血淋巴代謝物提取溶劑體系的決策結(jié)果；圖2本發(fā)明實(shí)施例I群居型東亞飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)結(jié)果(總離子流圖)。圖3本發(fā)明實(shí)施例2敲除肉堿-乙酰轉(zhuǎn)移酶carnitine-acetyltransferase的群居型東亞飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)結(jié)果(總離子流圖)。表I本發(fā)明實(shí)施例I中血淋巴代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果及其通路列表。
表2本發(fā)明的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I取4齡期群居型東亞飛蝗，使用微量注射器穿刺前胸背板與腹部銜接處的表皮抽吸體液，4°C下13000g離心IOmin得血淋巴，分析前-80°C貯藏。室溫解凍后，取50 μ L血淋巴置1.5mL Eppendorf管中，加入150 μ L乙醇-乙腈混合溶劑(9/1, ν/ν)沉淀蛋白，劇烈潤(rùn)旋振蕩lmin,超聲提取2min,4°C下15000g離心15min,吸取120 μ L上清提取液至另一 I. 5mL Eppendorf管中，凍干機(jī)中減壓干燥5h。提取物中加入50 μ L鹽酸甲氧胺-批唳溶液(20mg/mL),超聲Imin溶解,潤(rùn)旋混勻,40°C恒溫水浴中廂化反應(yīng)90min ;隨后,加入50 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺試劑，渦旋混勻，40°C恒溫水浴中硅烷化衍生 60min ;反應(yīng)完成后，加入20 μ L含有800ng/l·! L油酸甲酯的正庚烷溶液補(bǔ)充體積，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至玻璃襯管中，進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜分離使用DB-5MS柱(O. 25 μ m，O. 25mmX 25m)，載氣為氦氣，采用恒定流量模式操作，流速I. 2mL/min，進(jìn)樣體積I μ L，分流比30，程序升溫程序?yàn)槠鹗贾鶞?0°C，維持 3min,5°C /min 升溫至 170°C,4°C /min 升溫至 270°C, 10°C /min 升溫至 300°C 并維持5min。使用單四極桿質(zhì)譜進(jìn)行代謝物檢測(cè)，采用電子轟擊電離源，電離電壓70eV，離子源溫度250°C，溶劑切割時(shí)間6. 5min,電子倍增管檢測(cè)器電壓為I. 0KV，質(zhì)荷比掃描范圍為33-500m/z，質(zhì)譜掃描速率O. 4s/譜圖。采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理念(design of experiment)對(duì)乙腈、乙醇、甲醇與丙酮等四種與水互溶有機(jī)溶劑對(duì)血淋巴代謝物的提取效能進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以確定最佳代謝物提取體系。不同溶劑配比與提取效率進(jìn)行PLS分析，結(jié)果如圖IA所示，處于第二象限中乙醇具有較高的提取效率，而處于第三象限以乙腈為主的實(shí)驗(yàn)則效率較低。柱圖顯示乙醇的提取效率顯著高于丙酮、乙腈以及四者的等量混合物(圖1B)，且乙醇的提取重現(xiàn)性要優(yōu)于甲醇。為進(jìn)一步探索溶劑配比與代謝物間的關(guān)聯(lián)性，實(shí)驗(yàn)又對(duì)溶劑配比(X矩陣)與所有XCMS提取到的代謝特征響應(yīng)值(Y矩陣)進(jìn)行了 PLS回歸分析，結(jié)果如圖1C，乙醇與絕大多數(shù)代謝物間呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)聯(lián)，丙酮與大多數(shù)代謝特征間的關(guān)聯(lián)性較弱，而乙腈則與大多數(shù)代謝特征間表現(xiàn)出較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。由此可知，乙醇對(duì)絕大多數(shù)代謝物都具有較高的提取效率。采用等高線圖來(lái)預(yù)測(cè)最佳提取溶劑配比，結(jié)果如圖ID所示，等高線圖三角形左下角處的溶劑配比提取效率高，最終實(shí)驗(yàn)確定使用乙醇/乙腈混合溶劑(體積比9/1)進(jìn)行血淋巴代謝物提取，一方面該溶劑體系對(duì)代謝物的綜合提取效率高，另一方面實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)添加少量乙腈能增加脫蛋白效果，使沉淀更為密實(shí)，從而有助于提取液的吸取。依據(jù)上述方法，群居型東亞飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)結(jié)果，如圖I所示。解卷積處理從中檢識(shí)出了 165個(gè)代謝物，經(jīng)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)，鑒定了其中87個(gè)代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(結(jié)果見表I)，包括27個(gè)氨基酸及其衍生物，4個(gè)三羧酸循環(huán)中間代謝物，20種有機(jī)酸，5個(gè)甾體衍生物，2個(gè)多胺，12個(gè)糖、糖醇及其衍生物，4個(gè)嘌呤類衍生物以及13個(gè)其他類代謝物。這些物質(zhì)涉及東亞飛蝗體內(nèi)能量代謝，糖、氨基酸和脂質(zhì)代謝，核苷酸代謝和神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)代謝等多條通路，具有可觀的代謝信息覆蓋度。相對(duì)于Lenz等人使用的NMR方法，本發(fā)明的技術(shù)大大拓展了對(duì)蝗蟲血淋巴中代謝物的覆蓋范圍，檢測(cè)到的代謝物由20余個(gè)擴(kuò)展至近百個(gè)。而且不同于NMR技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)顯著改善了復(fù)雜代謝譜中的峰重疊現(xiàn)象，從而使得代謝物的定量信息更為準(zhǔn)確。實(shí)施例I中，對(duì)本發(fā)明一種基于化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物檢測(cè)方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣分析5次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)三天進(jìn)樣分析考察日間精密度，室溫條件下同一樣品分別在6、12、18、30和36h進(jìn)樣分析考察樣品穩(wěn)定性；平行操作制備5份樣品考察方法重現(xiàn)性，結(jié)果如表2所示，絕大多數(shù)代謝物相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的日內(nèi)、日間精密度與重現(xiàn)性都符合分析要求，且當(dāng)貯藏于_20°C冰箱中時(shí)，絕大多數(shù)代謝物在衍生反應(yīng)完成后36小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。本發(fā)明重現(xiàn)性與穩(wěn)定性俱佳，便捷易行，代謝物覆蓋范圍廣泛，適應(yīng)于開展多中心、大樣本研究的需要。表I
權(quán)利要求
1.一種基于化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下流程步驟 (1)取血淋巴50-100μ L，加入3-4倍體積的乙醇-乙腈混合溶劑提取代謝物，渦旋振蕩，超聲提取，離心分離上清液并減壓干燥； (2)每Iμ L血淋巴提取液凍干物中加入O. 8-1. 2 μ L鹽酸甲氧胺-吡啶溶液，超聲溶解，渦旋混勻，35-50°C恒溫水浴中肟化衍生60-180min ;再加入與O. 8-12倍吡啶用量體積的N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺試劑，渦旋混勻，35-50°C恒溫水浴中硅烷化衍生45_90min ； (3)加入相當(dāng)于步驟(I)中血淋巴用量體積40-60%的油酸甲酯-正庚烷溶液，混勻后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析，室溫條件下樣品分析需在衍生后24h內(nèi)完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(I)中提取溶劑的用量為血淋巴體積的3倍，溶劑組成為乙醇/乙腈體積比為10/1 4/1，其中溶解75-150ng/y L的香草酸作為定量?jī)?nèi)標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(I)渦旋時(shí)間l-3min，超聲時(shí)間2-4min，吸取上清液120-240 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中加入吡啶溶劑的比例為每I μ L血淋巴提取液使用I. 0-1. 2 μ L體積吡啶,其中溶解15-20mg/mL鹽酸甲氧胺廂化衍生試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中超聲溶解l_3min，40°C水浴中肟化反應(yīng)60-180min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中加入與吡啶溶液等體積的N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺，內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)1%的三甲基氯硅烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中加入相當(dāng)于步驟(I)中血淋巴用量體積40-60%的正庚烷溶液，內(nèi)含800ng/l·! L油酸甲酯，用以監(jiān)控大樣本分析時(shí)的質(zhì)譜信號(hào)穩(wěn)定性。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)中采用的色譜分離條件為DB-5MS色譜柱(O. 25 μ m, O. 25mmX 25m)，載氣為氦氣，恒定流量模式操作，流速I. 2mL/min,采用程序升溫程序，進(jìn)樣體積為I μ L，分流比30。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑶中采用的質(zhì)譜檢測(cè)條件為電子轟擊電離源(EI)，電離電壓70eV，離子源溫度250°C，溶劑切割時(shí)間6. 5min,電子倍增管檢測(cè)器電壓為I. 0KV，質(zhì)荷比掃描范圍為33-500m/z，質(zhì)譜掃描速率O. 4s/譜圖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于化學(xué)衍生的飛蝗血淋巴代謝物的檢測(cè)方法，涉及動(dòng)物生態(tài)學(xué)與分析化學(xué)領(lǐng)域。具體為取血淋巴，加入乙醇-乙腈混合溶劑脫蛋白，超聲提取，高速離心得代謝物提取液；提取液減壓干燥后，加入鹽酸甲氧胺-吡啶溶液，超聲溶解，渦旋混勻，恒溫水浴中肟化衍生；再加入N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺試劑，渦旋混勻，恒溫水浴中硅烷化衍生；最后加入油酸甲酯-正庚烷溶液補(bǔ)充體積，再次渦旋混勻后，備氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。本發(fā)明的檢測(cè)方法便捷高效，反應(yīng)條件溫和，重復(fù)性好，代謝物覆蓋面廣泛，適用于開展多中心、大樣本的分析研究，能為認(rèn)識(shí)各種飛蝗型變的生物規(guī)律與蝗災(zāi)的發(fā)生機(jī)制提供幫助。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102866220SQ20111019105
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者許國(guó)旺, 吳澤明, 趙春霞, 周佳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所